Предишното научаване на страх дава възможност за бързо асимилиране на нови спомени за страх директно в кортикалните мрежи, част 3

Експериментален дизайн

Възпроизводимостта на данните беше оценена с различни повторения (таблица S1). Първите експерименти за инактивиране на CNQX в Te2 (Фигура 1A-1C) бяха извършени в по-голям брой повторения, тъй като те бяха първите експерименти, които проведохме и послужиха за тестване на основната хипотеза на нашето изследване. Животните априори бяха причислени към различни поведенчески групи по балансиран по тегло начин. Мъжките животни от едно и също разплод бяха разпределени на случаен принцип към всяка експериментална група. Първо разгледахме основната хипотеза на нашето изследване, т.е. кортикалната инактивация може да повлияе по различен начин на консолидирането на нова памет за страх при експериментално наивни плъхове и при животни, които са научили предишно събитие на страх.

Мъжките животни имат изключително силна памет, защото имат по-силен инстинкт за оцеляване и желание за размножаване. Животните, оцелели в дивата природа, трябва да запомнят много географска информация, видове храни, следи от хищници и местоположението на членовете на групата, за да се адаптират по-добре към околната среда и да защитят живота.

Например мъжките лъвове трябва да запомнят статуса на цялата територия, връзките на членство и местонахождението на конкурентите, за да защитят територията и техния статус. Мъжките зебри трябва да запомнят местоположението на водните източници и храната на пасищата, за да оцелеят и да се размножават. Компания за газирани напитки веднъж пусна реклама, показваща, че мъжка полярна мечка може да запомни гмуркач и неговата уникална миризма, за да може да го идентифицира следващия път, когато го види.

Следователно мъжките животни трябва да имат силна памет по отношение на защитата на своята територия, осигуряването на достатъчно храна и възпроизвеждането на потомство. Това също ги прави важни субекти в изследванията върху хората, например за изследване на заболявания като увреждане на паметта и болестта на Алцхаймер.

В човешкия свят можем да се вдъхновим и от паметта на мъжките животни. Непрекъснатото излагане на нови неща, непрекъснатото учене и мислене могат да подобрят паметта и адаптивността ни и да подобрят жизнения ни стандарт и ефективността на работа. Затова нека се учим от мъжките животни, да продължим да трупаме знания и опит, да имаме силни инстинкти за оцеляване и репродуктивни желания и да създадем по-добро бъдеще. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си. Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola е традиционен китайски лекарствен материал с много уникални ефекти, един от които е да подобрява паметта. Ефикасността на мляното месо идва от различните активни съставки, които съдържа, включително киселина, полизахариди, флавоноиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по различни начини.

Щракнете върху познайте начините за подобряване на мозъчната функция

В случай на статистически разлики между тези групи, ние в крайна сметка извършихме допълнителни контролни групи чрез инжектиране на физиологичен разтвор. Подобен подход беше приложен към оптогенетичните експерименти, където AAV-контролната група беше извършена само след като бяха открити статистически разлики между наивни и предварително обучени плъхове. Тези експериментални графици ни позволиха да избегнем ненужните контролни групи и използването на ненужни животни, ключов проблем в европейското и италианското законодателство относно експериментите с животни (принцип 3 Rs).

Поведенчески процедури

Всички експерименти са проведени по време на светлата фаза на деня (8 сутринта до 16 часа). Животните се транспортират поотделно от съоръжението до експерименталните помещения в различни малки прозрачни кофи в зависимост от експерименталните изисквания.

Слухова тренировка: Първа поведенческа сесия. Животни, обусловени от слухов страх (CS1-CS2). В тази група плъховете бяха внимателно извадени от домашната им клетка и пренесени от жилищната стая до звукоизолираната стая. Веднъж там, животните бяха поставени вътре в апарата за кондициониране, състоящ се от правоъгълна черна клетка (35 × 40 cm), оборудвана с решетка от неръждаема стомана (1 cm в диаметър, на разстояние 1,5 cm една от друга), свързана с инсталация за подаване на шок.

Плъховете бяха оставени необезпокоявани за 1 минута. След това време бяха приложени 7 условни стимула (CSs), състоящи се от чист тон от 15 kHz честота (15 s продължителност всеки, 80 dB, 36 s интервал на изпитания). Последната 1 s от всеки тон беше съчетана с болезнено US (0,5 mA, 1 s). В края на сесията за кондициониране плъховете бяха върнати в домашната им клетка.

Животни само с шок (shock-CS2). В тази група плъховете са поставени по подобен начин в същия апарат за кондициониране. Веднага след това всеки плъх беше подложен на 7-шокове с крака (1 s, 0.5 mA) един непосредствено след друг. В края на стимулацията животните бяха върнати обратно в домашната им клетка. Продължителността на времето в клетката за кондициониране е по-малко от 9 секунди. Предишни проучвания показват, че тази процедура позволява избягване на асоциативни процеси между болезнени стимули и сензорни стимули [29,30].

Животни, обусловени от страх от миризма (мирис-CS2). В тази група плъховете бяха поставени в същата правоъгълна черна клетка, използвана в горните експериментални групи и свързани с инсталация за доставяне на шок. Плъховете бяха оставени необезпокоявани за 2 минути. След това време бяха приложени 7 CSs, състоящи се от миризми на ванилия (10 s продължителност всяка, 24 s пробен интервал). Последната 1 s от всяка миризма беше съчетана с болезнено US (0,5 mA, 1 s). Модулът за кондициониране беше поставен близо до източник на вентилация, за да се избегне устойчивостта на доставените стимули след тяхното изместване. Клетката беше осигурена с горна решетка. Миризмите бяха представени с помощта на олфактометър за разреждане на потока. Чистият въздух (1,5 L/min) се насочва към електромагнитен клапан, който при задействане прекарва въздуха в бутилка от 15 ml, съдържаща 10 ml миризма на ванилия.

Животни само с тон (Tone-CS2). Плъховете в тази група бяха поставени в една и съща черна клетка и им беше представен 15-kHz тон (7 стимула, 15 s продължителност, 36 s ITI), доставен в отсъствието на САЩ.

Предварително експонирани животни (Tone-CS1-CS2). Плъховете бяха поставени вътре в клетката за кондициониране и 1 минута по-късно им беше представен 20 пъти само с 15-kHz тон, а 24 часа по-късно същият тон беше сдвоен с US, превръщайки се в CS1.

Обусловени от страх животни с бял шум (WN-CS2). В тази група плъховете се поставят в правоъгълната черна клетка и се оставят необезпокоявани за 1 минута. След това време бяха приложени 7 CS, състоящи се от WN (15 s продължителност всяка, 75 dB, 36 s интервал между опитите). Последната 1 s от всеки тон беше съчетана с болезнено УЗ (0.5 mA, 1 s). В края на сесията за кондициониране плъховете бяха върнати в домашната им клетка.

Слухово обучение на страх: Второ поведенческо обучение. Две седмици след процедурите, описани в горния параграф, животните бяха обучени на друга различна задача за кондициониране на слухов страх. Плъховете бяха поставени в стандартна кутия за одиране, както в предишната ни работа [10], и оставени необезпокоявани за 2 минути. След това време бяха доставени 7 CS, състоящи се от чисти тонове с честота 3 kHz (8 s продължителност всеки, 80 dB, 22 s междупробен интервал). Последната 1 s от всеки тон беше съчетана с болезнено US (0,5 mA, 1 s). В края на сесията за кондициониране плъховете бяха върнати в домашната им клетка.

Страх от задържане на паметта. Запазването на паметта за слухов страх, наскоро придобита от CS2 (3 kHz), беше тествано 4 дни по-късно. За оптогенетични експерименти, тестът за скорошна памет беше извършен с лазерно доставяне 24 часа след CS2-US обучението по аналогия с интервала от време, в който извършихме кортикална инактивация чрез администриране на CNQX (т.е. 24 часа след обучение). Плъховете са били привиквани към апарат, различен от този, използван за кондициониране, и са били поставени в различна стая, за да се избегне условно поведение на страх към контекстуални знаци [10,62].

Новият апарат се състоеше от прозрачна пластмасова клетка с боядисана в черно страна, затворена в кутия за намаляване на звука, оборудвана с изпускателен вентилатор, който елиминира ароматизирания въздух от камерата и осигурява фонов шум от 60 dB. На животните беше позволено да изследват клетката за 5 минути на ден по време на сесията за привикване. В деня на теста за задържане на паметта на страха, след 2 минути свободно изследване, ние предоставихме 4 CS2 от 3 kHz (8 s—22 ITI), без последвани от никакви US.

Ако се изисква от експерименталното търсене, плъховете бяха тествани за запазване на отдалечената памет за страх, придобита 2 седмици преди втория опит за кондициониране на слуховия страх. За тази цел, 7 дни след теста за задържане на паметта на страха до 3-kHz тон, животните бяха поставени в нова среда (клетка с черни и бели ивици) и след това бяха представени с 15-kHz тон. Бяха представени четири тона на интервали от 36 секунди.

Контекстно обучение: Първа поведенческа сесия. Група за кондициониране на контекстуален страх (CtxA-CtxB). В тази група плъховете бяха внимателно извадени от домашната им клетка, поставени в кофа и пренесени от жилищната стая до звукоизолираната стая. Веднъж там, животните бяха поставени вътре в апарата за кондициониране, състоящ се от гореспоменатата правоъгълна черна клетка, оборудвана с решетка от пръчки от неръждаема стомана, свързана с инсталация за подаване на шок. Плъховете бяха оставени необезпокоявани за 1 минута. След това време бяха приложени 5 US (0.5 mA, 1 s) с интервали от време от 51 s. В края на сесията животните бяха върнати обратно в домашната им клетка.

Група само за шок (shock-CtxB). Плъховете, веднъж поставени вътре в устройството за кондициониране, незабавно получиха 5-шокове с крака (1 s, 0.5 mA) един веднага след друг. Продължителността на времето в клетката за кондициониране е по-малко от 7 секунди. Предишни проучвания показват, че тази процедура позволява избягване на асоциативни процеси между болезнени стимули и сензорни стимули [29,30].

Група само за шок (shock-CtxB). Плъховете, веднъж поставени вътре в устройството за кондициониране, незабавно получиха 5-шокове с крака (1 s, 0.5 mA) един веднага след друг. Продължителността на времето в клетката за кондициониране е по-малко от 7 секунди. Предишни проучвания показват, че тази процедура позволява избягване на асоциативни процеси между болезнени стимули и сензорни стимули [29,30].

Ново контекстуално обуславяне на страха и скорошно запазване на паметта за страх. Две седмици след процедурите, описани в горния абзац, всички групи бяха обучени да свързват нова контекстуална среда (модулът на кутията на skinner, поставен в различна стая) с болезнено УЗ (0,5 mA, 1 s) . Всяко животно се поставя в новата камера и се оставя необезпокоявано за 2 минути. След това беше изложен на 5 US, разделени на интервали от 30 s.

Запазването на контекстуалната памет за страх беше тествано 4 дни след процедурата за кондициониране на страха чрез поставяне на плъхове отново в камерата на кутията на Скинър за 3 минути. За оптогенетични експерименти, тестът за скорошна памет беше извършен с лазерно доставяне 24 часа след CtxB-US обучението по аналогия с интервала от време, в който извършихме кортикална инактивация чрез администриране на CNQX (т.е. 24 часа след обучение). Ако се изисква от експерименталното търсене, плъховете след това бяха тествани за запазване на паметта за отдалечен страх чрез поставяне на животни в контекст, свързан със САЩ 2 седмици преди новата асоциация.

Животните бяха пренесени в 2 различни кофи до камерите за кондициониране в съответствие с различните контекстуални процедури.

Мярка за замразяване. Във всички експериментални процедури оценката на задържането на паметта на страха беше определена като реакция на замръзване [10], анализирана като пълна липса на соматична подвижност, с изключение на дихателните движения. За всяко животно времето (в секунди), прекарано в замразяване, беше измерено офлайн от 2 независими наблюдатели, които бяха заслепени за групите животни.

Хирургични процедури

За прилагане на избраните вещества в целевите места, плъховете бяха анестезирани с изофлуран: Индукцията беше извършена при 4% [об/об] в 2 L/мин медицински въздух и удължена до непрекъсната експозиция при 2% [об/об]) когато плъховете са монтирани в стереотаксичния апарат.

Беше направен разрез на черепа и бяха пробити малки дупки, за да се позволи проникването на 28-игла за инфузия. Спринцовка 10-ul Hamilton, монтирана на инфузионна помпа, е използвана за доставяне на вещества. След инфузията иглата се оставя на място за още 3 минути. След това разрезът се затваря със скоби за рани от неръждаема стомана и на животното се дава подкожна инжекция на аналгетика/противовъзпалителния кетопрофен (2 mg/kg телесно тегло) и животното се държи топло и под наблюдение до възстановяване от анестезията.

Както в предишни проучвания [10,32–34], канюлирането на животни не е необходимо, като активните съединения се прилагат директно стереотаксично. Тази процедура е изгодна, тъй като се избягва хирургическата травма, присъща на процедурата с постоянна канюла, като по този начин се ограничава травмата до еднократно проникване с игла [10,32–34]. Наистина, общата анестезия не влияе значително върху консолидацията на паметта [10,32–34]. За да се гарантира, че времето на прилагане на съединенията, свързано с опита за обучение, е точно, така че плъховете да получават избраните съединения около 1 час и около 1 ден след обучението, анестезията с изофлуран се индуцира 5 минути преди времето на планираната инжекция, например на 55 min при плъхове, третирани 60 минути след обучение и 23 часа и 55 минути при животни, инжектирани 24 часа след обучение. Всеки плъх беше кондициониран и след това опериран отделно. Животните, принадлежащи към различните поведенчески групи, бяха манипулирани по преплетен начин.

Селективният инхибитор на AMPA/каинат глутаматните рецептори CNQX ({{0}}циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] се разтваря в стерилен физиологичен разтвор (NaCl, 0.9%) и се коригира до рН 7,4 с НС1. Инхибиторът на протеиновия синтез анизомицин (Merck, 125 ug/ul) се разтваря в еквимоларна НС1, разрежда се със стерилен физиологичен разтвор и се коригира до рН 7.4 с NaOH. Стерилен физиологичен разтвор (0.9% NaCl) се използва като контрола на носителя. Тези вещества бяха двустранно инжектирани със скорост от 0,1 ul/min и обем от 0,5 ul на място при следните стереотаксични координати, взети от атласа на Paxinos и Watson [26], с Te2 кортикално поле, препратено към атласа на Zilles [25]:

Вторична слухова кора (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Преден зъбен кортекс (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Обемът на инжектиране (0.5 ul на място) е избран въз основа на предишни проучвания, при които активните съединения са инжектирани в Te2 [10,34] и ACC [55,63] при възрастни плъхове.

За инактивиране на дорзалния хипокампус, активните съединения бяха инжектирани в обем от 0.6 ul на място при следните стереотаксични координати:

Дорсален хипокампус: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Необратимите лезии на дорзалния хипокамп бяха индуцирани чрез прилагане на NMDA (Tocris, 18 ug/ul, разтворен в стерилен физиологичен разтвор, 0,4 ul на място) със скорост 0.1 ul/ min в точки на гореспоменатите координати. Същите координати бяха използвани за инжектирани с физиологичен разтвор контроли и фалшиво оперирани животни.

Red Retrobeads (Lumafluor, 1:2 разреждане във физиологичен разтвор, 0.6 ul) се инжектират в BLA съгласно следните координати: AP: -2.8; L: ±5,4; DV: −8,3.

В края на експериментите следите от иглата в случай на инжекции с CNQX, анизомицин или физиологичен разтвор или разширението на лезиите в случай на инжекции с NMDA бяха хистологично проверени. Плъховете бяха дълбоко анестезирани и интракардиално перфузирани с 4% формалдехид. Техните мозъци бяха нарязани на 30 μm върху криостат. Серийни срезове, оцветени с Nissl, бяха приготвени с помощта на конвенционалната процедура и срезовете бяха хистологично проверени под микроскоп, увеличен при 2, 5 ×.

Оптогенетични експерименти

Инжектиране на вирус. Адено-асоциираният вирус AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry и контролният вектор AAV5:CaMKII -cherry са получени от Vector Core на Университета на Северна Каролина (Chapel Hill, Северна Каролина, Съединени американски щати). Това изречение Вирусен титър беше 5:8 Вирусният титър беше 5,8 × 10^12 vg/ml и за двата вируса. Използването на CaMKII промотор позволява трансгенна експресия, благоприятстваща пирамидалните неврони. Вирусите бяха поставени във фризер с температура -80˚C. Вирусни инфузии, насочени към Te2 или ACC, се извършват при горните стереотаксични координати при обеми от 0.5 ul за всяка дупка. Вирусът се инжектира със скорост 0,1 ul/min и иглата се оставя на място за още 5 минути. Вирусните инжекции бяха извършени 4 седмици преди оптогенетичните експерименти.

Осветеност.

Оптичните влакна (Plexon, сърцевина 200/230 μm; дължина 10 mm) бяха имплантирани двустранно в BLA (AP=−2.8, L=± 5.4, V=−8.2 mm от брегма). Оптогенетичното инхибиране на Te2 проекции към BLA или на ACC проекции към BLA беше получено чрез използване на PlexBright Optogenetic Stimulation System, свързана с лазерен диод (Laserglow Technologies). Жълтата светлина (589 nm) се генерира и преминава през оптично влакно. Плътността на мощността, оценена на върха на оптичното влакно, беше 10 до 15 mW за осветяване на прожекционните места. По време на задържане на паметта на страха, светлинното излъчване е започнало 4 s преди началото на тона, продължава през целия тон и е спряно 4 s след отместването на тона. Животните, принадлежащи към групите за обуславяне на контекстуален страх, получиха светлинна стимулация по време на цялото изследване на контекста (3 минути). Плъховете бяха запознати с пач кабела в продължение на 2 дни преди опита за запазване на паметта.

Имунохистохимия. След завършване на оптогенетичните експерименти, плъховете бяха дълбоко анестезирани и перфузирани интракардиално с 4% PAF, за да се изследва дифузията на вируса. Мозъците бяха дисектирани, съхранявани една нощ при 4˚C и накрая прехвърлени в 30% захароза. Короналните срезове (30 μm) се нарязват на криостат и се събират в PBS. Свободно плаващите срезове се инкубират в блокиращ разтвор в продължение на 1 час при RT. След това те бяха инкубирани в първично моноклонално мише антитяло анти mCherry (1:500 разреждане, Abcam) в блокиращия разтвор за една нощ при RT. Впоследствие срезовете се промиват с PBS и се инкубират в продължение на 1 час при RT с вторично флуоресцентно AlexaFluor-568 анти-мише антитяло (1:600, Invitrogen), разредено в PBS. Срезовете се промиват в PBS, монтират се с монтажна среда, съдържаща DAPI (Вектор), и покривното стъкло се покрива.

Мозъците на плъхове, които са били подложени на NMDA инжекции, са събрани по подобен начин. Свободно плаващи срезове, след няколко изплаквания, се инкубират с първично моноклонално мише анти-Neun (1:1, 000 разреждане, Merck) антитяло в блокиращия разтвор за една нощ при стайна температура. Впоследствие срезовете се промиват с PBS и се инкубират в продължение на 1 час при стайна температура с биотинилирано конско анти-мише антитяло (1:200 разреждане, вектор). Комплексът авидин-биотин (ABC комплекс 1:100, вектор, 2 часа и половина инкубация) се свързва с диаминобензидин (0,03%, Merck) за оцветяване на Neun. След това срезовете се промиват в PBS и се прехвърлят в предметни стъкла, покрити с желатин, дехидратират се и се покриват с покривно стъкло.

Te2 срезове от инжектирани с ретро перли плъхове претърпяха инкубиране с първично поликлонално заешко анти-Fos антитяло (1:2, 000, клетъчно сигнализиране) в блокиращия разтвор за една нощ при RT. Впоследствие срезовете се промиват с PBS и се инкубират в продължение на 1 час при RT с анти-заешки Alexa 488 (1:1, 000, Invitrogen, в PBS). Накрая, имуномаркираните срезове се промиват в PBS, монтират се върху покрити с желатин предметни стъкла и се покриват с допълнена с DAPI среда за монтиране.

Микроскопия

Маркирането на mCherry беше изследвано с помощта на конфокален микроскоп Zeiss Airyscan: Използвани бяха два лазера (405 и 561 nm), всеки съответстващ на пиковия емисионен спектър за DAPI (оцветяване по Nissl за клетъчни ядра) и Alexa 568 (mCherry ), съответно. За да се анализира разпространението на вируса в местата на инжектиране, бяха получени микрографии на Te2 и ACC като мозаечни изображения (всеки единичен беше получен чрез използване на 10 × обектив). Терминалите на аксон в BLA бяха анализирани чрез използване на 40 × обектив като z-стек от 10 секции, разположени на 1 μm един от друг (159 μm квадрат; фракция на увеличение, 1.0).

За животни, инжектирани с ретро гранули, които са подложени на cFos имуномаркиране, изображенията са получени при увеличение 40× (159 μm квадрат; фракция на увеличение, 1.0) с 3 различни лазера, съответстващи на пиковия емисионен спектър съответно за DAPI (оцветяване на Nissl за клетъчни ядра), AlexaFluor 488 (cFos) и Texas Red (Retrobeads). Секции от 0,7 μm бяха получени по протежение на 10-μm z-стек. Броят на ядрата, експресиращи cFos, маркирани с гранули и двойно положителни (белязани с cFos+ гранули) се определя количествено за всяко животно в областта Te2 при предно-задните координати от 6,7 до 7,3 mm от брегмата [10]. След това данните бяха осреднени, за да се получи средната стойност за всяко животно и резултатите бяха статистически сравнени. Изображения на срезове с DAB оцветяване на Neun бяха анализирани с помощта на софтуер Neurolucida, свързан към микроскоп чрез цветна CCD камера [10].

Анализ на данни и критерии за изключване

n за всяка група беше установено a priori според нашите предишни проучвания [10,16,17], публикувани преди това работи в областта (вижте като препратки за ACC [6,22,55] и Te2 [10,59]), и чрез оценки на G-силата, съгласно следната таблица (Таблица 1):

За всеки анализ изчислихме краен среден брой от 8 до 10 животни за всяка група. Групите бяха управлявани с вътрешни контроли в една и съща експериментална сесия (таблица S1). Като се има предвид променливостта на хирургичните и поведенческите процедури, ние включихме априори по-голям брой експериментални субекти (до 15% повече), които в някои случаи отговаряха на експерименталните критерии и бяха включени, като по този начин се избягва произволно изключване. В случай на проучвания на хипокампа, за да оценим ефектите от инжекциите на NMDA и CNQX на различни интервали от време, ние балансирахме общия брой контролни животни между плъхове с носител и фалшиво оперирани плъхове сред различните групи.

Анализът на поведението, хистологичните инспекции и преброяването на клетките бяха извършени на сляпо. Животните с неадекватна локализация на следата на иглата или лезията в случай на NMDA-необратими лезии бяха изключени от анализа на данните (таблица S1). При фармакологични проучвания ние изключихме 57 животни от общо 465 животни поради неправилно поставяне на иглата (22/255 за Te2, 31/179 за ACC и 4/31 за хипокампуса). В проучвания за проследяване, върху 21 животни, елиминирахме 3 субекта, при които инжектирането на ретро гранули е пропуснало BLA. В оптогенетичните проучвания на Te2, върху общо 30 животни, ние изключихме 1 плъх, тъй като разположението на оптичните влакна не беше над целевата област, 1 плъх. В края на краищата, вирусът отсъстваше в Te2 и 2 плъха, тъй като разпространението на вируса беше съответно по-малко от 4,7% и 5,3% от площта на Te2 в местата на инжектиране. При плъхове, включени в статистическия анализ, минималната вирусна дифузия е 39,6% при по-предната стереотаксична координата и 50,2% при по-задната стереотаксична координата.

По подобен начин, в оптогенетичните експерименти на ACC, над общо 32 животни, 2 плъха бяха елиминирани, тъй като разположението на оптичните влакна не беше над целевата област. Два плъха бяха изключени, тъй като вирусът в ACC липсваше, 1 животно, защото вирусът беше в съседния вторичен моторен кортекс, и 1 плъх, защото вирусната дифузия беше по-малко от 2,3% от площта на ACC в местата на инжектиране. При останалите плъхове минималната вирусна дифузия е 33,3% при по-предната стереотаксична координата и 42,2% при по-задната координата.

В проучванията за лезии на NMDA, лезиите са насочени най-вече към областта CA1 на дорзалния хипокампус. Минималното (червено) и максималното разширение (розово) на хипокампалните лезии върху цялата област на дорзалния хипокампус са съответно 23,2% и 53,5% при по-предната стереотаксична координата и 28,3% и 62,3% при по-задната координата. От общо 73 животни, 4 плъха бяха елиминирани, тъй като лезията липсваше, докато допълнителни 3 животни бяха изхвърлени, тъй като разширението на лезиите беше по-малко от 5.0% (а именно 4,8%, 4,3%, 3,1 %) по отношение на областта на хипокампа при 2-те координати.

Анализът на контура на зоната беше извършен чрез визуална инспекция и ръчно количествено определяне с помощта на инструмента за регионални контури на софтуера ZEN 3.0. След това стойностите на площта бяха нормализирани спрямо общата площ на региона. Стереотаксичните координати на Te2, ACC и хипокампуса се основават на атласа на Paxinos [26] и, в случая на Te2, с кортикално поле, препратено към атласа на Zilles [25].

Статистически анализ

Всички данни са представени като средна стойност ± SEM. Всички данни преминаха теста на Левен за равенство на дисперсиите. По този начин параметричната статистика беше използвана във всички експерименти. Данните от 2 групи бяха сравнени с помощта на 2-опашени несдвоени t-тестове на Student. Сравненията на множество групи бяха оценени с помощта на 1-way ANOVA тест с post hoc теста на Tukey. За да се справим с различията между и в рамките на групите, ние изчислихме 3 × 2 смесен дизайн ANOVA модел с група (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) като между- променливата на субектите и състоянието (преди и след скорошно кондициониране + инжектиране) като променлива в рамките на субектите. Когато взаимодействието на група × условие беше значително, извършихме прост анализ на основните ефекти и коригирахме всяка p-стойност с корекцията на Bonferroni. За всеки смесен ANOVA модел ние оценихме предположението за сферичност чрез теста за сферичност на Mauchly.

Статистическите параметри (т.е. точната стойност на n за всяка група, SEM, статистическият тест, размерът на ефекта и точната p-стойност) се съобщават в легендите. За равни размери на извадката, размерите на ефекта за несдвоени t-тестове бяха определени чрез изчисляване на d на Коен или d на Глас според сходството на SD, докато за различни размери на извадката, Hedges'g. Корелациите между броя на клетките и замразяването бяха изчислени с помощта на коефициента на Pearson. За да определим дали данните отговарят на предположенията на статистическия подход, отхвърлихме нулевата хипотеза на ниво P < 0.05. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на SPSS Statistics 22 (IBM).

Подкрепяща информация

S1 Фиг. Увеличение на иглените следи на Te2 (A) и ACC кортекс (B), инжектирани с CNQX, избрани като примери. (C) Когато са представени със същия контекст 2 седмици след процедурата, животните само с шок показват слаб отговор на страх, демонстрирайки, че процедурата не предизвиква условно замразяване в контекста, в който е доставен шокът. (D) Подобни резултати като на фиг. 1 бяха получени чрез балансиране на 2 тона, използвани като CS (CS1, 3 kHz и CS2, 15 kHz) (t тест на Стюдент, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, d на Glass=4.14). (E) При кондиционираните с миризма плъхове, замръзването до миризмата, 2 седмици след кондиционирането, е високо, дори ако тествано в различна среда по отношение на контекста на кондициониране, като по този начин показва, че страхът е специфично свързан с тази доставка на сигнал. Скала, 300 μm. ��P < 0,01. Всички данни са средни и SEM. Обобщените данни за S1 Fig могат да бъдат намерени в подкрепяща информация във файла с име S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Фиг. Инжектирането на CNQX наруши запазването на скорошни слухови спомени за страх при плъхове, където генерализирането на страха беше намалено само чрез тон преди експозиция или чрез използване на тон на бял шум като CS1. 3 × 2 смесен дизайн ANOVA (основен ефект от групата: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, основен ефект от условието: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, група × условие взаимодействие F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) показа, че замразяването до 3 kHz тон преди свързването му със САЩ е по-ниско при животни, които са получили предварителна експозиция на 15 kHz тон преди сдвояването 15 kHz-US (n=10, p=0.001) или при плъхове, кондиционирани на бял шум (n=13 , p=0.008) в сравнение с CS1-CS2 животни (n=22), които показват променлива реакция на генерализиране на страха. Въпреки това, след CS-US обучение и инжекции на cnqx в кората на Te2, скорошната памет за страх беше нарушена във всички групи (p> 0.05). Прост основен ефект в рамките на групи (преди и след CS-US обучение, последвано от инжектиране на cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Тон-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) ��P < 0,05, ��P < 0,01. Всички данни са средни и SEM. Обобщените данни за S2 Fig могат да бъдат намерени в Подкрепяща информация във файла с име S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Фигура (A) Произволен пример за инжектиране на ретросфери, насочени към BLA. (B и C) Примери за поставяне на оптични влакна над BLA на животни, инжектирани с AAV вектори в Te2 (B) и ACC кора (C). Скала, 500 μm.

Благодарности

Благодарим на д-р Е. Манасеро за тяхната постоянна подкрепа и съвети.

Авторски принос

Концептуализация: Джулия Кончина, Анамария Рена, Бенедето Сакети.

Куриране на данни: Джулия Кончина, Луисела Милано, Бенедето Сакети.

Официален анализ: Джулия Кончина, Аннамария Рена, Луисела Милано.

Придобиване на финансиране: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Разследване: Джулия Кончина, Аннамария Рена, Луисела Милано.

Методология: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Надзор: Бенедето Сакети.

Валидиране: Бенедето Сакети.

Писане – оригинална чернова: Джулия Кончина, Бенедето Сакети.

Писане – преглед и редакция: Аннамария Рена, Луиселла Милано.

Препратки
1. Frankland PW, Bontempi B. Организацията на скорошни и отдалечени спомени. Nat Rev Neurosci. 2005 г.; 6: 119-130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Дудай Ю. Невробиологията на консолидациите или колко стабилна е енграмата? Annu Rev Psychol. 2004 г.; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Консолидация на паметта. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015 г.; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Консолидация на паметта и медиалния темпорален лоб: прост мрежов модел. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041-7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Защо има допълващи се системи за учене в хипокампуса и неокортекса: прозрения от успехите и неуспехите на конекционистките модели на учене и памет. Psychol Rev. 1995; 102: 419-457.

For more information:1950477648nn@gmail.com