Предварителни констатации за повишени възпалителни плазмени цитокини при деца с аутизъм, които имат коморбидни стомашно-чревни симптоми, част 1

Резюме:

Разстройството от аутистичния спектър (AU) присъства при приблизително 2 процента от населението и често се свързва със съпътстващи заболявания, които могат да повлияят на качеството на живот. Едно от най-честите съпътстващи заболявания при аутизма е наличието на стомашно-чревни (GI) симптоми, състоящи се от нередовни навици на изхождане като запек, диария или редуващи се навици на изхождане.

През последните години, със задълбочаването на изследванията върху разстройството от аутистичния спектър (ASD), все повече хора започват да обръщат внимание на връзката между ASD и имунитета. Въпреки че настоящите резултати от изследванията не са напълно последователни, повечето проучвания показват, че наистина има връзка между ASD и имунитета.

Първо, много деца се раждат с нисък имунитет, което може да увеличи риска от развитие на РАС. Второ, все повече и повече проучвания показват, че има аномалии в имунната система на пациенти с ASD. Например, те могат да имат алергични реакции, автоимунни заболявания и т.н. В допълнение, някои проучвания са установили, че пациентите с ASD имат по-високи нива на оксидативен стрес, което може да доведе до клетъчно увреждане и невродегенерация.

Въпреки това, не трябва да пренебрегваме положителните аспекти на живота с ASD. Хората с ASD може да имат по-силен имунитет. Проучванията показват, че тяхната имунна система може да се справя по-добре с някои бактериални и вирусни инвазии. В допълнение, пациентите с ASD може също да имат повече имунни клетки и имунната им система може да бъде по-стабилна и по-малко склонна към свръхреакции.

Като цяло връзката между ASD и имунитета е сложна, а не просто положителна или отрицателна. Този въпрос трябва да бъде проучен задълбочено чрез по-строги изследвания в бъдеще. Независимо от това, ние всички трябва да сме проактивни по отношение на ASD и да работим с хора с ASD и техните семейства, за да могат по-добре да се адаптират към обществото. От тази гледна точка трябва да подобрим имунитета си. Cistanche може значително да подобри имунитета, тъй като пепелта от месо съдържа различни биологично активни компоненти, като полизахариди, гъби и Huang Li. Тези компоненти могат да стимулират различни клетки на имунната система и да повишат тяхната имунна активност.

Click cistanche tubulosa ползи

Показани са доказателства за имунна инфилтрация и имунна активация в илеума и дебелото черво на деца с AU със симптоми на GI. Освен това, имунната дисфункция е фактор, допринасящ за много стомашно-чревни заболявания и ние предполагаме, че би било по-очевидно при деца с AU, които проявяват стомашно-чревни симптоми, отколкото тези, които не проявяват стомашно-чревни симптоми.

Това предварително проучване имаше за цел да определи дали има променени нива на цитокини в плазмата при деца с AU със симптоми на GI в сравнение с деца с AU без GI симптоми, типично развиващи се (TD) деца с GI симптоми и TD деца без GI симптоми, от същото кохорта, базирана на населението. Плазмените нива на цитокини се оценяват чрез мултиплексни анализи.

Не са наблюдавани разлики в плазмените цитокини при TD контроли със или без GI симптоми; въпреки това много вродени (IL-1, TNF, GM-CSF, IFN) и адаптивни цитокини (IL-4, IL-13, IL-12p70) са повишени в AU деца с GI симптоми в сравнение с деца с AU без GI симптоми. Релевантният за лигавицата цитокин IL-15 е повишен при AU със симптоми на GI в сравнение с всички групи.

Обратно, регулаторният цитокин IL-10 е намален при AU със стомашно-чревни симптоми и може да предполага дисбаланс в провъзпалителни/регулаторни сигнали. Тези данни предполагат, че децата със симптоми на AU и GI имат дисбаланс в техния имунен отговор, който е очевиден в техните циркулиращи плазмени нива на цитокини. Констатация, която може да насочи към потенциални терапевтични и/или стратегии за мониторинг на стомашно-чревни проблеми в AU.

Ключови думи:
аутизъм; ASD; имунна; възпаление; стомашно-чревни; съпътстващи заболявания; цитокини; регулиране; шизофрения; толерантност; вроден имунитет; адаптивен имунитет; мукозен имунитет.

1. Въведение

Разстройствата на неврологичното развитие, като разстройство от аутистичния спектър (AU), бързо нарастват в разпространението си в целия свят. Тяхната етиология е до голяма степен неизвестна, но в повечето случаи вероятно се дължи на комбинация от генетични фактори и фактори на околната среда. Понастоящем диагнозата AU е ограничена до поведенчески черти, включително повтарящи се и стереотипни поведения и увреждания в комуникацията и социалното взаимодействие.

Въпреки това, много индивиди с AU също страдат от едно или повече медицински съпътстващи заболявания, включително стомашно-чревна (GI) дисфункция [1–7]. Стомашно-чревни симптоми при аутизъм са докладвани от 80 години [8], като симптомите на нередовно изхождане като запек и диария са най-често срещаните [9–11].

В нашето голямо кохортно проучване от 1000 участници, децата с AU са били 6-8 пъти по-склонни да страдат от стомашно-чревни симптоми в сравнение с обичайно развиващите се деца на същата възраст; в допълнение, GI симптомите са свързани с по-лоши резултати за оценка на поведението [12].

Въпреки честите съобщения за стомашно-чревна дисфункция в AU, липсва насочване към специализирани клиники или подходящо лечение на стомашно-чревни симптоми. Липсата на проучвания за биологични сигнатури при съпътстващи заболявания на AU също възпрепятства стратегии, които биха могли да помогнат за облекчаване на проблемите с ГИ.
Мукозните имунни клетки съставляват приблизително 70 процента от имунните клетки в тялото и дисфункцията в тези клетки може да има неблагоприятни последици за функцията на GI. Променен мукозен имунитет може да повлияе на епителната бариерна функция на гостоприемника, разнообразието от коменсални бактерии в червата и чревната нервна система [3].

Много доклади описват имунни аномалии в AU, включително промени в имунната генетика, изкривено производство на цитокини, променена функция на Т клетките и засилени вродени имунни отговори [13–16]. Освен това се съобщава за имунна активация при почти две трети от децата с AU и е свързана с по-тежко поведение [13]. Ендоскопските анализи на деца с AU със симптоми на GI разкриха наличието на фино, дифузно възпаление на чревния тракт (прегледано в [1,4]).

Въпреки това точната природа на това възпаление се обсъжда и в момента не е ясна. Доказателствата от хистология, имунохистохимия и поточна цитометрия последователно показват пан-ентерична инфилтрация на имунни клетки като лимфоцити, моноцити, клетки естествени убийци (NK) и еозинофили в стените на стомашно-чревния тракт при деца с AU, в сравнение с типично развиващите се ( TD) деца с GI симптоми [9,17–21].

Тези доклади показват, че при деца с AU и GI симптоми има повишени имунни клетъчни инфилтрати в дебелото черво, илеума, дванадесетопръстника и стомаха. Освен това, инфилтриращите лимфоцити проявяват подчертан провъзпалителен фенотип - с повишени CD3 плюс IL-6 плюс клетки, CD3 плюс TNF плюс клетки и намалени регулаторни CD3 плюс IL-10 плюс клетки при деца с AU и GI симптоми в сравнение с контролите [17,18].

Сравняването на вътреклетъчното производство на цитокини преди и след имунно предизвикателство в периферните Т клетки разкрива подобен профил с повишено производство на провъзпалителни цитокини, но намалена регулация при деца с AU, които са имали GI симптоми в сравнение с контролите [22].

Стимулираните цитокинови отговори, наблюдавани при деца със симптоми на AU и GI, са различни от децата с AU без симптоми на GI, както и от децата от TD контрола и предполагат, че производството на цитокини след имунно предизвикателство може да бъде уникално при деца с AU и GI симптоми.

Имунните профили при деца със симптоми на AU и GI също са различни от децата с установени възпалителни заболявания на червата (IBD), като болест на Crohn, целиакия и улцерозен колит [9,17–19,21]. Подобни находки за повишено производство на провъзпалителни цитокини след стимулация, IL-1, IL-6 и TNF, са показани при деца, които имат AU и чувствителност към храна в сравнение с контролите [23,24].

Търсенето на биологични сигнатури или биомаркери при аутизма досега е било недостатъчно проучена област. Вероятно най-голямата полза от биологичните сигнатури в контекста на AU няма да бъде при определянето на основните симптоми, а при свързаните съпътстващи заболявания. Тези съпътстващи заболявания често имат дълбок ефект върху тежестта на симптомите или свързаните поведения като сън, раздразнителност, агресия или тревожност [3].

Някои плазмени цитокини или имунни медиатори са изследвани за техния потенциал като биомаркери, най-вече в контекста на тежестта на AU [14,25–27]. Липсват плазмени маркери, които биха могли да помогнат за идентифициране или проследяване на траекторията на стомашно-чревните симптоми при AU. В настоящото проучване ние се стремим да характеризираме плазмените цитокинови профили при деца с AU със или без GI симптоми от произволна извадка от популационно базирано проучване случай-контрола.

2. Материали и методи

Това проучване включва 79 участници, които са били включени в проучването CHARGE (Риск от детски аутизъм от генетиката и околната среда), текущо популационно базирано проучване случай-контрол [28]. Накратко, участниците в проучването CHARGE бяха избрани от 2 страти: аутистични разстройства (AU) и контроли на общото население с типично развиващо се развитие (TD).

Допустимите деца са на възраст между 24 и 60 месеца, родени в Калифорния, живеещи с поне един биологичен родител, който говори английски или испански, и пребиваващи в районите на обхват на определен списък от регионални центрове в Калифорния. Децата с AU бяха идентифицирани чрез регионални центрове, доставчици/клиники, самонасочване и общуване с обществеността.

Децата с TD бяха идентифицирани от държавни досиета за раждане и беше генерирана стратифицирана произволна извадка чрез съпоставяне на честотата с прогнозираното разпределение на случаите на AU по възраст, пол и водосборна зона. Деца със сериозни двигателни и сензорни увреждания (напр. слепота и глухота), които биха попречили на валидна оценка на развитието, бяха изключени.

Протоколът от проучването CHARGE беше одобрен от институционалните съвети за преглед на Калифорнийския университет в Дейвис и Комитета на щата Калифорния за защита на човешки субекти. Преди участието беше получено писмено информирано съгласие.

За това проучване 40 случая с AU и 40 TD контроли бяха избрани на случаен принцип от набор от участници в проучването CHARGE, записани между април 2003 г. и април 2008 г., предоставиха кръвна проба, попълниха въпросник за история на GI и имаха потвърдена диагноза AU или TD. Случаите и контролите бяха съпоставени по възраст при вземане на кръв (на интервали от 3- месеца) и дали са имали или не чести стомашно-чревни симптоми на нередовни движения на червата (дефинирани като честа диария или запек през последните 3 месеца).

Първоначалната цел на проучването беше да има 20 случая и 20 контроли с чести стомашно-чревни симптоми, както и 20 случая и 20 контроли без чести стомашно-чревни симптоми. Тъй като по време на проучването само 9 контроли в цялото проучване CHARGE са имали чести стомашно-чревни симптоми, случаите и контролите са съпоставени само по възраст при вземане на кръв.

Крайната извадка от 80 деца се състои от 20 случая (средна възраст 41,7 ± 9,6 месеца; 16 мъже) и 9 контроли (средна възраст 41,6 ± 9,1 месеца; 7 мъже) с чести стомашно-чревни симптоми и 20 случая (средна възраст 41,9 ± 9,3 месеца; 19 мъже) и 31 контроли (средна възраст 42,2 ± 9,3 месеца; 26 мъже) без чести стомашно-чревни симптоми. Тъй като това беше произволна извадка, ние не изключихме въз основа на употребата на лекарства.

Малко деца са приемали лекарства по време на вземането на кръв: те включват антимикробни средства като ацикловир, кетоконазол (2 случая със стомашно-чревни симптоми и 2 случая и 2 контроли без стомашно-чревни симптоми), стероиди като инхалатори за астма, назонекс (2 случая и 1 контрол със стомашно-чревни симптоми и 1 случай и 1 контрола без стомашно-чревни симптоми) и лекарства, свързани със стомашно-чревния тракт, като Miralax, Nexium, магнезиево мляко (2 случая и 3 контроли със стомашно-чревни симптоми).

Никой от участниците не е приемал антипсихотични лекарства. Не открихме никакви лекарствени ефекти върху данните, когато се анализират заедно (лекувани срещу нелекувани, в рамките на групи) или за отделни лекарства.

Диагнозата на аутизма беше потвърдена с помощта на оценки със златен стандарт: Ревизирано диагностично интервю за аутизъм (ADI-R; [29]) и График за диагностично наблюдение на аутизма (ADOS; [30]). Контролите бяха проверени за AU с помощта на Въпросника за социална комуникация (SCQ; [31]) и нито една не надвиши граничната стойност (SCQ По-голямо или равно на 15).
Скалите на Mullen за ранно обучение (MSEL; [32]) и скалите за адаптивно поведение на Vineland (VABS; [33]) бяха приложени към случаи и контроли, за да се определи съответно когнитивното и адаптивното развитие. Типичното развитие при контролите се определя като наличие на съставни резултати от По-големи или равни на 70 и при двете оценки и без предишна диагноза за забавяне на развитието.

Всички клиницисти в Института MIND (Медицинско изследване на разстройства на неврологичното развитие) на UC Davis са постигнали надеждност на изследванията на оценките на развитието, които са прилагали (ADI-R, ADOS, MSEL и VABS). Двуезичен проучвателен персонал беше на разположение за администриране на информирано съгласие и всички инструменти/въпросници на испански.

2.1. Вземане на кръв и анализ на цитокини
Периферна кръв се събира от всеки субект в киселинно-цитратно-декстрозни вакутейнери (BD Biosciences; Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Кръвта се центрофугира при 2100 rpm за 10 минути, след това плазмата се събира и съхранява при -80 ◦C преди анализите на цитокините. Концентрациите на цитокини в плазмата на участниците бяха определени чрез имуноанализ с мултиплексиране на топчета (Millipore, Billerica, MA, USA). Пробите и референтните контроли бяха проведени съгласно протокола на производителя.

Накратко, 25 µL плазмена проба се инкубират с флуоресцентни перли, свързани с антитяло, след това се промиват и инкубират с биотинилирани антитела за откриване, последвани от стрептавидин-фикоеритрин. След това зърната бяха анализирани с помощта на базирана на поток Luminex™ 100 суспензионна масивна система (Bio-Plex 200; BioRad Laboratories, Inc., Херкулес, Калифорния, САЩ). Стандартните криви бяха генерирани от софтуера Bio-plex Manager за определяне на неизвестна концентрация на пробата. Всички проби и референтни цитокини бяха приготвени съгласно препоръката на производителя и нивата на цитокини и хемокини бяха оценени чрез Luminex™ мултиплексен анализ.

Стойностите на пробите се изразяват като pg/mL. Анализираните цитокини/хемокини са интерлевкин (IL){{0}}, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL{ {5}}, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL{{10}} (p4{{48} }), IL-12 (p7{{50}}), IL-13, IL-15, IL-17, стимулиращ колониите на гранулоцити-макрофаги фактор (GM-CSF), фактор, стимулиращ гранулоцитни колонии (G-CSF), интерферон-гама (IFN), IFN- 2, фактор на туморна некроза алфа (TNF), TNF, еотаксин, моноцит хемотаксичен протеин (MCP) )-1, макрофагов възпалителен протеин (MIP)-1 , MIP-1 и 10 kDa интерферон-гама-индуциран протеин (IP-10), минималните граници на откриване за тези цитокини/хемокини са 2,4, 0.3, 1.2, 1.3, 2.2, {{60}}.2, 1.1, 2.4, 0.9, 0.3, 34.9, 0.8, 1.0, 0.8, 0.4, 5.0, 0.9, 0.5, 0.4, 1.5, 0.9, 5., 1.8, 5, 10 ,7 и 3,6 pg/mL, съответно.

Получените концентрации под границата на откриване (LOD) на метода бяха изчислени като половината от границата на откриване (LOD/2) за статистически сравнения. Стойностите, получени от отчитането на проби, които надвишават горната граница на метода за чувствителност, бяха допълнително разредени и съответно изчислени концентрации на цитокини.

Вариациите в нивата на цитокини в рамките на плочата и между плочките/изследване, като се използват представителни проби, проведени на всички плочки, са по-малко от 5 процента. Плазмените аликвоти не са били подложени на предишен цикъл на замразяване/размразяване. Цитокиновият анализатор беше заслепен за случая или контролния статус на всяка проба.

For more information:1950477648nn@gmail.com