Препаративно изолиране и пречистване на четири съединения от Cistanches Deserticola YC Ma чрез високоскоростна противотокова хроматография

1. Въведение

Cistanches deserticolaYC Ma, видцистанчиикойто принадлежи наOrobanchaceaeсемейство, е добре известна традиционна китайска медицина за лечение на бъбречна недостатъчност, женско безплодие, болестна левкорея, неврапраксия и сенилен запек [1]. Това е паразитно растение, което е широко разпространено в северозападния Китай. Досега няколко съединения, включителнофенилетаноидни гликозиди (PhGs), иридоиди и лигнани са изолирани от този вид [2]. Съобщава се, че някои от PhG притежават антиоксидантна, хепатопротективна и невропротективна активност [3–6]. Процедурата за изолиране и пречистване на PhGs обаче е трудна и отнема много време. Освен това, класическите многократни хроматографски методи не само използват голямо количество органични разтворители, но също така дават по-ниско възстановяване на пробата. Високоскоростната противотокова хроматография (HSCCC), техника за разделителна хроматография течност-течност без подложка, предлага отлично възстановяване на пробата в сравнение с някои конвенционални методи и се използва широко за разделяне и пречистване на различни природни продукти [7–9] . Въпреки че няколко PhGs са пречистени отцистанчиирод и други от HSCCC [10–14], нито една статия не съобщава за пречистване на актеозид, изоактеозид, сирингалид A 3'- -L-рамнопиранозид и 2'-ацетилактеозид в една двуфазна система.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

В тази статия ние докладваме прост метод за разделяне и пречистване на четири PhG от C. deserticola. Накрая, 30.9 mg актеозид, 13,0 mg изоактеозид, 12,5 mg сирингалид A 3'- -L-рамнопиранозид и 7,2 mg 2'-ацетилактеозид бяха получени в едноетапно разделяне от 297 mg фракция с чистота съответно 99%, 95%, 99% и 98%. Техните структури бяха характеризирани въз основа на 1H- и 13C-NMR спектрални данни и HR-MS спектри. Структурите на четирите PhGs, идентифицирани в това изследване, са показани на фигура 1.

2. Резултати и дискусия

2.1. HPLC анализ на суровия екстракт

Обогатената фракция на n-бутанол екстракт от C. deserticola се анализира чрез HPLC-UV. Използваната колона беше Accurasil C18 (250 mm × 4.6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, град, съкращение на щата, САЩ), подвижната фаза беше метанол-вода (30:70, v/v). Скоростта на потока беше 1 mL/min. Дължината на вълната на детектора беше зададена на 254 nm. HPLC хроматограмата е показана на фигура 2. Пикове 1 до 4 съответстват съответно на актеозид (1), изоактеозид (2), сирингалид A 3'- -L-рамнопиранозид (3) и 2'-ацетилактеозид (4) .

2.2. Избор на двуфазна разтворителна система

Успешното разделяне чрез HSCCC до голяма степен зависи от избора на подходяща двуфазна система от разтворители, двуфазната система от разтворители е избрана според стойностите на коефициента на разпределение (K) на всеки целеви компонент и оптималният диапазон на K трябва да бъде от {{ 2}}.5 към 2.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА ИМУНИТЕТА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

В експеримента стойностите на K за целевите компоненти на няколко двуфазни системи разтворители са показани в таблица 1 (въпреки че малко по-високи за пик 4, резултатите бяха показани като приемливи). Сред тях етилацетат-n-бутанол-етанол-вода (40:6:6:50, v/v/v/v) дава подходящи коефициенти на разпределение за целевите съединения. В крайна сметка системата от разтворители, съставена от етилацетат–n-бутанол–етанол-вода (40:6:6:50, v/v/v/v) се използва за изолиране и пречистване на четири съединения на C. deserticola, както е показано в Фигура 3. Както е показано на Фигура 2, HPLC анализът на всяка HSCCC фракция разкри, че четири чисти PhGs (актеозид, 99%; изоактеозид, 95%; сирингалид A 3′- -L-рамнопиранозид 99% и 2′- ацетилактеозид 98%) може да се получи от суровата фракция.

3. Експериментален

3.1. Апаратура HSCCC

оборудването, използвано в настоящото изследване, беше TBE{{0}}B високоскоростна противотокова хроматографска система (Shanghai Tauto Biotech Co., Шанхай, Китай) с три препаративни многослойни колони за разделяне, свързани последователно (диаметър от епруветка=2.6 mm, общ обем=300 mL) и 2{{10}} mL примка за проба. Радиусът на въртене или разстоянието между оста на държача и централната ос на центрофугата (R) е 5 cm и стойността варира от 0,5 на вътрешния терминал до 0,8 на външния терминал (= r/R, където r е разстоянието от намотката до вала на държача). Приспособление за циркулация на постоянна температура HX 105 (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Пекин, Китай) беше използвано за контрол на температурата в експеримента. Системата HSCCC беше оборудвана с модел TBP-5002 помпа със средно налягане и постоянен поток, модел TBP-2000 UV детектор, работещ при 254 nm, и модел V4.0 работна станция (Jinda Bio-chemistry Instrument компания, Шанхай, Китай).

Използваното оборудване за високоефективна течна хроматография (HPLC) беше система Agilent 1200, която се състои от бинарна помпа G1312A, автосамплер G1329A, детектор с променлива дължина на вълната G1314A (VWD), термостатирано колонно отделение G1316A, дегазатор G1379B и работна станция Agilent LC . Alltech 3300 ELSD беше използван за откриване на чистотата. Agilent 6520 Q-TOF и Bruker AVANCE III 500-NMR спектрометри бяха използвани за структурна идентификация на съединенията. 'Н и 13C-NMR спектрите (съответно при 500 и 125 MHz) бяха измерени при стайна температура (22 градуса /295.1 К).

3.2. Реактиви и материали

Етилацетатът, n-бутанолът и етанолът са с чистота за анализ, а метанолът е с чистота за HPLC. Всички разтворители са закупени от Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, Китай). Milli-Q вода (18.2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA) се използва за всички разтвори и разреждания. Коренището на C. deserticola беше събрано от провинция Вътрешна Монголия, Китайска народна република, през юни 2009 г. Растението беше идентифицирано от проф. Lijuan Zhang и ваучерен екземпляр (№ 20091001) беше депозиран в нашата лаборатория.

3.3. Приготвяне на сурова проба

Стрити на прах изсушени на въздух месести стъбла на C. deserticola (1 Kg) се загряват два пъти под обратен хладник с воден етанол (8 L, 60% v/v) за 2 h всеки път. Екстрактът се изпарява при понижено налягане и при температура от 60 градуса до пълното изпаряване на етанола. Остатъкът се суспендира във вода и се екстрахира последователно три пъти с хлороформ, етилацетат и n-бутанол, давайки 5.16 g n-бутанол екстракт след изпаряване до сухо при понижено налягане. След това n-бутановият екстракт се разделя на колона със силикагел (200–300 меша), като се използва прогресивно градиентно елуиране (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1), за да се получат осем фракции. Фракция 6 (297 mg) се използва за по-нататъшно изолиране и разделяне на HSCCC.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ТРАДИЦИОННИ КИТАЙСКИ ЛЕКАРСТВА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Избор на двуфазни разтворителни системи

Двуфазните системи на разтворители бяха избрани според коефициента на разпределение (K) на целевите компоненти във фракцията на C. deserticola. Стойностите на K се определят чрез LC анализ, както следва: Подходящо количество суров екстракт на прах (фракция 6) се разтваря в долната фаза на системата от разтворители и се анализира чрез HPLC. Площите на пиковете бяха записани като A1. След това равен обем от горната фаза се добавя към разтвора и се разбърква старателно, за да се постигне равновесие на разпределение. След това долната фаза отново се анализира чрез HPLC. Последните пикови площи бяха записани като A2. K-стойностите бяха изчислени съгласно следното уравнение: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Приготвяне на двуфазна система от разтворители и разтвор на проба

В настоящото изследване двуфазната система от разтворители, съставена от етил ацетат–n-бутанол–етанол-вода (40:6:6:50, v/v/v/v) се използва за разделяне на HSCCC. Всеки разтворител се добавя към делителна фуния и се уравновесява напълно при стайна температура. Горната фаза и долната фаза бяха разделени и дегазирани чрез ултразвук за 30 минути малко преди употреба. Разтворът на пробата се приготвя чрез разтваряне на 297 mg от фракция 6 в 15 mL от долната фаза на етилацетат–n-бутанол–етанол-вода (40:6:6:50, v/v/v/v).

3.6. HSCCC Процедура за разделяне

HSCCC се извършва, както следва. Многослойната навита колона първо се запълва с горната органична неподвижна фаза. След това долната водна подвижна фаза се изпомпва в горния край на колоната при скорост на потока от 1.5 mL/min и в същото време HSCCC апаратът работи при скорост на въртене от 900 rpm. След установяване на хидродинамично равновесие, както е показано от прозрачна подвижна фаза, елуираща се на изхода на опашката (около два часа по-късно), 15 mL разтвор на проба, съдържащ 297 mg от суровия екстракт (фракция 6), се инжектира през инжекционния клапан. Ефлуентът от колоната се наблюдава непрекъснато при 254 nm. Четири пикови фракции се събират съгласно хроматограмата и след това се изпаряват при понижено налягане. Температурата на апарата е настроена на 25 градуса.

3.7. HPLC анализ и идентифициране на HSCCC пикови фракции

Пиковите фракции от HSCCC се анализират чрез HPLC-ELSD. Използваната колона беше Accurasil C18 (250 mm × 4.6 mm, id 5 μm), а подвижната фаза беше метанол-вода (30:70, v/v). Скоростта на потока беше 1 mL/min. ELSD работи при следните условия: температура 45 градуса, газ 1,6 L/min. Структурната идентификация на четирите пикови фракции на HSCCC беше извършена чрез HR-ESI-MS, 1Н и 13C-NMR спектроскопия.

3.8. Структурната идентификация

Фракция I: HR-ESI-MS, наблюдавано при m/z 623.2001 (M−H)−, изчислено за C29H35O15, 623.1981. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 на рамноза), 2,79 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 глюкоза), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34 }} рамноза), 6.27 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7.59 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,1 (6Н, ароматен Н). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116.4 (C-5), 121.3 (C-6), 72.4 (C-), 36.6 (C-), 127.7 (Caf-1), 115.3 (Caf{{89) }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 114.8 (Caf-), 148.1 (Caf-), 104.3 (G-1), 76.1 (Glc-2), 81.7 (Glc-3), 70.5 (Glc-4 ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha-6). В сравнение с данните, дадени в литературата [17], фракция I съответства на актеозид.

Фракция II: HR-ESI-MS, наблюдавано при m/z 623.1987 (M−H)−, изчислено за C29H35O15, 623.1981. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,25 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 на рамноза), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 глюкоза), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 рамноза), 6,28 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.0 (6H, ароматен H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116.5 (C-5), 121.3 (C-6), 72.4 (C-), 36.7 (C-), 127.8 (Caf-1), 115.2 (Caf{{89) }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf- ), 115.0 (Caf-), 147.3 (Caf-), 104.5 (G-1), 75.5 (Glc-2), 84.2 (Glc-3), 70.1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). 1H-NMR и 13C-NMR спектралните данни са в съгласие с тези на изоактеозид, както се съобщава в литературата [18].

Фракция III: HR-ESI-MS, наблюдавано при m/z 6{{108}}7.2032 (M−H)−, изчислено за C29H35O14, 607.2032. 'H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 на рамноза), 2,84 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar- CH2-), 4.37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 глюкоза), 5.19 (1H, d, J=1.5 Hz, H{ {35}} рамноза), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6–7,1 (7Н, ароматен Н). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130.8 (C-5), 116.2 (C-6), 72.4 (C-), 36.4 (C-), 127.8 (Caf-1), 114.8 (Caf{{88) }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Според литературата [18], фракция III съответства на сирингалид A 3'- -L-рамнопиранозид.

Фракция IV: HR-ESI-MS, наблюдавано при m/z 665.21{{20}} (M−H)−, изчислено за C31H37O16, 665.2087. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1.09 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 на рамноза), 2.00 (3H, s, OAc), 2.72 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 глюкоза), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, H-1 рамноза), 6,29 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6Н, ароматен Н). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116.4(C-5), 121.4 (C-6), 72.7 (C-), 36.4 (C-), 127.7 (Caf-1), 115.4 (Caf{{93) }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf- ), 114,7 (Caf-), 148,2 (Caf-), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). 1H-NMR и 13C-NMR спектралните данни са в съгласие с тези на 2'-ацетилактеозид [17].

4. Изводи

Установен е HSCCC метод за препаративно разделяне и пречистване на актеозид, изоактеозид, сирингалид А 3'- -L-рамнопиранозид и 2'-ацетилактеозид от Cistanches deserticola YC Ma. Настоящото проучване показва, че HSCCC е много мощна техника за препаративно разделяне и пречистване на биоактивни компоненти от растителни материали. Също така, съединенията могат да бъдат изолирани в достатъчно голям мащаб с висока чистота и след това могат да бъдат използвани като референтни вещества за хроматография или изследвания на биоактивност. Методът е осъществима, икономична и ефективна техника за бързо препаративно изолиране на сложни природни продукти.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%