Промитотично действие на Oenothera Biennis върху стареещи човешки дермални фибробласти, част 2

3. Дискусия

В това проучване ние изследвахме ефекта на хидрофилен клетъчен екстракт от Oenothera biennis (ObHEx) върху клетъчното стареене, тъй като той показа свойства против стареене на кожата при тестване в in vitro и ex vivo модели [18]. Използвахме подобен модел на стареене на NHDF, подложен на SIPS за лечение с H2O2 [21,22].

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Фенилетаноидните гликозиди Cistanche имат силна способност за пречистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и способността да улавя реактивни кислородни видове и да предотвратява свободните радикали.

индуцира разграждането на колагена и също така има добър възстановителен ефект върху анионните увреждания от свободните радикали на тимина.

Кликнете върху Къде мога да купя Cistanche

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

За да разберем механизма на действие на ObHEx върху стареещи човешки дермални фибробласти, чрез разкриването на биологичните пътища, променени от екстракта, ние извършихме независим от данните масспектрометричен ултра-дълбок протеомичен подход. Това ни позволи да получим най-пълния протеомен анализ на стареещи клетки до момента и, за първи път, едновременното количествено определяне на множество маркери за стареене.

На първо място, за да оценим индукцията на стареене чрез третиране с H2O2 върху NHFD клетки, ние определихме количествено известните маркери на стареене. Нашите протеомични данни потвърдиха индукция на стареене от оксидативен стрес: наистина наблюдавахме променени нива на вече известни маркери на стареене, свързани с повишеното лизозомно съдържание (GLB1 и FUCA1), увреждане на ДНК (ATR, ATM, MACROH2A1 и MACRO2A2) и G2 фаза на клетъчния цикъл арест (CDK1NA и MKI67). Освен това, анализът на обогатяване на пътя на най-ниско регулираните протеини в третираните с H2O2 спрямо контролните клетки сочи към митоза, отразяваща спирането на стареещата пролиферация.

Сравнявайки протеома на SIPS NHDF клетки, третирани с ObHEx спрямо нетретирани, ние открихме, че лечението с екстракт е в състояние частично да възстанови нивата на протеини и комплекси, играещи решаваща роля в няколко етапа на митозата. Инкубацията на ObHEx повишава нивата на CDK1, ключов митотичен протеин, който предизвиква влизане в митоза чрез образуване на комплекс с циклин В [34]. Освен това, всичките пет субединици на комплекса кондензин I бяха регулирани нагоре. Този комплекс е съставен от две субединици за структурна поддръжка на хромозоми (SMC), SMC2 и SMC4, и три не-SMC субединици, NCAPD2, NCAPH и NCAPG. В прометафазата функцията на комплекса кондензин I е да насърчава типовата кондензация на хромозомите чрез въвеждане на положителни суперспирали в ДНК по АТФ-зависим начин [35]. В допълнение към това, екстрактът регулира нагоре KNTC1, NUF2 и TRIP13, които са три протеина, свързани с кинетохора, голям комплекс, който по време на прометафазата свързва центромерния хроматин с микротубулите от противоположните полюси на вретеното, за да благоприятства сегрегацията на сестрински хроматиди [ 36,37]. Установено е и частично възстановяване на нивата на МСМ протеини. Тези протеини са в основата на репликационния хеликазен комплекс, който развива двойноверижната ДНК, за да осигури единични вериги като шаблони за ДНК полимераза. МСМ комплексът се превръща в активна хеликаза по време на S фазата, но вече е зареден върху хроматина по време на телофазата [38,39]. Екстрактът повишава нивата на IQGAP3, PBK и DHFR също. Първият, IQGAP3, е важен регулатор на митотичната прогресия, тъй като насърчава активността на cdk7, съществена за активирането на Cdc2 [40,41]; PBK е киназа, активна само в митоза; когато се фосфорилира, той взаимодейства с p53, дестабилизирайки го и отслабвайки пътя на увреждане на ДНК [42]; и DHFR е ключов ензим в биосинтезата на ДНК, чиито нива са значително намалени в стареещите човешки фибробласти [43].

Биоортогоналните анализи също показаха способността на ObHEx да възстановява частично отличителните белези на стареенето, а именно лизозомна активност и спиране на клетъчния цикъл. Наистина, за да проверим дали възстановяването на експресията на митотичен протеин от ObHEx се превръща в реактивиране на клетъчния цикъл, ние проведохме FACS (флуоресцентно активирано клетъчно сортиране) експерименти върху SIPS NHDF клетки, третирани или не с екстракта. Те показаха, че ObHEx е в състояние да намали фракцията на клетките, блокирани във фазата G2, и да насърчи повторното им влизане в клетъчния цикъл на стареещите клетки.

4. Материали и методи

4.1. Клетъчна култура

Нормални човешки дермални фибробласти (NHDF; Promocell) се култивират в модифицирана Eagle среда на Dulbecco (DMEM; Gibco), допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS; Gibco) и 500 U/mL пеницилин-стрептомицин (Gibco) в 95 процента въздух , 5 процента CO2 и овлажнена атмосфера при 37 ◦C.

4.2. Индуциране на предизвикано от стрес преждевременно стареене (SIPS)

Общо 10 1200 000 NHDF клетки се посяват във всяка от 60 mm панички за клетъчна култура, един ден преди инкубирането им със 100 µM H2O2 при 37 ◦C за 2 часа [21,22]. Впоследствие H2O2 се промива с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS; Gibco), за да се прекрати лечението и клетките се отглеждат в нормална среда в продължение на 4 дни. За клетките без стареене, използвани като контрола, 2240 000 NHDF клетки бяха посяти във всяка от 60 mm чаши за клетъчни култури. Експериментът е проведен в 5 биологични повторения.

4.3. Приготвяне на хидрофилен екстракт от Oenothera Biennis (ObHEx).

Екстрактът е приготвен в лабораториите на Arterra Bioscience SpA [18]. Клетъчните култури бяха получени от листа на растения Oenothera biennis (осигурени от GEEL Floricultura ss) чрез индуциране на пролиферация на меристематични клетки върху твърди агарови плаки до получаването на калуси. Клетките бяха прехвърлени в течната растежна среда (Gamborg B5, допълнена с 2,4 дихлоро феноксиоцетна киселина (1 mg/L), аденин (1 mg/L) и кинетин (0.01 mg/L )) и се отглеждат като суспензионни култури при орбитално разклащане. След като бяха получени култури от около 150 g/L, клетките бяха събрани и лизирани в PBS при рН 7.4 за получаване на водоразтворим екстракт. След лиофилизиране, полученият прах се разтваря във вода или среда за клетъчна култура в подходящите концентрации за тестване.

4.4. Лечение с хидрофилен екстракт от Oenothera Biennis (ObHEx).

NHDF клетките се инкубират в продължение на 24 часа с 0.01 процент (p/v) ObHEx в пълна среда. Впоследствие клетките се промиват три пъти с PBS и се третират за допълнителни 24 часа с 0.01 процента (p/v) ObHEx в среда без серум. След това те се отделят чрез трипсинизация, центрофугират се при 500 g за 10 минути при 4 ° C и се промиват два пъти с PBS. Нетретираните контролни клетки претърпяха същите инкубации без ObHEx.

4.5. Подготовка на проба за протеомен анализ

Пелетите се ресуспендират в 60µL буфер за радиоимунопреципитационен анализ (RIPA) и се лизират чрез ултразвук. Концентрацията на протеин в клетъчните лизати се определя количествено с помощта на DC™ комплект за анализ на протеин (Biorad; #5000112). S-TrapTM микро въртяща се колона (Protifi, Huntington, СА, САЩ) смилането се извършва върху 50 ug клетъчни лизати съгласно инструкциите на производителя. Накратко, пробите се редуцират с 20 mM трис(2- карбоксиетил)фосфин (TCEP) и се алкилират с 50 mM тиоацетамид (CAA) в продължение на 15 минути при стайна температура. След това се добавя воден разтвор на фосфорна киселина до крайна концентрация от 2,5 процента, последвано от добавяне на S-Trap свързващ буфер (90 процента воден метанол, 100 тМ TEAB, рН 7,1). След това смесите се зареждат в S-Trap колони. Извършени са пет допълнителни стъпки на промиване за цялостно елиминиране на SDS. След това клетъчните лизати се усвояват с 2, 5 µg трипсин (Promega) при 47 ° C в продължение на 1 час. След елуиране пептидите се изсушават във вакуум, ресуспендират се в 2 процента ACN, 0,1 процента FA и се определят количествено чрез Nanodrop.

4.6. nanoLC-MS/MS Идентификация и количествено определяне на протеини

Общо 400 ng от всяка проба бяха инжектирани в наноплака (Bruker Daltonics, Бремен, Германия) система за високоефективна течна хроматография (HPLC), свързана с timsTOF Pro (Bruker Daltonics, Бремен , Германия) масспектрометър. HPLC разделяне (Разтворител A: {{30}}.1 процента мравчена киселина във вода; Разтворител B: 0,1 процента мравчена киселина в ацетонитрил) се провежда при 250 L/min, като се използва напълнена емитерна колона (C18, 25 cm × 75 µm 1,6 µm) (Ion Optics, Fitzroy, Австралия), като се използва градиентно елуиране (2 до 13 процента разтворител В за 41 минути; 13 до 20 процента за 23 минути; 20 процента до 30 процента за 5 минути; 30 процента до 85 процента за 5 минути и накрая 85 процента за 5 минути за промиване на колоната). Мас-спектрометричните данни бяха получени с помощта на метода за получаване на паралелно натрупване на серийна фрагментация (diaPASEF), независим от данните. Настройките на пелените бяха: обхват на масата от 400 до 1200 Da, обхват на мобилност от 0,60 до 1.43 1/k0, брой на прозореца на мобилност 1, оценка на времето на цикъла 1,79 s, стъпки на масата на цикъл 32.

4.7. MS обработка на данни и биоинформатичен анализ

Анализът на данните беше извършен с помощта на софтуер DIA-NN (версия 1.8) [44]. Беше извършено търсене в човешката база данни UniProtKB/Swiss-Prot Homo sapiens (издание февруари 2021 г., 20 408 записа) с помощта на работен процес без библиотека. За тази цел опциите „FASTA дайджест за безплатно търсене/генериране на библиотека“ и „Дълбоко изучаване на спектри, RTs и IMs прогнозиране“ бяха проверени за генериране на прекурсорни йони. Максимум 2 пропуснати разцепвания на трипсин бяха разрешени и максималната променлива модификация беше зададена на 5. Карбамидометилирането (Cys) беше зададено като фиксирана модификация, докато изрязването на N-терминален метионин на протеина, окислението на метионин и N-терминалното ацетилиране бяха зададени като променливи модификации. Диапазонът на дължина на пептида беше настроен на 7–30 аминокиселини, обхват на заряда на прекурсора 2–4, обхват на прекурсора m/z 300–1800 и диапазон на фрагментен йон m/z 200–1800. За търсене на основната маса и йони на фрагменти, точността беше изведена автоматично от DIA-NN и беше зададена около 13 ppm за всеки анализ. Степента на фалшиво откриване (FDRs) на протеинови и пептидни нива беше зададена на 1 процент. Съвпадението между рънове беше разрешено. За стратегията за количествено определяне беше използван Robust LC (висока точност), както се препоръчва в документацията на софтуера, докато настройките по подразбиране бяха запазени за другите параметри на алгоритъма.

Статистическият и биоинформационен анализ беше извършен със софтуер Perseus (версия 1.6.15), свободно достъпен на уебсайта (достъпен на 22 юни 2021) [45] и R/R Studio и RStudio версия 20 21.09.1 30 (достъп на 12 ноември 2021 г.). Целият R статистически анализ беше извършен с помощта на пакета R stats. Използва се изходната матрица на pg доклад от DIA-NN и интензитетите се трансформират в log2 за статистически анализ. За статистическото сравнение зададохме четири групи, всяка от които съдържа 5 биологични реплики. След това филтрирахме данните, за да запазим само протеини с поне 3 валидни стойности в поне една група. След това данните бяха приписани, за да попълнят липсващите точки от данни чрез създаване на Гаусово разпределение на произволни числа със стандартно отклонение от 33 процента спрямо стандартното отклонение на измерените стойности и 1,8 стандартно отклонение, изместване надолу на средната стойност, за да симулира разпределението на ниските стойности на сигнала. Извършен е t-тест на Student между SEN и CTRL FDR < 0,05, S0=0.1, за да се потвърди наличието на маркери, специфични за стареенето. След това, за да се изследва дали разликата в размера на ефекта между отсъствието или присъствието на лечението е еднаква за клетките, където стареенето е индуцирано или не, взаимодействието между двата фактора (т.е. индукция и лечение) беше изследвано с помощта на двупосочна ANOVA в R. След това p-стойностите, получени за взаимодействието на двата фактора, бяха коригирани за многократно тестване с помощта на метода на Benjamini–Hochberg [46] за контрол на процента на фалшиви открития (FDR). Накрая, Tukey HSD post hoc анализ беше извършен върху протеини, показващи q-стойност <0.05. Протеомичните данни от масовата спектрометрия са депозирани в консорциума ProteomeXchange чрез партньорското хранилище PRIDE [47] с идентификатор на набор от данни PXD034222.

4.8. Свързано със стареенето оцветяване с ß-галактозидаза

Свързаната със стареенето активност на ß-галактозидаза (SA-ß-gal) беше оценена с помощта на комплект за оцветяване Cell Signaling Technology (#9860). Общо 1250 000 NHDF клетки/ямка бяха посяти в 6-плака с ямки един ден преди SIPS; докато, като контрола, 250 000 клетки/ямка. След 4 дни в нормална среда клетките се инкубират или не с 0.01 процента (p/v) ObHEx за 48 часа. Впоследствие те се промиват с PBS и се третират с фиксиращия разтвор за 15 минути. След две промивания с PBS, клетките се инкубират с ß-gal оцветяващ разтвор (крайно рН 6,0), съдържащ 5-бромо-4-хлоро-3-индолил- -D-галакто -пиранозид (X-Gal) при 37 ◦C в сух инкубатор за 20 часа. Положителните клетки са сини. Цветът се дължи на разцепването на X-Gal в галактоза и 5-бромо-4-хлоро-3-индоксил (X) от SA-ß-gal. Индоксилът се окислява до 5,50 -дибромо-4,40 -дихлоро-индиго, което образува интензивна синя утайка. Процентът на положителните клетки в общия брой клетки беше оценен чрез преброяване на 100–150 клетки в 5 произволно избрани изображения, заснети от микроскопа, за всяко състояние. Клетките се преброяват с помощта на софтуера ImageJ. Експериментът се провежда трикратно.

4.9. Флуоресцентно-активиран клетъчен сортиращ анализ

Общо {{0}} NHDF клетки/ямка бяха посяти в 6-плака с ямки един ден преди SIPS; докато, като контрола, 50 000 клетки/ямка. След 4 дни в нормална среда, контролните и стареещите клетки бяха третирани или не с 0.01 процента (p/v) ObHEx за 72 часа. След това клетките се инкубират в присъствието на 5 µg/mL Hoechst 33342 в продължение на 30 минути при 37 ◦C. След трипсинизация и центрофугиране при 500 g за 2 минути, те бяха ресуспендирани в 200 uL PBS. Накрая, клетъчната флуоресценция беше измерена с BD LSRFortessa Cell Analyzer. Данните бяха анализирани с помощта на софтуер FlowJo v10.8.1. Експериментът се провежда трикратно.

5. Изводи

Глобалното протеомно профилиране, свързано със стареенето, получено тук, предоставя стотици протеини, дерегулирани от SIPS, които могат да бъдат използвани от научната общност за по-нататъшно разбиране на стареенето и за оценка на ефектите на нови потенциални модулатори. Освен това, нашата работа доказва промитотичен механизъм на действие на ObHEx върху стареещи човешки дермални фибробласти: чрез увеличаване на експресията на митотичен протеин, той насърчава възстановяването на пролиферацията на стареещи клетки. По този начин, въз основа на тези резултати, ние предлагаме ObHEx като мощен адювант срещу стареенето, свързано със стареенето на кожата.

Авторски принос:Концептуализация, SC, MCM и ICG; методология, SC, KR, IM, CC (Cerina Chhuon) и ICG; софтуер, КР; разследване, SC, IM, CC (Cerina Chhuon), KT, SF, ADL, IP и CC (Corinne Cordier); ресурси, MCM и ICG; писане—изготвяне на оригинален проект, SC и ICG; писане—преглед и редактиране, SC, MCM и ICG Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Декларация за наличност на данни:Протеомичните данни от масовата спектрометрия са депозирани в ProteomeXchange Consortium чрез партньорското хранилище PRIDE [47] с идентификатор на набор от данни PXD034222 (Данни за акаунта на рецензент: потребителско име: рецензент_pxd034222@ebi.ac.uk; парола: fK9Pjv90) .

Благодарности: Това проучване е подкрепено от Programma Operativo Complementare Ricerca e Innovazione 2014–2020, Asse I „Capitale Umano“, Azione I.1 „Dottorati Innovativi con caratterizzazione Industriale“. Благодарим на другите членове на платформата Proteomics Necker Vincent Jung и Joanna Lipecka за тяхната безценна научна подкрепа и ползотворни предложения.

Препратки

1. Ди Мико, Р.; Крижановски, В.; Бейкър, Д.; d'Adda di Fagagna, F. Клетъчно стареене при стареене: от механизми до терапевтични възможности. Нац. Rev. Mol. Cell Biol. 2021, 22, 75–95. [CrossRef] [PubMed]

2. Гонзалес-Гуалда, Е.; Бейкър, AG; Фрук, Л.; Muñoz-Espín, D. Ръководство за оценка на клетъчното стареене in Vitro и in Vivo. FEBS J. 2021, 288, 56–80. [CrossRef] [PubMed]

3. Сикора, Е.; Bielak-˙Zmijewska, A.; Mosieniak, G. Какво е и какво не е клетъчно стареене. Postepy Biochem. 2018, 64, 110–118. [CrossRef] [PubMed]

4. Чой, Е.-Дж.; Kil, IS; Cho, E.-G. Извънклетъчните везикули, получени от стареещи фибробласти, намаляват дермалния ефект върху диференциацията на кератиноцитите. Вътр. J. Mol. Sci. 2020, 21, 1022. [CrossRef] [PubMed]

5. Кртолица, А.; Parrinello, S.; Локет, С.; Desprez, PY; Campisi, J. Стареещите фибробласти насърчават растежа на епителните клетки и туморогенезата: връзка между рака и стареенето. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 2001, 98, 12072–12077. [CrossRef]

6. Влашчек, М.; Майти, П.; Макрантонаки, Е.; Scharffetter-Kochanek, K. Стареене на съединителната тъкан и фибробластите при стареене на кожата. J. Invest. Dermatol. 2021, 141, 985–992. [CrossRef]

7. Паез-Рибес, М.; González-Gualda, E.; Дохърти, GJ; Muñoz-Espín, D. Насочване към стареещи клетки в транслационната медицина. EMBO Mol. Med. 2019, 11, e10234. [CrossRef]

8. Сото-Гамез, А.; Демария, М. Терапевтични интервенции за стареене: Случаят на клетъчно стареене. Лекарство Discov. Днес 2017, 22, 786–795. [CrossRef]

9. Latorre, E.; Birar, VC; Sheerin, AN; Jeynes, JCC; Хупър, А.; Dawe, HR; Melzer, D.; Кокс, LS; Faragher, RGA; Ostler, EL; et al. Модулирането на малка молекула на експресията на сплайсинг фактор е свързано със спасяването от клетъчно стареене. BMC Cell Biol. 2017, 18, 31. [CrossRef]

10. Мунир, Р.; Semmar, N.; Фарман, М.; Ahmad, NS Актуализиран преглед на фармакологичните дейности и фитохимичните съставки на вечерна иглика (род Oenothera). Азиатски пак. J. Trop. Biomed. 2017, 7, 1046–1054. [CrossRef]

11. Тимощук, М.; Bielawska, K.; Skrzydlewska, E. Evening Primrose (Oenothera biennis) Биологична активност, зависима от химичния състав. Антиоксиданти 2018, 7, 108. [CrossRef]

12. Лий, С.Й.; Ким, CH; Hwang, BS; Чой, К.-М.; Янг, I.-J.; Kim, G.-Y.; Choi, YH; Парк, C.; Jeong, J.-W. Защитни ефекти на Oenothera Biennis срещу индуциран от водороден пероксид оксидативен стрес и клетъчна смърт в кожните кератиноцити. Life 2020, 10, 255. [CrossRef]

13. Граница, С.; Czerwi´nska, ME; Piwowarski, JP; Зияя, М.; Kiss, AK Химичен състав, антиоксидантна и противовъзпалителна активност на екстракти, приготвени от надземни части на Oenothera Biennis L. и Oenothera Paradoxa Hudziok, получени след култивиране на семена. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 801–810. [CrossRef]

14. Фекер, Р.; Буда, В.; Алекса, Е.; Аврам, С.; Павел, И.З.; Мунтян, Д.; Кокан, И.; Watz, C.; Минда, Д.; Dehelean, Калифорния; et al. Фитохимичен и биологичен скрининг на Oenothera Biennis L. Хидроалкохолен екстракт. Биомолекули 2020, 10, 818. [CrossRef]

15. Шефер, Л.; Kragballe, K. Добавка с масло от вечерна иглика при атопичен дерматит: Ефект върху мастните киселини в неутрофилите и епидермиса. Липиди 1991, 26, 557–560. [CrossRef]

16. Барбулова, А.; Apone, F.; Colucci, G. Растителни клетъчни култури като източник на козметични активни съставки. Козметика 2014, 1, 94–104. [CrossRef]

17. Цезар, Л.К.; Cech, NB Синергия и антагонизъм в екстракти от естествени продукти: Когато 1 плюс 1 не е равно на 2. Nat. произв. Rep. 2019, 36, 869–888. [CrossRef]

18. Чекачи, С.; Де Лусия, А.; Тито, А.; Тортора, А.; Фаланга, Д.; Arciello, S.; Ausanio, G.; Di Cicco, C.; Монти, MC; Apone, F. Екстракт от клетъчни култури на Oenothera Biennis, надарен с активност против стареене на кожата, подобрява механичните свойства на клетките. Метаболити 2021, 11, 527. [CrossRef]

19. Фаруик, М.; Кьолер, Т.; Schild, J.; Ментел, М.; Maczkiewitz, U.; Пагани, В.; Bonfigli, A.; Ригано, Л.; Бурейк, Д.; Gauglitz, GG Пентацикличните тритерпени от Terminalia Arjuna показват множество ползи върху остаряла и суха кожа. Skin Pharmacol. Physiol. 2014, 27, 71–81. [CrossRef]

20. Бонте, Ф.; Дюма, М.; Chaudagne, C.; Meybeck, A. Влияние на азиатската киселина, мадекасовата киселина и азиатикозида върху синтеза на човешки колаген I. Planta Med. 1994, 60, 133–135. [CrossRef]

21. Chowdhary, S. Ефектите на оксидативния стрес върху индуцирането на стареене в човешките фибробласти. Дж. Саут Карол. акад. Sci. 2018, 16, 2.

22. Уанг, З.; Wei, D.; Xiao, H. Методи за индуциране на клетъчно стареене с помощта на оксидативен стрес. Методи Mol. Biol. 2013, 1048, 135–144. [PubMed]

23. Хилдебранд, DG; Lehle, S.; Борст, А.; Хаферкамп, С.; Essmann, F.; Schulze-Osthoff, K. -Fucosidase като нов удобен биомаркер за клетъчно стареене. Клетъчен цикъл 2013, 12, 1922–1927. [CrossRef] [PubMed]

24. Лий, BY; Хан, JA; Im, JS; Morrone, A.; Йохунг, К.; Goodwin, EC; Kleijer, WJ; DiMaio, D.; Hwang, ES Свързаната със стареенето бета-галактозидаза е лизозомна бета-галактозидаза. Старееща клетка 2006, 5, 187–195. [CrossRef] [PubMed]

25. Горгулис, В.; Адамс, PD; Алимонти, А.; Бенет, окръг Колумбия; Бишоф, О.; Bishop, C.; Campisi, J.; Коладо, М.; Евангелу, К.; Ferbeyre, G.; et al. Клетъчно стареене: определяне на път напред. Cell 2019, 179, 813–827. [CrossRef]

26. Мацуока, С.; Ballif, BA; Smogorzewska, A.; McDonald, ER; Хуров, К.Е.; Luo, J.; Бакаларски, CE; Джао, З.; Солимини, Н.; Lerenthal, Y.; et al. ATM и ATR субстратният анализ разкрива обширни протеинови мрежи, реагиращи на увреждане на ДНК. Наука 2007, 316, 1160–1166. [CrossRef]

27. Джан, Р.; Чен, В.; Adams, PD Молекулярна дисекция на образуването на асоциирани със стареенето хетерохроматинови фокуси. Mol. Cell Biol. 2007, 27, 2343–2358. [CrossRef]

28. LaBaer, ​​J.; Garrett, MD; Стивънсън, LF; Slingerland, JM; Sandhu, C.; Chou, HS; Fattaey, A.; Harlow, E. Нови функционални дейности за P21 семейството на CDK инхибитори. Genes Dev. 1997, 11, 847–862. [CrossRef]

29. Шолцен, Т.; Гердес, Дж. Протеинът Ki-67: от познатото и неизвестното. J. Cell Physiol. 2000, 182, 311–322. [CrossRef]

30. Passos, JF; von Zglinicki, T. Методи за клетъчно сортиране на млади и стареещи клетки. Методи Mol. Biol. 2007, 371, 33–44.

31. Дай, Й.; Танг, Х.; Pang, S. Решаващите роли на фосфолипидите в стареенето и регулирането на продължителността на живота. Отпред. Physiol. 2021, 12, 1998. [CrossRef]

32. Dashty, M. Сигналната пътека на Hedgehog е свързана със заболявания, свързани с възрастта. J. Diabetes Metab. 2014, 5, 2. [CrossRef]

33. Уанг, Д.; Лу, П.; Liu, Y.; Чен, Л.; Джан, Р.; Sui, W.; Думитру, AG; Чен, X.; Уен, Ф.; Ouyang, H.-W.; et al. Изолиране на живи преждевременно стареещи клетки с помощта на FUCCI технология. Sci. Rep. 2016, 6, 30705. [CrossRef]

34. Qian, J.; Beullens, М.; Huang, J.; De Munter, S.; Лесаж, Б.; Bollen, M. Cdk1 нарежда митотични събития чрез координиране на хромозомно-асоцииран фосфатазен превключвател. Нац. Общ. 2015, 6, 10215. [CrossRef]

35. Конг, М.; Cutts, EE; Пан, Д.; Beuron, F.; Kaliyappan, T.; Xue, C.; Морис, ЕП; Musacchio, A.; Ванини, А.; Greene, EC Човешки кондензин I и II стимулират екстензивно ATP-зависимо уплътняване на нуклеозомно-свързана ДНК. Mol. Cell 2020, 79, 99–114.e9. [CrossRef]

36. Kops, GJPL; Gassmann, R. Crowning the Kinetochore: The Fibrous Corona in Chromosome Segregation. Trends Cell Biol. 2020, 30, 653–667. [CrossRef]

37. Ма, HT; Poon, RYC TRIP13 Функции при установяването на контролна точка на монтажа на шпиндела чрез попълване на O-MAD2. Cell Rep. 2018, 22, 1439–1450. [CrossRef]

38. Кайпърс, Масачузетс; Стасевич, TJ; Сасаки, Т.; Уилсън, Калифорния; Hazelwood, KL; McNally, JG; Davidson, MW; Gilbert, DM Силно стабилно зареждане на Mcm протеини върху хроматин в живи клетки изисква репликация за разтоварване. J. Cell Biol. 2011, 192, 29–41. [CrossRef]

39. Meng, Q.; Гао, J.; Zhu, H.; Той Х.; Lu, Z.; Хонг, М.; Zhou, H. Протеомното изследване на серийно пасирани фибробластни клетки на човешка кожа разкрива низходяща регулация на протеините на хромозомния кондензинов комплекс, участващи в репликативното стареене. Biochem. Biophys. Рез. Общ. 2018, 505, 1112–1120. [CrossRef]

40. Ларошел, С.; Pandur, J.; Fisher, RP; Salz, HK; Suter, B. Cdk7 е от съществено значение за митозата и за in vivo Cdk-активираща киназна активност. Genes Dev. 1998, 12, 370–381. [CrossRef]

41. Леоне, М.; Касорла-Васкес, С.; Ferrazzi, F.; Wiederstein, JL; Gründl, M.; Weinstock, G.; Vergarajauregui, S.; Екщайн, М.; Крюгер, М.; Gaubatz, S.; et al. IQGAP3, цел на YAP, е необходим за правилната прогресия на клетъчния цикъл и стабилността на генома. Mol. Cancer Res. 2021, 19, 1712–1726. [CrossRef] [PubMed]

42. Нанди, AK; Форд, Т.; Флексър, Д.; Neuman, B.; Rapoport, AP Атенюация на контролна точка за увреждане на ДНК от PBK, нова митотична киназа, включва взаимодействие протеин-протеин с туморен супресор P53. Biochem. Biophys. Рез. Общ. 2007, 358, 181–188. [CrossRef] [PubMed]

43. Добър, Л.; Димри, Г.П.; Campisi, J.; Chen, KY Регулиране на генната експресия на дихидрофолат редуктаза и E2F компоненти в човешки диплоидни фибробласти по време на растеж и стареене. J. Cell Physiol. 1996, 168, 580–588. [CrossRef]

44. Демичев, В.; Messner, CB; Vernardis, SI; Лили, Канзас; Ralser, M. DIA-NN: Невронни мрежи и корекция на смущения позволяват дълбоко протеомно покритие при висока пропускателна способност. Нац. Методи 2020, 17, 41–44. [CrossRef]

45. Тянова, С.; Тему, Т.; Sinitcyn, P.; Карлсън, А.; Хайн, MY; Geiger, T.; Ман, М.; Кокс, Дж. Изчислителната платформа на Персей за цялостен анализ на (Prote)Omics данни. Нац. Методи 2016, 13, 731–740. [CrossRef]

46. ​​Бенджамини, Й.; Hochberg, Y. Контролиране на степента на фалшиви открития: практичен и мощен подход към многократно тестване. JR Stat. Soc. сер. B (Метод.) 1995, 57, 289–300. [CrossRef]

47. Перес-Риверол, Й.; Bai, J.; Bandla, C.; Гарсия-Сейсдедос, Д.; Hewapathirana, S.; Kamatchinathan, S.; Кунду, DJ; Пракаш, А.; Frericks-Zipper, A.; Айзенахер, М.; et al. Ресурсите на базата данни PRIDE през 2022 г.: Център за базирани на масова спектрометрия протеомични доказателства. Nucleic Acids Res. 2021, 50, D543–D552. [CrossRef]

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】