Съотношението на концентрата в диетата на млечни крави в ранна лактация има контрастиращи ефекти върху глобалните транскриптомни профили на циркулиращите левкоцити, здравето и плодовитостта според паритета

Резюме:Функционалността на циркулиращите левкоцити при млечните крави се потиска след отелването, като рисков фактор е отрицателният енергиен баланс. Транскриптомните профили на левкоцитите бяха сравнени отделно при 44 многораждащи (MP) и 18 първораждащи (PP) холщайн-фризийски крави, получаващи диети, различни в пропорцията на концентрат, за да се провери дали имунната дисфункция може да бъде смекчена чрез подходящо хранене. След отелването на кравите се предлага или (1) нисък концентрат (LC); (2) диети със среден концентрат (MC) или (3) диети с висок концентрат (HC) с пропорции на концентрат към силаж от трева съответно 30%:70%, 50%:50% и 70%:30%. Събраните данни за фенотипа на кравата включват циркулиращи метаболити, добив на мляко и данни за здравето и плодовитостта. Беше извършено РНК секвениране на циркулиращи левкоцити на 14 дни в млякото. HC диетата подобри енергийния баланс и в двете възрастови групи. Има повече диференциално експресирани гени в PP, отколкото в MP крави (460 срещу 173, HC срещу LC сравнение) с малко припокривания. MP кравите на LC диета показаха регулиране на каскадата на комплемента и коагулацията и механизмите на вродена имунна защита срещу патогени и имаха тенденция към повече случаи на мастит и по-слаба плодовитост. За разлика от това, PP кравите на HC диета показват по-големи имунни отговори въз основа както на генната експресия, така и на фенотипните данни и по-дълъг интервал от отелване до зачеване. Поради това левкоцитите на MP и PP кравите реагират различно на диетите между възрастта, снабдяването с хранителни вещества и имунитета, засягайки тяхното здраве и последваща плодовитост.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Ключови думи:следродилна имуносупресия; вроден имунитет; метаболизъм; левкоцити; диети за кърмене; транскриптом; размножаване; крави

1. Въведение

Рано след раждането млечните крави се характеризират с имуносупресия, засягаща вродения и адаптивен имунитет, включително клетъчно-медииран и хуморален имунитет. Циркулиращите левкоцити се набират в тъкани като млечната жлеза и ендометриума по време на възпаление. Предишни проучвания обаче показват намаляване както на броя на левкоцитите, така и на техния функционален капацитет по време на перипарталния период [1,2]. Докладваните ефекти включват нарушена фагоцитоза и активност на окислителен взрив [3–5], намалена реакция на циркулиращите Т-клетки към митогенни агенти и намалено производство на имуноглобулин от В-клетки [6,7]. Причините са многофакторни, но изглежда са свързани с разпределението на хранителните вещества в полза на производството на мляко в началото на лактацията, което компрометира имунната функция [8–10]. Левкоцитите се нуждаят от адекватно снабдяване с глюкоза, различни мастни киселини и холестерол или оксистероли за тяхната поддръжка и функционалност [8,11,12]. Наличното снабдяване с хранителни вещества обаче е приоритетно към млечната жлеза след отелване, което изисква приблизително 25% повече метаболизируема енергия и протеин, отколкото се осигурява от приема на храна [8,13,14]. В допълнение, раждането се характеризира с възпалителни процеси, свързани с промени в секрецията на различни простагландини, стероиди и цитокини и възможни наранявания по време на самия процес на раждане [15–17]. Възпалителните реакции към отелването и метаболитите, освободени по време на тъканната мобилизация, имат мощни анорексични ефекти, като допълнително намаляват приема и изострят отрицателния енергиен баланс (NEB) [18]. Когато приемът на храна не може да отговори на нарастващото енергийно търсене, кравите навлизат в период на NEB, като някои индивиди стават метаболитно дисбалансирани [19–21]. NEB се свързва с инсулинова резистентност, намалена експресия на рецептор на чернодробен растежен хормон (GH) и по-нисък чернодробен синтез на IGF-1 [22,23]. Разединяването на GH с инсулин при крави след раждането е адаптация, която дава приоритет на доставката на глюкоза към тъкани като епителните клетки на млечната жлеза, в които усвояването е независимо от инсулина [8]. В тази ситуация конкуренцията за доставка на енергия между млечната жлеза и имунната система е неизбежна, тъй като и двете разчитат на едни и същи основни субстрати и двете са основни потребители на енергия. Квидера и др. [24] демонстрират, че активирането на пълен имунен отговор при крави изисква 2,5 до 3,1 Kg глюкоза на ден. Това е подобно на изчисленото изискване от 2,7 kg/ден глюкоза, поета от епителните клетки на млечната жлеза за производство на мляко от 40 kg/ден [8].

Тъканната мобилизация също е свързана с повишени циркулиращи концентрации на неестерифицирани мастни киселини (NEFAs), бета-хидроксибутират (BHB) и намален IGF-1, всички от които допринасят за имунна дисфункция [5,9,10,20 ]. Например, нашето скорошно проучване илюстрира, че адхезията на левкоцитите клетка към клетка се инхибира, когато концентрацията на NEFA надвишава 750 µM [25]. Въпреки че тъканната мобилизация е нормална адаптация на бозайниците за поддържане на лактацията, много проучвания показват, че тежкият NEB има голямо влияние върху последващата способност на кравата да забременее своевременно [26]. Това може да се дължи на различни фактори, включително забавяне на възстановяването на подходяща маточна среда [2]; продължителен период на ановулация [27], лоша интрафоликуларна среда [28] и влошено качество на ооцитите [29]. Млечните юници обикновено се отелват при около 90% от зрялото си телесно тегло [30]. Предишното ни проучване показа, че първораждащите (PP) крави имат по-високи концентрации на инсулин, IGF-1 и лептин в кръвообращението си, по-ниски концентрации на кръвни метаболити (BHB, NEFAs и урея) и по-високи концентрации на глюкоза от многораждалите (MP ) крави най-малко 7 седмици след отелване [31,32]. Това показва, че има по-малко разединяване на соматотрофната ос в ранна лактация при PP крави в сравнение с MP крави, свързано с по-слабо приоритизиране на хранителни вещества към млечната жлеза, което позволява продължаване на растежа. Профилите на генната експресия в циркулиращите левкоцити също се различават между PP и MP крави по време на ранна лактация [33].

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Оптимизирането на управлението на храненето по време на сухия период може да увеличи приема на сухо вещество (DMI), да намали честотата на перипартуриентни заболявания и да подобри плодовитостта [34]. Има общи насоки за това как да се намали рискът от заболяване, свързан с храненето и управлението [35]. Въпреки това има малко налична информация относно диетичните формули за отделните крави с метаболитен дисбаланс по време на следродилния период, които могат да подобрят имунната функция, да намалят честотата на заболяването и да подобрят последващата репродуктивна способност. Формулирането на диети с висок потенциал за прием на хранителни вещества е практичен подход [36]. В настоящото проучване на кравите в ранна лактация бяха предложени диети с нисък (LC), среден (MC) или висок концентрат (HC) въз основа на пропорциите на концентрата към силажа от трева и ефектите върху метаболитното здраве и болести и системния имунитет ( чрез оценка на глобалните профили на експресия на циркулиращи левкоцитни гени). Данните от PP и MP крави бяха анализирани отделно, за да се избегне всякакъв объркващ ефект, произтичащ от паритета. Нашата хипотеза беше, че диетите с висока концентрация ще подобрят имунната функция и ще допринесат за плодовитостта.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

2. Резултати

2.1. Ефект на диетите върху приема на сухо вещество, млечния добив, енергийния баланс и кръвните метаболити

Параметри на млякото, телесно тегло (BW), DMI, оценка на телесното състояние (BCS), енергиен баланс (EBAL) и кръвни метаболити както за MP, така и за PP крави на около 14 дни в мляко (DIM) са обобщени в таблица 1. DMI за MP кравите се различават значително между трите хранителни групи в реда на HC > MC > LC (p < 0.01–0.0{{11 }}1). Добивът на мляко при MP кравите, получаващи HC диети, е значително по-висок от тези, получаващи LC диети (p < 0.05). Разликата в енергийно коригирания добив на мляко (ECM) между LC и HC групите беше значителна (p < 0.05), с междинни стойности в MC групата. Стойностите на EBAL и в трите MP групи бяха отрицателни, но тези при кравите MC и HC бяха значително по-добри (по-малко отрицателни), отколкото при кравите LC (p <0,01). Циркулиращите концентрации както на глюкоза (p <0,01), така и на IGF-1 (p <0,001) при HC кравите са значително по-високи, отколкото при LC кравите. МР кравите, предлагани на диети с HC, също произвеждат по-малко циркулираща урея (p <0,001), BHB (p <0,05) и NEFA, отколкото тези, предлагани на диети с LC с концентрации LC > MC > HC, въпреки че разликите в концентрациите на NEFA между диетичните групи не са били статистически значими.

Таблица 1. Общ прием на сухо вещество, параметри на млякото, телесно тегло, енергиен баланс, оценка на телесното състояние и кръвни метаболити около 14 дни след отелването, анализирани според паритета и диетата 1,2

При PP кравите, тези, получаващи MC или HC диета, имат по-висок DMI от тези, получаващи LC диета (p < {{0}}.01). Добивите на мляко не се различават значително. EBAL е положителен при крави, предлагащи MC или HC диети, докато за тези, предлагани на LC диета, той е отрицателен. Разликите в EBAL между HC и LC PP крави са значими (p <0,05). От измерените метаболити само концентрациите на урея се различават между групите, като са по-ниски при HC кравите (LC > MC > HC, p < 0,001 за LC спрямо HC или MC).

2.2. Ефект на диетите върху възпалителните параметри

Ефектите от диетата върху възпалителните параметри, измерени в матката и млечната жлеза, са представени в Таблица 2. При PP кравите, съотношението на полиморфонуклеарни левкоцити към маточни епителни клетки (PMNs: UECs), събрани от матката с помощта на циточетка, е значително по-високо за кравите на HC в сравнение с LC диета (p < 0.05). При MP кравите тенденцията беше в същата посока, с LC < MC < HC, но не постигна статистическа значимост. В млякото MP кравите на LC диета имат значително по-висок SCC от тези на MC или HC диети (p < 0.05), докато при PP кравите незначителната тенденция е в обратната посока . Концентрациите на N-ацетил- -d-глюкозаминидаза (NAGase) и лактат дехидрогеназа (LDH) в млякото, млечни ензими, показателни за мастит, следват същите общи тенденции като стойностите на SCC, но няма значими разлики. Тези резултати бяха подкрепени от здравните досиета. MP кравите на HC диета не са имали случаи на мастит (0/15), докато 4/14 (28,6%) от кравите на LC диета са диагностицирани с клиничен мастит в рамките на 16 дни след отелването. Тенденцията отново беше в обратна посока за PP кравите с една от шест (16,7%) на LC диета с клиничен мастит в сравнение с един случай на клиничен и два на субклиничен мастит на HC диета (50%).

Таблица 2. Възпалителни параметри на около 14 дни след отелването според паритета и диетата 1,2.

2.3. Данни за плодовитостта

Подробности за данните за плодовитостта са дадени в таблица 3. За MP кравите, тези на LC диета отнеха малко повече време, за да забременеят и изискваха повече услуги за зачеване, отколкото HC кравите (2,4 ± 0.42 срещу 1,6 ± 0.23), въпреки че повече от HC кравите или не са били обслужвани (решение на ръководството) или изобщо не са успели да забременеят (6{{10}}.0% спрямо 71,4%). Нито една от тези разлики обаче не беше значителна. За PP кравите беше вярно обратното, като LC кравите имаха най-кратък интервал до зачеване от 29 дни (p < {{20}}.05), като пет от шестте животни заченаха за първи път . За разлика от това, половината от HC групата или не са били обслужвани (n=2) или не са успели да заченат (n=1), като трите, които са заченали, са изисквали 2,0 ± 0,41 услуги на зачеване. Това доведе до групата на HC със значително по-висок резултат "в прасеца" (ICB) (p <0,05).

Таблица 3. Данни за плодовитостта според паритета и диетата 1,2

2.4. Транскриптомни профили на левкоцитите при крави, получаващи различни пропорции концентрат

Референтният говежди геном на ARS-UCD 1.2, предоставен от RefSeq (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/assembly, достъпен на 1 май 2022 г.) съдържа 35 158 гена, от които 19 001 левкоцитни гени могат да бъдат количествено измерими, когато секвенцията гласи в файловете FASTQ бяха нанесени към него. Графиките на вулкани, показващи профилите на експресия както при MP, така и при PP кравите, получаващи трите различни диети, са представени на Фигура 1. При MP кравите имаше 173 диференциално експресирани гена (DEG) при сравнението между HC и LC, 126 между MC и LC и 68 за HC срещу MC (допълнителен файл S1A–C). Диаграмата на Venn илюстрира, че нито един ген (общ DEG) не е значим и при трите диетични сравнения (Фигура 2А). При PP кравите имаше 460 DEG при сравнението на HC срещу LC, 178 между MC срещу LC и 128 между HC срещу MC (допълнителен файл S2A–C). Само един общ ген (DCN, промяна на гънките (FC)=−7.3) е значим и при трите диетични сравнения (Фигура 2B). Това кодира декорин, протеин, който играе роля в сглобяването на колагеновите фибрили. Като цяло беше забележимо, че по-голям брой DEGs бяха открити в диетичните сравнения на експресията на левкоцитен ген в PP, отколкото в MP кравите, въпреки по-малките размери на групата, като по-голямата част от тези гени бяха регулирани нагоре при HC диета. Освен това, имаше малко припокриване в гените, идентифицирани между различните възрастови групи, както е илюстрирано в диаграмите на Venn на фигура 3. Това предполага, че диетите имат различни ефекти върху левкоцитния транскриптом при PP и MP крави. И в двете възрастови групи най-големите разлики бяха открити между кравите, предлагани на LC срещу HC диети, така че ние се съсредоточихме върху това сравнение в следващите анализи.

Фигура 1. Вулканични графики показват профилите на експресия както при MP, така и при PP кравите, получаващи три различни диети. (A) MP крави HC срещу LC, (B) MP крави HC срещу MC, (C) MP крави MC срещу LC, (D) PP HC срещу LC, (E) PP HC срещу MC и (F) ) PP MC срещу LC. HC: висок концентрат (n=6 в PP крави и n=14 в MP крави), MC: среден концентрат (n=5 в PP крави и n=15 в MP крави ) и LC: нисък концентрат (n=6 в PP крави и n=14 в MP крави). Промените в сгъването бяха лог2-трансформирани. Зелените точки показват регулираните надолу гени с p (BH) < 0.05 и кратните промени По-малки или равни на -1,5, а червените точки показват регулираните нагоре гени с p (BH) < {{ 16}}.05 и промени на сгъване По-големи или равни на 1,5. Оранжевите точки показват гените с p (BH) <0,05, но абсолютни кратни промени <1,5.

Фигура 2. Диаграми на Venn, показващи диференциално експресираните гени от циркулиращите левкоцити между трите диетични групи при (A) многораждали (MP) крави и (B) първораждащи (PP) крави. HC: висок концентрат (n=6 в PP крави и n=14 в MP крави), MC: среден концентрат (n=5 в PP крави и n=15 в MP крави ) и LC: нисък концентрат (n=6 в PP крави и n=14 в MP крави).

Фигура 3. Диаграми на Venn, показващи диференциално експресираните гени чрез циркулиращи левкоцити между PP и MP крави при сравнения на (A) висок концентрат (HC) с нисък концентрат (LC); (B) HC със среден концентрат (MC) и (C) MC с LC. HC: n=6 при крави PP и n=14 при крави MP, MC: n=5 при крави PP и n=15 при крави MP и LC: n {{5 }} в PP крави и n=14 в MP крави

2.5. Сравнение на профилите на експресия на левкоцитен ген между многоплодни крави, получаващи диети с висок или нисък концентрат

Първите 20 регулирани нагоре и надолу DEG, класирани по стойностите на p (коригирани на BH) при MP крави, хранени с HC, в сравнение с тези, хранени с диета LC, са дадени в Допълнителен файл S1D, E. Сред регулираните нагоре DEG, повечето са участвали в GO функциите на процеса на имунната система, метаболизма и отговора на стимул, като много кодиращи протеини имат множество роли. Например, ALAS2 (кодиращ 50 -аминолевулинат синтаза 2) има роля в метаболитния процес, реакцията на стимули и процеса на развитие. COL1A1 (колаген тип I алфа 1 верига) и DAB2 участват в метаболизма, реакцията на стимул, многоклетъчния организъм, движението и развитието. Топ 20 понижено регулирани гени илюстрират ясна тема за промени в имунитета с 14 свързани DEG. От тях DMTB1, FGA, FGB и TF кодират антимикробни пептиди, ALB и TF кодират отрицателни протеини в острата фаза (АРР), а FGA и FGG кодират положителни АРР. Осем гена играят роля в метаболизма и 10 участват в отговор на стимул.

растение цистанче, повишаващо имунната система

Левкоцитните DEGs, получени от сравнението на HC с LC групата, след това бяха подложени на анализ на обогатяване с GO. 76-те повишени DEG бяха значително обогатени с 208 функции, от които първите 20 въз основа на резултатите за обогатяване са показани на Фигура 4А. Те са свързани с различни аспекти на клетъчната функция, като отгоре се свързва тромбоцитен растежен фактор. Много функции са свързани с метаболизма на протеини и аминокиселини (включващи APLP1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, HTR1B и P2RY12 в повечето от тях), биоминерализация и обработка на колаген (включващи COL1A1, COL1A2, SPP1 и TUFT1) и клетъчна комуникация. За разлика от това, най-добрите функции на 97-те понижени DEG имат ясна тема за различни процеси на имунна защита (Фигура 4B), които са свързани предимно с 20 DEG. От тях FGA (положителен APP) беше регулиран надолу с 85-кратно в сравнението HC срещу LC. Инструментът за браузър GO обобщава биологичните функции както на регулираните нагоре, така и надолу DEG в осем значими категории (Таблица 4). С изключение на биоминерализацията, всички други биологични функции, особено тези, свързани с имунната защита, са свързани предимно с понижените DEG.

Фигура 4. Топ 20 GO функции, свързани с DEG, получени от сравнения на HC срещу LC. (A) MP регулирани нагоре DEG, (B) MP регулирани надолу DEG, (C) PP регулирани нагоре DEG и (D) PP регулирани надолу DEG.

Таблица 4. Обобщение на основните функции за обогатяване на GO на левкоцитни DEG в сравнение между кравите, които са раждали многократно, получаващи диети с висок (n=14) и нисък (n=14) концентрат в ранна лактация.

Таблица 4. Прод.

Комбинираните регулирани нагоре и надолу DEG (n=173) бяха значително обогатени с 23 KEGG пътя, които бяха свързани главно с различни имунни и метаболитни процеси (Таблица 5). Каскадите на комплемента и коагулацията бяха на върха с осем понижени DEG (CFB, FGA, FGB, FGG, KNG1, PROC, SERPINA1 и VTN). Възпалителният път на NOD-подобно сигнализиране се свързва с шест DEG (IFNB1, MAPK10, OAS1X, OAS1Y, OAS1Z и OAS2), от които всички с изключение на MAPK10 са регулирани надолу. Пътят на смилане и абсорбция на протеини съдържаше шест DEG, от които три (COL1A1, COL1A2 и COL3A1) бяха регулирани нагоре и три регулирани надолу (CELA2A, COL5A3 и ELN). Пет регулирани надолу DEG бяха включени в сигналния път на рецепторите, активирани от пероксизомен пролифератор (PPARs) (APOA2, APOC3, FABP1, HMGCS2 и PCK1). Пътищата на взаимодействие извънклетъчен матрикс-рецептор, фокална адхезия и сфинголипидно сигнализиране са включени в поддържането на клетъчната и тъканната структура.

Таблица 5. Значителни пътища, идентифицирани чрез обогатяване на пътя на KEGG, свързано с диференциално експресирани левкоцитни гени при многораждали крави, предлагащи диета с висок концентрат (n=14) в сравнение с тези, предлагани диета с нисък концентрат (n=14).

2.6. Сравнение на моделите на експресия на левкоцитен ген между първородни крави, получаващи диети с висок или нисък концентрат

Най-добрите 20 циркулиращи левкоцитни DEG в PP кравите, хранени с HC, в сравнение с диетите с LC, са изброени в Допълнителен файл S2D, E. Имунните и метаболитните процеси преобладават над биологичните функции на най-високо регулираните DEG, съдържащи съответно 11 и 12 DEG. Сред тях ACSL6, MMP9 и SLC11A1 участват в пролиферацията на левкоцитите, а ACSL6, ADGRG3, COL1A2, DUSP1, HCK, MMP9 и PADI4 в процеса на развитие. SLC40A1 е основен преносител на желязо, който играе ключова роля в балансирането на клетъчните и системните нива на желязо. Някои от тези DEG кодират протеини с множество функции. Например MMP9, DUSP1, SLC11A1 и COL1A2 са свързани с повечето от горните GO функции. Биологичните функции на регулираните отгоре надолу DEG бяха по-разнообразни. Имаше осем DEG, участващи в процеса на имунната система, пет играещи роля в метаболизма и две, свързани както с пролиферацията на левкоцитите, така и с процеса на развитие (EPCAM и FCRL3). Отново, някои DEG, например CD96 и FCRL3, кодират протеини с множество роли.

При PP кравите, 382 повишени DEG, получени от сравнението HC срещу LC, са значително свързани с 690 GO функции, като първите 20 са представени на Фигура 4C. Всички те включват 116 DEG (допълнителен файл S2F) с различни имунни дейности. Основната функция беше сигналният път на рецептора на клетъчната повърхност. Това се свързва с 43 DEG, които включват гени, кодиращи много рецептори за имунни лиганди, като CXCR1, CXCR2, IL17RD и IL1RAP. Тази функция има шест значими подфункции, включително липополизахарид (LPS)-медииран сигнален път (PTAFR, TLR4 и SCARB1) и регулиран от имунния отговор рецепторен сигнален път на клетъчната повърхност. Най-важната подфункция в регулацията на многоклетъчния организъм е регулацията на производството на цитокини, с 24 повишени DEG, като MARK13, LTF и TLR4. Имаше по-малко понижени DEG (само 78), които бяха свързани с 298 значими GO функции, с по-ниски резултати за обогатяване и по-разнообразни биологични процеси. Фигура 4D показва първите 20 функции. Редица от тях са свързани с аспекти на имунитета, като клетъчна адхезия, регулиране на производството на медиатор на имунния отговор, отговор на LPS и отговор на молекули от бактериален произход. Други са свързани с поддържането на хомеостазата, като клетъчна повърхност, цитолиза, трансмембранен транспорт и ендопептидаза от серинов тип. Обобщението на значимите биологични функции, свързани както с регулираните нагоре, така и с понижените DEG, генерира седем категории (Таблица 6), с процеса на имунната система на върха и повечето от другите функции, също свързани с имунната защита. Например, придвижването е обогатено от DEG с хемотаксични и имунни свойства и междувидово взаимодействие между организмите, което включва убиване на нахлулите патогени. Както клетъчният процес, така и биологичната регулация са свързани с голям брой DEG. Клетъчният процес (n=239 DEG) включва много подфункции, свързани с клетъчна адхезия, убиване на клетки, активиране на имунни клетки и пролиферация на клетъчна популация. Биологичното регулиране (125 DEGs) също включва много имунни дейности, като регулиране на процеса на имунната система, движение и реакция на стимул. Всички тези функции съдържат предимно повишени DEG на HC диетата.

Таблица 6. Обобщение на основните функции за обогатяване на GO на DEG в сравнение между първородните крави, на които са предлагани диети с висок (n=6) и нисък (n=6) концентрат в ранна лактация.

Таблица 6. Прод.

Комбинираните регулирани нагоре и надолу DEGs (460) в PP кравите са обогатени с 35 значими KEGG пътища (Таблица 7). Много от тях са свързани с метаболитни процеси, включващи аминокиселини (валин, левцин, изолевцин, аргинин и глутатион), протеини, липиди (арахидонова киселина, глицеролипид и холестерол), витамин B6 и някои хормони (алдостерон, кортизол, тиреоиден и растежен хормон). ). Тези метаболитни пътища са предимно обогатени с DEGs, регулирани нагоре при HC диетата. Например, биосинтезата на аминокиселини беше свързана с пет регулирани нагоре DEG (ARG2, ASS1, GPT2, SDS и SDSL), пътят на синтеза, секрецията и действието на хормона на растежа беше обогатен с шест регулирани нагоре (ADCY6, CREB3L2, CREB5, FOS , MAPK13 и SOCS3) и един понижен (BCAR1) DEG, а метаболизмът на арахидоновата киселина съдържа пет повишени DEG (CYP2J2, GGT5, GPX3, PLB1 и TBXAS1). Няколко пътя, свързани с имунния/възпалителния процес, също бяха значително обогатени, отново главно с повишени DEG. Те включват хемокин, MAPK и TNF сигнални пътища и каскади на комплемента и коагулацията. Например хемокиновият сигнален път съдържаше осем регулирани нагоре (ADCY6, CCL16, CCR1, CXCL13, CXCR1, CXCR2, GNG7 и HCK) и два понижени DEG (BCAR1 и CCR5), сигналният път на TNF съдържаше шест регулирани нагоре DEG (CREB3L2, CREB5) , FOS, MAPK13, MMP9 и SOCS3), а сигналните пътища на MAPK съдържат 12 регулирани нагоре DEG, включително IL1A, MAP3K6 и MAPK13.

Таблица 7. Значителни пътища, идентифицирани чрез обогатяване на пътя на Kegg, свързано с диференциално експресирани левкоцитни гени при първородните крави, предлагащи диета с високо съдържание на концентрат (n=6) в сравнение с тези, предлагани на диета с нисък концентрат (n=6).

3. Дискусия

Следродилните млечни крави имат хомеостатични механизми за контролиране на разпределението на хранителните вещества между лактацията и други важни жизнени функции, като имунитет и растеж [8]. Тъканната мобилизация е нормална адаптация на бозайниците за поддържане на лактацията, но някои крави стават метаболитно дисбалансирани [35,37]. Такива животни изпитват прекомерна мобилизация на мастната тъкан, инсулинова резистентност и системно възпаление, което допринася за увредения имунитет, често наблюдаван по това време [38]. Това е свързано с възпалителни медиатори като TNF и IL6 [39,40]. На 14-ия ден след отелването, когато са събрани циркулиращите левкоцитни проби в това изследване, клетките са били изложени на период на възпалителна стимулация. Ние демонстрирахме с помощта на секвениране от следващо поколение и биоинформатичен анализ, че диетите с различни пропорции на концентрат произвеждат различни ефекти върху циркулиращия левкоцитен транскриптом в PP и MP крави в ранна лактация. Това е свързано с разликите в тяхното здраве и плодовитост. Тази информация добави нови открития към предишния ни доклад за диетичните ефекти върху производството на мляко и имунитета [32].

3.1. Сравнение на ефектите от диетите с висок и нисък концентрат при многораждали крави

MP кравите на диети с HC имат по-висок DMI от кравите MC и LC и това е свързано с по-високи циркулиращи концентрации както на глюкоза, така и на IGF{{0}}. Това доведе до това, че HC кравите са в по-малко тежък NEB и произвеждат повече мляко. Диетата HC е формулирана така, че да отговаря на енергийните и протеинови нужди както за лактацията, така и за поддържането на телесната хомеостаза, а измерванията на метаболита потвърждават, че техният метаболитен статус наистина е по-добър, отколкото при LC кравите, с по-малко изискване за мобилизация на тъканите за посрещане на енергийните нужди. Това би трябвало да помогне за ускоряване на разрешаването на следродилните възпалителни процеси, тъй като много възпалителни заболявания в ранна лактация са свързани с или причинени от метаболитни нарушения [38] и ние показахме по-рано, че възпалението на матката се разрешава по-бързо при крави с по-добър статус на енергиен баланс [2]. В настоящото проучване няма разлика в съотношението на PMNs към епителните клетки в лумена на матката според диетата при MP крави. Този индекс често се приема като индикатор за цитологичен ендометрит [41]. Разлики в зависимост от диетата обаче се наблюдават в млечната жлеза, тъй като LC кравите имат по-висок SCC и това е свързано с по-голяма част от тях, изпитващи клиничен мастит по време на първите 16 DIM (28,6% срещу 0% в LC срещу HC групи).

Повечето от DEG, идентифицирани в анализа на левкоцитния транскриптом, са включени в имунни и/или метаболитни процеси, както се очаква в популация от имунни клетки. Най-значимият път на KEGG беше каскадата на комплемента и коагулацията, която включваше шест от най-силно понижените гени в HC кравите. От тях CFB кодира фактор В на комплемента, компонент на алтернативния път на активиране на комплемента. FGA, FGB и FGG кодират три субединици на коагулационния фактор фибриноген, ключов компонент на кръвния съсирек, който също е важен при свързването на бактериите с тромбоцитите [42]. Формата на кининоген с високо молекулно тегло, кодирана от KNG1, също е от съществено значение за коагулацията на кръвта, а кининогенът освобождава брадикинин, пептид с различни функции, включително антибактериална и противогъбична активност. Витронектинът, кодиран от VTN, също участва в регулирането на пътя на кръвосъсирването и заздравяването на рани, докато неговият хепарин-свързващ домен осигурява антимикробни свойства. PROC кодира плазмен гликопротеин, чиято активирана форма съдържа серин протеазен домен, който функционира при разграждането на активираните форми на коагулационни фактори V и VIII, докато SERPINA1 кодира серин протеазен инхибитор, чиито цели включват плазмин, тромбин и плазминогенен активатор. Повишаване на каскадата на комплемента и коагулацията преди това е показано в тъкан на млечната жлеза като ранен отговор на гостоприемника към E. coli или Staph. инфекция с ауреус [43]. Тъй като този път е по-силно изразен при кравите на LC диета, това подкрепя доказателства за по-голяма честота на мастит при тези животни.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Друга основна функция, обобщена от браузъра GO, беше процесът на убиване на патогени (междувидово взаимодействие между организмите), което беше свързано с 14 понижени DEG в HC кравите (Таблица 4). Това включва редица гени, участващи в антивирусната активност (IFI6, IFNB1, ISG15, MX2, OAS1Y, OAS1Z, OAS2 и RSAD2), които са експресирани на по-ниски нива. От тях IFNB1 кодира интерферон бета 1, докато другите са всички интерферон-стимулирани гени [44,45]. Всички те също са част от сигналния път на NOD-подобния рецептор (NLR). NLR са цитозолни рецептори за разпознаване на образи, които се активират от различни не-самостоятелни компоненти, включително бактериален пептидогликан, потенциално иницииращи NF-kappa B-/AP-1-зависима експресия на провъзпалителни цитокини, експресия на интерферони тип I, автофагия и възпаление [46]. Нашето скорошно проучване показа, че този път е регулиран нагоре в левкоцитите от заразени с E. coli крави [47]. Друг идентифициран ген е MPO, кодиращ миелопероксидаза, ензим, съхраняван в азурофилни гранули на PMN и макрофаги. Той се освобождава в извънклетъчната течност по време на възпалителни процеси и се използва като маркер за възпаление и оксидативен стрес [48]. IL1R2 кодира член на семейството на рецепторите на интерлевкин 1 и е един от най-значително понижените DEG, идентифицирани при MP крави. Това може да свърже IL1A, IL1B и рецептора на интерлевкин 1, тип I (IL1R1/IL1RA), но действа като примамващ рецептор за инхибиране на активността на лиганда.

Генът с най-значима диференциална експресия между MP крави на различни диети беше FCER1A, с по-ниска експресия при HC кравите. Това кодира субединица на IgE рецептора, който е инициатор на алергични реакции, които може да са еволюирали, за да насърчат защитата на гостоприемника срещу паразити чрез освобождаване на медиатори като хистамин [49]. Интересното е, че FCER1A е един от само 18 гена, чието ниво на експресия е идентифицирано като дискриминиращо между плодовитостта на говежди юници [50]. Неговата точна роля при говедата остава неопределена, но при изпитване на ваксина върху телета, експериментално заразени с икономически важния паразитен нематод Ostertagia ostertagi, нивата на неговата експресия в кръвта корелират положително с броя на мастоцитите и отрицателно с броя на червеите [51]. Три други повишени гена в HC кравите с известна имунна функция са ALAS2, GZMB и LIF. ALAS2 кодира 50 -аминолевулинатна синтаза 2, еритроидно-специфичен митохондриално разположен ензим, който катализира първата и ограничаваща скоростта стъпка в биосинтетичния път на хема. Хемът е основен кофактор в различни ключови процеси, включително транспорт на кислород, докато мутациите в този ген са свързани с различни човешки заболявания, включително анемия [52]. GZMB кодира препропротеин, който се секретира от естествени клетки убийци и цитотоксични Т лимфоцити и се обработва за генериране на активна протеаза, която индуцира апоптоза на целевите клетки и също така обработва цитокини и разгражда извънклетъчните матрични протеини [53]. Инхибиторният фактор на цитокинова левкемия, кодиран от LIF, първоначално беше идентифициран чрез участие в диференциацията на макрофагите, но също така е доказано, че играе важна роля в развитието на ембриона и установяването на бременност при различни видове, включително говеда [54].

DEGs, получени от сравнението на HC срещу LC при MP крави, също са обогатени с няколко значими пътя, свързани с метаболизма на глюкоза, протеини и мастни киселини. Те включват четири понижени DEG, участващи в PPAR сигнални пътища (APOA2, APOC3, FABP1 и PCK1). В това проучване са открити три основни изоформи на PPAR (A, D, G) в популацията на левкоцитите. Въпреки че експресията на самите PPARs не се повлиява от диетата, този път може да повлияе на експресията на гени, участващи в метаболизма на глюкозата и липидите, диференциацията на адипоцитите и възпалителните реакции [55,56] и допринася за метаболитната адаптация към ограничено снабдяване с хранителни вещества чрез индуциране на гени, участващи в -окисление [57]. Метаболитният път на ретинола също се регулира надолу при HC кравите, с по-ниска експресия на RBP4 и TTR (съответно кодиращ ретинол-свързващ протеин и транстиретин), като и двата действат като транспортери на ретинол в кръвта. Взаимодействието на ретинол с PPAR сигналния път влияе върху транскрипцията на много други гени надолу по веригата [58]. APOA2 и APOC3 заедно с APOH също са част от метаболитния път на холестерола. Холестеролът е основен компонент на плазмената мембрана и влияе както върху нейната организация, така и върху нейната функция [59,60]. Последните проучвания подчертават нововъзникващата роля на холестерола като важен модулатор на вродената и адаптивна имунна активност [61].

Пътят на гликолиза/глюконеогенеза се свързва с три понижени DEG в кравите, хранени с HC (ADH1C, ALDOB и PCK1). От тях PCK1 кодира фосфоенолпируват карбоксикиназа 1, която действа като основна контролна точка за регулиране на глюконеогенезата. Този ензим, заедно с GTP, катализира образуването на фосфоенолпируват от оксалоацетат, с освобождаване на въглероден диоксид и GDP. Активирането на имунни/възпалителни пътища насърчава транскрипцията на глюконеогенни гени чрез toll-like рецептор 4 (TLR4) [62]. Това може да накара имунните клетки да превключат своя глюкозен метаболизъм от окислително фосфорилиране към гликолиза, за да произведат както енергия, така и хранителни вещества, необходими за пролиферацията и производството на имунни молекули [12,63]. Това води до повишено търсене на глюкоза, което се конкурира с изискването за производство на лактат [64].

В обобщение, разликите в генната експресия между MP кравите на HC и LC диети предоставят доказателство за по-високо регулирана имунна активност и възпаление при LC кравите. Това е придружено от по-висока честота на мастит. Обратно, гени, кодиращи някои протеини, които вероятно ще са от полза за здравето и плодовитостта, като ALAS2 и LIF, са регулирани нагоре в HC кравите. Това подкрепя измерените метаболитни индекси, показващи, че е имало подобрен статус на EBAL при MP крави на HC диети, което вероятно е помогнало за защитата им срещу развитието на инфекциозни или метаболитни заболявания.

3.2. Сравнение на ефектите от диетите с висок и нисък концентрат при първородните крави

Подобно на MP кравите, PP кравите на HC диета също имат по-висок DMI, с около 4 kg/d, но добивът на мляко не се увеличава значително. Няма значителни разлики в циркулиращите концентрации на глюкоза, NEFA, BHB или IGF-1, като само уреята е по-висока при LC диета. Обратно, има по-значими разлики в експресията на левкоцитния ген между диетичните групи, отколкото при MP кравите, с 460 спрямо 173 DEG, идентифицирани в сравненията на HC срещу LC, от които 83% са регулирани нагоре при PP крави на HC диета. Само малка част от DEGs се припокриват между двете възрастови групи (Фигура 3), което предполага, че промените във функцията на левкоцитите спрямо ранната лактационна диета са по-чувствителни при PP крави, отколкото при MP крави. Очаквахме, че HC диетата ще бъде от полза за PP кравите чрез увеличаване на техния DMI и пълно задоволяване на изчислените хранителни изисквания за неразградими и метаболизируеми протеини. EBAL наистина беше подобрен при HC диетата, но анализът на генната експресия показа много по-голяма регулация на гените, участващи в имунната защита. Кравите, хранени с HC, също имат по-високо съотношение на PMN: UEC в техните матки, заедно с числено по-голям SCC и повече случаи на мастит. Това предполага, че те всъщност са били повече, а не по-малко предразположени към болести. По-рано открихме, че неутрофилите, събрани от PP крави в това проучване през първите три седмици от лактацията, имат значително по-висок фагоцитен индекс и индекс на окислителен взрив в сравнение с MP кравите, но 2-въздействията на диетата и паритета върху тези измервания не са докладвани [32].

Процесите на имунната система, идентифицирани при сравнението на HC срещу LC, включват регулиране на рецептора на клетъчната повърхност и сигнални пътища за разпознаване на образи, хемотаксис, производство на цитокини и миграция на левкоцити при крави, хранени с HC. Идентифицираните DEGs са свързани с различни имунни защитни механизми, включително различни антимикробни пептиди (AMP) (CATHL6, CXCL13, DEFB1, LTF, PGLYRP1, PGLYRP4, SA100A8, SA100A9, S100A1 и SLC11A1). Те могат не само да убият нахлулите организми директно, но и да помогнат чрез модулиране на други имунни и антимикробни процеси [65–67]. Повишена регулация на антимикробните пептиди в транскриптомните профили на левкоцитите преди това е демонстрирана при крави с клиничен мастит [47,68] и метрит/ендометрит [69,70]. Левкоцитната адхезионна функция се свързва с 16 регулирани нагоре и пет регулирани надолу DEG при животни, хранени с HC. Адхезията на левкоцитите към стените на капилярите е жизненоважна първа стъпка в позволяването им да мигрират от кръвта и трафика към местата на тъканно увреждане, инфекция и възпаление [71]. Взаимодействията както клетка-клетка, така и клетка-матрикс влияят върху фенотипа на левкоцитите и дисрегулацията на адхезионните пътища може да доведе до персистиращо активиране на левкоцити с неразрешено възпаление [72]. От идентифицираните повишени DEG, ADAM8, ANGPTL3, CD24, ICAM3 и THY1 участват в екстравазацията [73,74], докато FN1, NRP1, TNFAIP6 и VCAN имат потенциална роля в трафика на левкоцитни клетки и функционират във възпалени тъкани [72, 75]. Гените, кодиращи хемокиновите рецептори CXCR1 и CXCR2, също бяха регулирани нагоре в кравите, хранени с HC; те са важни както за стимулиране на хемотаксиса на PMN към местата на инфекция, така и за активиране на биохимични процеси, които убиват нахлуващите бактерии [76].

От регулираните надолу гени, свързани с адхезията при крави, хранени с HC, BCAR1 кодира многофункционален протеин, известен като cas с участие в клетъчната подвижност, апоптозата и контрола на клетъчния цикъл [77]. Полиморфизмите в BCAR1 преди това са били свързвани с SCC и резистентност към мастит [78]. ADGRG1 (известен също като GPR56) кодира G протеин-свързан рецептор, който свързва колаген 3 и трансглутаминаза 2, и двата компонента на тъканната строма. Доказано е, че ADGRG1 играе роля в човешките естествени клетки убийци (NK), в които инхибира тяхната цитотоксичност [79]. Неговата собствена експресия се регулира надолу след индуцирано от цитокини активиране, което би съответствало на резултатите, показани тук. CD96 протеинът също действа като инхибиторен рецептор на контролна точка върху NK клетки [80]. Предишни проучвания върху промените в транскриптома на левкоцитите по време на преходния период също откриха промени в генната експресия, свързани с трансендотелната миграция, макар и с различни заключения, съобщавайки съответно за активиране след отелване [81] или инхибиране [82]. Нашият анализ също така идентифицира редица разлики в сигналните пътища на аминокиселинния метаболизъм при PP крави на HC диета в сравнение с тези на LC диета, свързани с ензими, кодирани от пет повишени DEG (ARG2, ASS1, GPT2, SDS и SDSL) . От тях ASS1 кодира аргинин сукцинат синтаза 1, която катализира предпоследния етап от биосинтетичния път на аргинин, докато ARG2 кодира аргиназа, катализирайки хидролизата на аргинин до орнитин и урея. L-аргининът може също да се превърне в азотен оксид, сигнална молекула, която играе ключова роля в патогенезата на възпалението [83]. Глутаминова-пирувинова трансаминаза 2 (GPT2) е митохондриален ензим, който катализира обратимото трансаминиране между аланин и 2-оксоглутарат за генериране на пируват и глутамат. Този ген се регулира нагоре при условия на метаболитен стрес и играе роля в задвижването на глюконеогенезата от метаболизма на аминокиселините [84]. Серин дехидратазата (SDS) кодира ензим, който превръща L-серин в пируват и амоняк, докато серин дехидратазата (SDSL) се предполага, че участва в пътя на биосинтезата на изолевцин от треонин.

Пътят на метаболизма на холестерола се свързва с четири повишени DEG при HC диета (ANGPTL3, LRP1, SCARB1 и SORT1). Това може да доведе до натрупване на холестерол в левкоцитите на кравите, хранени с НС, и да насърчи възпалението, включително увеличаване на TLR сигнализирането, активиране на инфламазома и по-голямо производство на моноцити и неутрофили в костния мозък и далака [85]. Пътят на метаболизма на арахидоновата киселина с пет повишени DEG (както е изброено по-горе) води до производството на каскади от про- и противовъзпалителни продукти, като простагландини и левкотриени [86]. Пътят на метаболизма на глицеролипидите се свързва с четири регулирани DEG (DGAT2, DGKG, GK и GPAT3), които кодират липогенни гени, участващи в синтеза на триацилглицерол. Натрупването му може да предизвика активиране на левкоцитите и възпаление [87,88]. Всички тези констатации подкрепят заключението, че HC диетата повишава метаболитните пътища на левкоцитите в PP кравите по начин, който повишава техните имунни/възпалителни реакции. Предишна работа при крави се е фокусирала главно върху сухостойния период и е показала, че прехранването и високият BCS по това време насърчават последваща липидна мобилизация и повишен възпалителен отговор по време на перипарталния период [34]. В настоящото изследване съотношението PMN: UEC на матката и тенденцията към по-висок SCC подкрепят предположението, че е имало повишена миграция на левкоцити към матката и млечната жлеза при PP кравите, получаващи HC диета. Въпреки че това е основен компонент на имунната защита, свръхактивирането може да допринесе за хипервъзпаление. Необходимо е допълнително проучване с по-голям размер на извадката, за да се потвърдят тези констатации.

3.3. Прилики в отговора на диетата при многораждали и първични крави

In terms of metabolic changes, both the MP and PP cows had higher circulating concentrations of urea when on the LC diet. Blood urea in both late pregnancy and early lactation may rise following mobilization of amino acids stored in skeletal muscle [89] or when dietary protein supply exceeds energy availability or protein needed [90], so these situations could have applied here. Elevated levels of urea have been associated with reduced fertility, but only at >4,5 mmol/L, по-високи от концентрациите, достигнати при животни, хранени с LC в настоящото изследване [91]. По отношение на данните за транскрипция на левкоцитния ген, интересно е да се отбележи, че DEGs, получени от сравнението HC срещу LC в двете възрастови групи, са обогатени с пътя на смилане и абсорбция на протеини, в който гените, кодиращи различни изоформи на колаген, играят важна роля . Сред тях имаше три колагенови гена с повишена регулация (COL1A1, COL1A2 и COL3A1) както в MP, така и в PP крави и един понижен (COL5A3) колагенов ген в MP крави. Техните стойности на експресия в пробите са малки, но разликите са значителни. Част от тази РНК може да идва от фиброцити, клетъчна популация, която включва само 0.1–0.5% от нееритроцитните клетки в периферната кръв [92,93]. Колагенът е отдавна установен имунен подобрител, участващ в много имунни/възпалителни процеси [93,94]. Неговото повишено производство в циркулиращата кръв чрез диетата с HC може следователно да повлияе на функцията на левкоцитите.

3.4. Последици за плодовитостта

Много предишни проучвания съобщават, че взаимосвързаният метаболитен и имунен статус и честотата на заболяването при кравите в ранна лактация имат голямо влияние върху последващата им плодовитост (напр. [38,95]). Нашата собствена работа показа, че MP крави с ниска концентрация на IGF-1 при 14 DIM е по-малко вероятно изобщо да заченат [37]. Съвсем наскоро съобщихме, че 63% от кравите с нисък IGF-1 по това време са имали повече от един здравословен проблем по време на първите си 35 DIM в сравнение със само 26% от кравите с висок IGF-1. Това включва повече животни с инфекции на матката и клиничен мастит [10]. Фоли и др. [69] прави разлика между здрави крави, които са успели да възстановят хомеостазата в рамките на 3 седмици след отелването, и други, които са имали по-тежък и продължителен възпалителен отговор, който след това е развил клиничен ендометрит. Връзката с периферната кръв е демонстрирана от Galvão et al. [96], които показват, че неутрофилите от крави с по-лош EBAL имат по-ниско съдържание на гликоген при седем DIM и тези животни са имали повече заболявания на матката, потенциално свързани с намалената наличност на окислителни горива за имунни отговори. Клиничният мастит в ранна лактация също е свързан с повишени нива на загуба на ембриони преди имплантация, с някои индикации, че ниският BCS допълнително увеличава риска [97]. Предложени са редица механизми, свързани с производството на цитокини и простагландини и други възпалителни медиатори, които биха могли да засегнат яйчника и/или да причинят неблагоприятна маточна среда [98,99]. Данните за плодовитостта, получени от кравите в нашето проучване, подкрепят констатациите, свързани с техния имунен статус и здраве в началото на лактацията. MP кравите на LC диета изискват числено повече S/C в съответствие с по-лошия им EBAL заедно с доказателства от анализ на левкоцитния транскриптом за по-активна имунна защита в ход, както се подкрепя от по-високата честота на мастит. Обратно, на PP кравите на HC диета отнема значително повече време за зачеване и по-малко забременяват в сравнение с кравите, хранени с LC. Те имаха повече доказателства за възпаление в ранна бременност, въпреки че изчисленият им EBAL беше по-добър. Понастоящем основните механизми, причиняващи тяхното лошо здравословно състояние и плодовитост, са несигурни, въпреки че открихме и доказателства, базирани на глобална генна експресия за повишено чернодробно възпаление и фиброза (Cheng, Little, Ferris, Takeda, Ingvartsen, Crowe и Wathes, непубликувани наблюдения) .

3.5. Ограничения на изследването

Имаше по-малко налични PP крави за група и това намали статистическата мощност на анализите, свързани с фенотиповете. Поради това е необходимо по-нататъшно проучване с по-голям размер на пробата, за да се потвърди диетичните ефекти върху репродукцията и заболяването. В настоящото изследване ние извлякохме цялата РНК от цяла периферна кръв, използвайки епруветки Tempus и неговата система за изолиране. Това предлага лесно събиране за широкомащабно проучване във ферма, но не разделя типовете клетки, които ще включват Т и В лимфоцити, естествени клетки убийци, тромбоцити, моноцити, гранулоцити (неутрофили, еозинофили и базофили) и фиброцити. Следователно представените данни за генна експресия са повлияни от възможните ефекти на лечението върху относителните пропорции на определени типове клетки в допълнение към техните индивидуални транскрипционни промени. Тези резултати също се основават на нивата на генна транскрипция и не включват информация за тяхната пост-транслационна обработка, която също ще повлияе колко функционален протеин се произвежда.

4. Материали и методи

4.1. Животни и диети

Всички процедури са извършени съгласно Закона за животните (научни процедури) от 1986 г. и са обхванати от лиценз на проекта на Home Office номер PPL2754 и сертификат за определяне на предприятието. Работата беше одобрена и от Комитета по етика и благосъстояние на Института за агро-храни и биологични науки (AFBI, Белфаст, Северна Ирландия, Обединеното кралство). Шестдесет и две млечни крави Холщайн-Фризия бяха наети от стадото на AFBI. Сред тях 18 бяха PP (лактация 1) и 44 MP с лактационни числа 2–7 (3,5 ± 1,28) и всички крави бяха здрави, прегледани от ветеринарния лекар. Теглото при отелване е 680 ± 62 (средно ± STD) kg за MP крави и 550 ± 39 kg за PP крави. След отелване кравите PP и MP бяха разпределени отделно в три диетични групи, като разпределението във всяка възрастова група беше балансирано за прогнозирана способност за предаване на мазнини плюс протеин (kg), BW преди отелване и BCS. MP кравите също бяха балансирани за паритет и предишна лактация 305-дневен добив на мляко. На кравите беше предложен или (1) нисък концентрат (LC, 30% концентрат плюс 70% тревен силаж, n=6 за PP и n=14 за MP); (2) среден концентрат (MC, 50% концентрат плюс 50% тревен силаж, n=6 за PP и n=15 за MP) или (3) висок концентрат (HC, 70% концентрат плюс 30% тревен силаж, n=6 за PP и n=15 за MP) диети (проценти на база сухо вещество). Концентратът за всяко третиране беше формулиран за постигане на обща концентрация на суров протеин (CP) в диетата за всеки от LC, MC и HC (съответно 152, 152 и 154 g/kg DM), докато изчислената обща метаболизируема енергия от диетата ( ME) съдържанията са 12,0, 12,4 и 12,8 MJ/kg DM. Изчислено е, че диетите доставят 1556, 1997 и 2420 g/d ефективен протеин, разградим в търбуха; 559, 733 и 888 g/d диетичен неразградим протеин и 1346, 1817 и 2275 g/d метаболизируем протеин съответно за LC, MC и HC. Достъпът до дажбите за лечение се контролира от система за хранене на Calan Broadbent (American Calan Inc., Northwood, NH, САЩ), свързана с електронна идентификационна система, която позволява ежедневното записване на приема на отделни крави. Диетите за всяко лечение бяха предложени на 107% от приема през предходните дни, за да се осигури ad libitum консумация. На всички крави също беше предложен допълнителен 0,5 kg концентрат при всяко доене чрез система за хранене в залата, за да се поддържа ефективен поток на кравите. Настоящото проучване беше част от по-широк проект и пълните подробности за предлаганите диети, управлението на храненето и състава на фуража бяха описани по-рано [32].

4.2. Събиране на данни за фенотип на крава

Телесното тегло се записва два пъти седмично, като се използват везни. BCS беше оценен на около 14 DIM [100]. Всички крави се доят два пъти дневно и дневните им добиви се записват. Пробите от мляко се анализират два пъти седмично с помощта на среден инфрачервен анализ за концентрации на протеини, мазнини и лактоза и се преброяват млечните соматични клетки. Допълнителни сутрешни проби от мляко (2 × 8 mL) се събират два пъти седмично и се съхраняват при -18 ◦C за анализ на LDH (EC. 1.1.1.27) и NAGase (EC 3.2.1.30), като се използват флуорометрични анализи [101]. Енергийно коригираната млечност (ECM; kg/ден) беше изчислена по методите, използвани в нашата група [32]. EBAL на всяка крава беше оценен с помощта на метода, описан по-рано [102].

Клиничният мастит се диагностицира с помощта на стандартни методи, базирани на ежедневни наблюдения за необичайни промени във външния вид на млякото (напр. люспи, съсиреци), качеството, добива на мляко и възпалителни реакции на млечната жлеза (зачервяване, подуване, топлина или болка). Показанията на SCC на млякото заедно с клиничните диагнози бяха използвани за категоризиране на кравите в три групи. Здравите крави се определят като имащи SCC < 100,000 клетки/mL мляко и без клинични симптоми. Субклинично маститните крави се определят като имащи SCC между 100,000 и 400,000 клетки/mL мляко и без видими клинични симптоми. Кравите, диагностицирани с клиничен мастит, имат SCC > 400,000 клетки/mL мляко и показват някои от горните клинични симптоми. Кравите са осеменени при наблюдаван еструс, като се използва нормална стадна практика и данните за плодовитостта за продължителността на последващата лактация или докато животното бъде умъртвено, са извлечени от записите на стадото. Докладваните данни включват дни до първото обслужване (DFS), дни до зачеване (отворени дни), услуги за зачеване и дела на кравите, които са заченали. В допълнение, данните за зачеването бяха оценени с помощта на 4-точка в прасеца по (ICB) резултат като (1)<100 days, (2) 100–200 days, (3) >200 дни, или (4) неуспешно зачеване или умъртвяване.

4.3. Цитологичен анализ на матката

Проба от маточна циточетка (Minitube, Minitüb GmbH, Tiefenbach, Германия) беше взета от всяка крава на около 14 DIM, за да се оцени ендометриалната цитология, както беше описано по-горе [103]. Двойно защитена циточетка се насочва ръчно през шийката на матката в матката, вътрешният предпазител се екструдира от външния предпазител и четката се завърта внимателно към стената на ендометриума. След това четката беше изтеглена във вътрешния предпазител и отстранена. Слайдовете за цитологично изследване бяха подготвени чрез търкаляне на циточетката върху чисто стъклено микроскопско предметно стъкло и фиксиране на пробата с Fisherbrand™ CytoPrep™ Cytology Fixative (Fishers Scientific, Blanchardstown, Ireland). Фиксираните слайдове бяха изпратени до UCD School of Veterinary Medicine, University College Dublin, Ирландия за обработка и оцветени с модифицирано оцветяване на Giemsa. Цитологичната оценка беше извършена чрез преброяване на PMNs UECs при увеличение 400 × (Leitz Labourlux-S, Wetzlar, Германия) и определяне на тяхното съотношение, осреднявайки броя на 10 полета с висока мощност на слайд.

4.4. Анализ на циркулиращите метаболити и IGF-1

На 14 ± 2 (средно ± STD) дни след отелването, 10 mL кръвни проби бяха събрани от югуларната вена на всички крави в епруветки с Na хепарин за плазма и обикновени епруветки за серум. След отделянето на плазмата или серума с центрофугиране, те се съхраняват при -20 ◦C до анализа. Концентрациите на плазмената глюкоза, урея, BHB, NEFA и холестерол се измерват с помощта на методите, описани по-рано [20,25]. Накратко, серумната концентрация на NEFA се определя с метода ACS-ACOD, като се използват комплекти NEFA C (Wako, Neuss, Германия). Плазмената глюкоза се определя количествено с ензимен метод (ADVIA 1800 Clinical Chemistry System, Siemens Healthcare Diagnostics, Ballerup, Дания). Серумният BHB се определя чрез измерване на абсорбцията при 340 nm поради производството на NADH при алкално рН в присъствието на BHB дехидрогеназа. Серумната урея се анализира чрез спектрофотометрия. Коефициентите на вариация (CV) във всички случаи са под три и четири процента, съответно, както за ниски, така и за високи контролни проби. Концентрациите на серумен IGF-1 се определят количествено с радиоимуноанализ след екстракция с киселинен етанол [104]. CV в рамките на анализа беше съответно 12,4, 7,5 и 9,9% за ниски, средни и високи контролни проби.

4.5. Екстракция на кръвна РНК

Кръвни проби за екстракция на РНК бяха събрани чрез югуларна венепункция от всички крави при 14 ± 2 DIM в епруветки за кръвна РНК на Tempus (Thermo-Fisher Scientific, Loughborough, UK). Епруветките се разклащат енергично за 15–20 секунди веднага след събирането, след това се замразяват и съхраняват при -80 ◦C за екстракция на РНК. Цялата кръвна РНК се екстрахира с помощта на комплекти за изолиране на РНК Tempus Spin (Thermo-Fisher), следвайки инструкциите на производителя, както е описано по-горе [20]. Agilent BioAnalyzer 2000 (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, UK) с Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, UK) беше използван за оценка на количеството и целостта на РНК. В допълнение, количеството и чистотата бяха валидирани с NanoDrop 1000 (Thermo Fischer). Данните за качеството са обобщени в допълнителен файл S3. Това показа, че всички РНК проби имат разумна цялост (RIN номер > 8.7, 9.3 ± 0.3) и чистота (260/280 между 2.01 и 2.15, средно ± STD 2.10 ± 0.03), така че нито едно животно не е отстранено от анализа. РНК се съхранява при -80 ◦C за последващо секвениране на РНК.

4.6. РНК-секвениране, картографиране и количествено определяне

Екстрахираната левкоцитна РНК се секвенира върху платформата Illumina NextSeq 500, както е описано по-рано [68]. Накратко, с помощта на работната станция за обработка на течности epMotion (Eppendorf, Хамбург, Германия) 750 ng обща РНК се транскрибират обратно в библиотеки за секвениране на cDNA с комплекта Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Ribo-Zero Gold (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ ). Обединените cDNA библиотеки бяха секвенирани на Illumina NextSeq 500 секвенсер при 75 нуклеотидни дължини в единичен край, за да достигнат средно 33,5 милиона четения на проба. Необработените FASTQ файлове бяха депозирани в Европейския нуклеотиден архив (E-MTAB-9347 и E-MTAB-9431). Всички анализи на секвениране бяха извършени с помощта на CLC Genomic Workbench v21 (Qiagen, Манчестър, Обединеното кралство). Всяка проба съдържаше показанията от четири ленти и те бяха обединени в един файл fastq. Качеството както на необработените, така и на изрязаните fastq файлове беше оценено след Illumina Pipeline 1.8 и всички неуспешни четения бяха премахнати. След това показанията бяха картографирани към сборка на референтния геном Bos taurus (ARS-UCD1.2, предоставена от RefSeq на https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly, достъпен на 1 януари 2021 г.) и количествено определени като показания на ген, четения на милион килобаза (RPKM) и преписи на милион килобаза (TPM). Те бяха съхранени като файлове за генна експресия (GE) в CLC Genomics Workbench, за да бъдат използвани за следващия анализ на диференциалната генна експресия.

4.7. Анализ на диференциалната генна експресия между диетичните групи

Преди диференциалния анализ на експресията за диетичен ефект използвахме анализ на главните компоненти (PCA) със стойностите на RPKM, за да идентифицираме извънредните стойности и това показа, че две крави (Blood020009, MP и Blood020103, PP) са извънредни стойности на популацията и следователно бяха изключени от по-нататъшен анализ (допълнителен файл S4A). Анализът на основните компоненти също показа, че има само ограничено припокриване в общия модел на генна експресия между PP и MP кравите (допълнителен файл S2B). Това подкрепи първоначалния дизайн на проучването за анализиране на всяка възрастова група поотделно. Следователно GE файловете, получени от всички отделни проби, бяха разделени по възрастова група (PP, n=5–6 на група и MP, n=14–15 на група). DEG между диетичните групи в PP или MP крави бяха идентифицирани с CLC Genomics Workbench V21 чрез еднопосочна процедура, подобна на ANOVA. Процентите на фалшиви открития (FDR) за множество тестове бяха коригирани с Benjamini-Hochberg (BH) и значимостта беше отчетена при p <0,05. Сгъваемите промени (FCs) се изчисляват като съотношението на генната експресия на групата с по-висок концентрат към групата с по-нисък концентрат (напр. HC срещу LC, MC срещу LC или HC срещу MC), ако стойността на групата с по-висок концентрат е по-голям от този на групата с по-нисък концентрат (положителна промяна на гънките, регулиране нагоре). Ако стойността на групата с по-нисък концентрат е по-голяма от тази на групата с по-висок концентрат, се използва съотношението на групата с по-нисък концентрат към групата с по-висок концентрат (напр. LC срещу HC, MC срещу HC и LC срещу MC ) (отрицателна промяна на гънките, регулиране надолу). Регулираните нагоре и надолу DEGs с абсолютна кратна промяна, по-голяма или равна на 1,5 между диетичните групи, бяха избрани за допълнителен анализ.

4.8. Анализ на обогатяване на генната онтология (GO).

DEG, получени от двойни сравнения между диетичните групи, бяха въведени в Partek Genomics Suite V7.1 (Partek Incorporation, Chesterfield, MO, USA) за анализ на обогатяване на GO за изследване на биологичните функции и взаимодействия между DEG и свързаната Киото енциклопедия на Пътища на гени и геноми (KEGG) с геном на Bos taurus ARS-UCD1.2. Използван е точният тест на Fisher с корекция на BH и статистическата значимост е отчетена при p < 0.05.

4.9. Статистически анализ на данните за фенотипа

Данните, получени от всички крави, първо бяха разделени по възрастова група (PP и MP крави), в съответствие с дизайна на изследването. Стойностите на DMI, BW, параметрите на млякото, EBAL, BCS, циркулиращите метаболити (глюкоза, урея, BHB, NEFAs, холестерол и IGF{{0}}), SCC (логаритмично трансформиран) и броя на маточните клетки и техните съотношения бяха обобщени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SE). Статистическият анализ беше използван за сравняване на разликите между диетичните групи с помощта на еднопосочен ANOVA, вграден в софтуерния пакет SPSS V28 (Чикаго, Илинойс, САЩ). Хомогенността на дисперсията за всяка променлива беше тествана със статистиката на Levene преди ANOVA. Резултатите показват, че не е постигната хомогенност между групите за ECM, EBAL, глюкоза, урея, BHB и IGF-1 при PP кравите, така че за тези променливи е приложена логаритмична трансформация. Когато ANOVA показа значимост, бяха извършени множество сравнения с LSD метода на Fisher, за да се идентифицира източникът на разликите. Тъй като хомогенността на дисперсията за данните от SCC на млякото и цитологията на матката не може да бъде постигната след логаритмична трансформация, тези променливи бяха тествани с помощта на еднопосочен ANOVA на Kruskal–Wallis с множество сравнения на Dunn. Данните за плодовитостта са тествани с метода на Wilcoxon. Във всички случаи значимостта се разглежда при p <0,05.

5. Изводи

Това проучване подкрепя по-ранна работа за демонстриране на ясни връзки между метаболитния статус на кравите в ранна лактация и тяхната имунна функция. Повечето предишни изследвания, насочени към подобряване на следродилното здраве чрез по-добро хранене, се фокусираха върху предродилния период и показаха, че прехранването и високият BCS по това време насърчават последваща липидна мобилизация и повишен възпалителен отговор по време на перипарталния период [34]. Вместо това ние оценихме дали е възможно да променим имунната функция след отелване чрез промяна на лактационната диета. Ние открихме, че отговорът на включването на допълнителен концентрат, който осигурява диета, формулирана да отговаря на енергийните и протеинови нужди на животното, предизвиква различни ефекти върху левкоцитния транскриптом при MP и PP крави. При MP кравите диетата с HC е била очевидно полезна, тъй като левкоцитите на LC кравата са имали регулиране нагоре на каскадата на комплемента и коагулацията и вродени имунни защитни механизми срещу патогени. Обратно, левкоцитите в PP кравите на HC диета показват по-големи имунни/възпалителни реакции и имат по-високо съотношение PMN: UEC, което предполага повишена миграция на левкоцити към матката. Тези крави впоследствие са имали по-дълъг интервал от отелване до зачеването, което показва по-слаба плодовитост. По-нататъшната работа с по-голям брой крави е оправдана, за да се потвърди констатацията за диетичен ефект върху плодовитостта и да се разбере по-пълно как метаболитните реакции на следродилната диета се различават при по-младите животни.

Препратки

1. Малард, бакалавърска степен; Dekkers, JC; Ирландия, MJ; Лесли, KE; Шариф, С.; Vankampen, CL; Wagter, L.; Wilkie, BN Промяна в имунната реакция по време на перипарталния период и нейното разклонение върху здравето на млечната крава и телето. J. Dairy Sci. 1998, 81, 585–595. [CrossRef] [PubMed]

2. Wathes, DC; Cheng, Z.; Chowdhury, W.; Fenwick, MA; Фицпатрик, Р.; Morris, DG; Patton, J.; Murphy, JJ Отрицателният енергиен баланс променя глобалната генна експресия и имунните отговори в матката на млечни крави след раждане. Physiol. Геном. 2009, 39, 1–13. [CrossRef]

3. Ингвартсен, KL; Moyes, K. Хранене, имунна функция и здраве на млекодайните говеда. Animal 2013, 7 (Допълнение 1), 112–122. [CrossRef] [PubMed]

4. Kehrli, ME, Jr.; Nonnecke, BJ; Roth, JA Промени във функцията на говежди неутрофили по време на периода около раждането. Am. J. Vet. Рез. 1989, 50, 207–214. [PubMed]

5. Ster, C.; Loiselle, MC; Lacasse, P. Ефект на концентрацията на неестерифицирани мастни киселини в серум след отелване върху функционалността на имунните клетки на говеда. J. Dairy Sci. 2012, 95, 708–717. [CrossRef] [PubMed]

6. Lacetera, N.; Скалия, Д.; Бернабучи, У.; Ronchi, B.; Pirazzi, D.; Nardone, A. Лимфоцитна функция при свръхкондиционирани крави около раждането. J. Dairy Sci. 2005, 88, 2010–2016. [CrossRef] [PubMed]

7. Нонеке, BJ; Кимура, К.; Goff, JP; Kehrli, ME, Jr. Ефекти на млечната жлеза върху функционалния капацитет на кръвните мононуклеарни левкоцитни популации от перипартиренти крави. J. Dairy Sci. 2003, 86, 2359–2368. [CrossRef]

8. Хабел, Дж.; Sundrum, A. Несъответствие на разпределението на глюкозата между различните жизнени функции в преходния период на млечните крави. Животни 2020, 10, 1028. [CrossRef]

9. Хорст, Е.А.; Квидера, SK; Баумгард, Л. Х. Поканен преглед: Влиянието на имунната активация върху здравето и производителността на кравите в преход – Критична оценка на традиционните догми. J. Dairy Sci. 2021, 104, 8380–8410. [CrossRef]

10. Wathes, DC; Бекер, Ф.; Buggiotti, L.; Кроу, Масачузетс; Ferris, C.; Foldager, L.; Grelet, C.; Хостенс, М.; Ingvartsen, KL; Марчители, С.; и др. Връзки между концентрациите на циркулиращия IGF-1, статуса на заболяването и транскриптома на левкоцитите при млечни крави в началото на лактацията. Преживни животни 2021, 1, 147–177. [CrossRef]

11. Димелое, С.; Burgener, AV; Grahlert, J.; Hess, C. T-клетъчен метаболизъм, управляващ активирането, пролиферацията и диференциацията; модулен изглед. Имунология 2017, 150, 35–44. [CrossRef] [PubMed]

12. Лофтъс, РМ; Finlay, DK Имунометаболизъм: Клетъчният метаболизъм се превръща в имунен регулатор. J. Biol. Chem. 2016, 291, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

13. Бауман, DE; Currie, WB Разделяне на хранителни вещества по време на бременност и кърмене: Преглед на механизмите, включващи хомеостаза и хомеореза. J. Dairy Sci. 1980, 63, 1514–1529. [CrossRef] [PubMed]

14. Дракли, награда за стипендианти на JK ADSA Foundation. Биология на млечните крави по време на преходния период: последната граница? J. Dairy Sci. 1999, 82, 2259–2273. [CrossRef] [PubMed]

15. Jabbour, HN; Продажби, KJ; Каталано, РД; Norman, JE Възпалителни пътища в женското репродуктивно здраве и болести. Възпроизвеждане 2009, 138, 903–919. [CrossRef]

16. Pascottini, OB; LeBlanc, SJ Модулиране на имунната функция в перипарталната матка на говеда. Териогенология 2020, 150, 193–200. [CrossRef]

17. Шелдън, IM; Луис, GS; LeBlanc, S.; Gilbert, RO Дефиниране на следродилна маточна болест при говеда. Териогенология 2006, 65, 1516–1530. [CrossRef]

18. Kuhla, B. Преглед: Провъзпалителни цитокини и възпаление на хипоталамуса: Последици за недостатъчен прием на храна от преходни млечни крави. Animal 2020, 14, s65–s77. [CrossRef]

19. Ингвартсен, KL; Moyes, KM Фактори, допринасящи за имуносупресия при млечната крава по време на периода след раждане. Jpn. J. Vet. Рез. 2015, 63 (Допълнение 1), S15–S24.

20. Wathes, DC; Cheng, Z.; Салавати, М.; Buggiotti, L.; Takeda, H.; Танг, Л.; Бекер, Ф.; Ingvartsen, KI; Ferris, C.; Хостенс, М.; и др. Връзки между метаболитни профили и генна експресия в черния дроб и левкоцитите на млечни крави в ранна лактация. J. Dairy Sci. 2021, 104, 3596–3616. [CrossRef]

21. Пинедо, П.; Melendez, P. Чернодробни нарушения, свързани с метаболитен дисбаланс при млечни крави. ветеринарен лекар Clin. N. Am. Храна Anim. Практ. 2022, 38, 433–446. [CrossRef] [PubMed]

22. Фенуик, Масачузетс; Фицпатрик, Р.; Кени, DA; Дискин, MG; Patton, J.; Мърфи, JJ; Wathes, DC Взаимовръзки между отрицателния енергиен баланс (NEB) и регулирането на IGF в черния дроб на лактиращи млечни крави. Домест. Anim. Ендокринол. 2008, 34, 31–44. [CrossRef] [PubMed]

23. Кобаяши, Й.; Бойд, CK; Bracken, CJ; Lamberson, WR; Keisler, DH; Lucy, MC Намалена рибонуклеинова киселина на посредник на рецептора на растежния хормон (GHR) в черния дроб на перипартуриални говеда се причинява от специфично понижено регулиране на GHR 1A, което е свързано с намален инсулиноподобен растежен фактор I. Endocrinology 1999, 140, 3947–3954. [CrossRef]

24. Квидера, SK; Horst, EA; Abuajamieh, М.; Майорга, EJ; Фернандес, MV; Baumgard, LH Изисквания от глюкоза на активирана имунна система при крави Холщайн в лактация. J. Dairy Sci. 2017, 100, 2360–2374. [CrossRef] [PubMed]

25. Ченг, З.; Wylie, A.; Ferris, C.; Ingvartsen, KL; Wathes, DC; Gplus, EC Ефект на диетата и нивата на неестерифицирани мастни киселини върху глобалните транскриптомни профили в циркулиращите мононуклеарни клетки на периферната кръв при млечни крави в ранна лактация. J. Dairy Sci. 2021, 104, 10059–10075. [CrossRef]

26. Wathes, DC; Fenwick, М.; Cheng, Z.; Борн, Н.; Llewellyn, S.; Morris, DG; Кени, Д.; Мърфи, Дж.; Fitzpatrick, R. Влияние на отрицателния енергиен баланс върху цикличността и плодовитостта при високопродуктивните млечни крави. Териогенология 2007, 68 (Допълнение 1), S232–S241. [CrossRef]

27. Сантос, JE; Bisinotto, RS; Ribeiro, ES Механизми, лежащи в основата на намалената плодовитост при ановуларни млечни крави. Териогенология 2016, 86, 254–262. [CrossRef]

28. Pascottini, OB; Leroy, J.; Opsomer, G. Дезадаптация към преходния период и последици върху плодовитостта на млечните крави. Възпроизвеждане Дом. Anim. 2022, 57 (Допълнение 4), 21–32. [CrossRef]

29. Leroy, JL; Valckx, SD; Йорданс, Л.; De Bie, J.; Десмет, KL; Ван Хоек, В.; Britt, JH; Марей, WF; Bols, PE Хранене и метаболитно здраве на майката във връзка с качеството на ооцитите и ембрионите: Критични възгледи за това, което научихме от модела на млечната крава. Възпроизвеждане Фертил. Dev. 2015, 27, 693–703. [CrossRef]

30. Кофи, MP; Хики, Дж.; Brotherstone, S. Генетични аспекти на растежа на холщайн-фризийските млечни крави от раждането до зрелостта. J. Dairy Sci. 2006, 89, 322–329. [CrossRef]

31. Wathes, DC; Cheng, Z.; Борн, Н.; Тейлър, VJ; Кофи, MP; Brotherstone, S. Разлики между млекодайни крави първородни и многократни във взаимовръзките между метаболитни характеристики, добив на мляко и оценка на телесното състояние в периода след раждането. Домест. Anim. Ендокринол. 2007, 33, 203–225. [CrossRef] [PubMed]

32. Little, MW; Wylie, ARG; О'Конъл, Небраска; Welsh, MD; Grelet, C.; Бел, MJ; Гордън, А.; Ferris, CP Имунологични ефекти от промяна на нивото на включване на концентрат в диета, базирана на тревен силаж, за ранна лактация на холщайн фризийски крави. Animal 2019, 13, 799–809. [CrossRef] [PubMed]

33. Буджоти, Л.; Cheng, Z.; Салавати, М.; Wathes, CD; Генотип плюс околна среда, C. Сравнението на транскриптома в циркулиращите левкоцити в ранна лактация между първораждащи и многораждали крави предоставя доказателства за промени, свързани с възрастта. BMC геном. 2021, 22, 693. [CrossRef] [PubMed]

34. Кардосо, ФК; Kalscheur, KF; Drackley, JK Преглед на симпозиума: Хранителни стратегии за подобрено здраве, производство и плодовитост по време на преходния период. J. Dairy Sci. 2020, 103, 5684–5693. [CrossRef] [PubMed]

35. Ingvartsen, KL Болести, свързани с храненето и управлението при преходната крава. Anim. Feed Sci. техн. 2006, 126, 175–213. [CrossRef]

36. Ферис, CP; Гордън, FJ; Патерсън, окръг Колумбия; Mayne, CS; McCoy, MA Краткосрочно сравнение на ефективността на четири базирани на пасища системи за производство на мляко за млечни крави с есенно отелване. Тревен фураж Sci. 2003, 58, 8. [CrossRef]

37. Тейлър, VJ; Cheng, Z.; Пушпакумара, PG; Бийвър, Делавер; Wathes, DC Връзки между плазмените концентрации на инсулиноподобен растежен фактор-I при млечни крави и тяхната плодовитост и добив на мляко. ветеринарен лекар Rec. 2004, 155, 583–588. [CrossRef]

38. LeBlanc, SJ Взаимодействия на метаболизма, възпалението и здравето на репродуктивния тракт в следродилния период при млекодайни говеда. Възпроизвеждане Domc. Anim. 2012, 47 (Допълнение 5), 18–30. [CrossRef]

39. Ваилати-Рибони, М.; Канвал, М.; Булгари, О.; Майер, С.; Свещеник, NV; Бърк, CR; Кей, JK; McDougall, S.; Мичъл, MD; Уокър, CG; и др. Оценката на телесното състояние и равнината на хранене преди раждането влияят върху транскриптомните регулатори на мастната тъкан на метаболизма и възпалението при пасищни млечни крави по време на преходния период. J. Dairy Sci. 2016, 99, 758–770. [CrossRef]

40. Тревизи, Е.; Минути, А. Оценка на вродения имунен отговор при перипартирентна крава. Рез. ветеринарен лекар Sci. 2018, 116, 47–54. [CrossRef]

41. Druker, SA; Sicsic, R.; ван Стратен, М.; Гошен, Т.; Кедми, М.; Raz, T. Диагностика на цитологичен ендометрит при първородни спрямо многораждали млечни крави. J. Dairy Sci. 2022, 105, 665–683. [CrossRef] [PubMed]

42. Hamzeh-Cognasse, H.; Ларади, С.; Osselaer, JC; Cognasse, F.; Garraud, O. Amotosalen-HCl-UVA патогенната редукция не променя метаболизма след съхранение на разтворим CD40 лиганд, Ox40 лиганд и интеркеукин-27, цитокините, които обикновено се свързват със сериозни нежелани събития. Vox Sang. 2015, 108, 205–207. [CrossRef] [PubMed]

43. de Greeff, A.; Задокс, Р.; Ruuls, L.; Тусен, М.; Нгуен, TK; Даунинг, А.; Rebel, J.; Stockhofe-Zurwieden, Н.; Smith, H. Ранен отговор на гостоприемника в млечната жлеза след експериментално предизвикателство Streptococcus uberis при юници. J. Dairy Sci. 2013, 96, 3723–3736. [CrossRef] [PubMed]

44. Ченг, З.; Чаухан, Л.; Бари, AT; Abudureyimu, A.; Oguejiofor, CF; Чен, X.; Wathes, DC Острата вирусна инфекция с вирусна диария по говедата инхибира експресията на интерферон тау-стимулирани гени в говеждия ендометриум. Biol. Възпроизвеждане 2017, 96, 1142–1153. [CrossRef]

45. Schoggins, JW Интерферон-стимулирани гени: Какво правят всички те? Annu. Вирол. 2019, 6, 567–584. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Ohto, U. Механизми за активиране и регулиране на NOD-подобни рецептори на базата на структурна биология. Отпред. Immunol. 2022, 13, 953530. [CrossRef]

47. Ченг, З.; Палма-Вера, С.; Buggiotti, L.; Салавати, М.; Бекер, Ф.; Werling, D.; Wathes, DC; Gplus, EC Транскриптомен анализ на циркулиращи левкоцити, получени по време на възстановяването от клиничен мастит, причинен от Escherichia coli при млечни крави Холщайн. Животни 2022, 12, 2146. [CrossRef]

48. Лория, В.; Дато, И.; Грациани, Ф.; Biasucci, LM Myeloperoxidase: Нов биомаркер на възпаление при исхемична болест на сърцето и остри коронарни синдроми. Медиат. Възпаление. 2008, 2008, 135625. [CrossRef]

49. Оливера, А.; Бийвън, Масачузетс; Metcalfe, DD Мастните клетки сигнализират за тяхното значение за здравето и болестта. J. Allergy Clin. Immunol. 2018, 142, 381–393. [CrossRef]

50. Дикинсън, SE; Грифин, бакалавърска степен; Elmore, MF; Kriese-Anderson, L.; Елмор, JB; Dyce, PW; Rodning, SP; Biase, профилите на FH транскриптоми в периферните бели кръвни клетки по време на изкуствено осеменяване разграничават говежди юници с различен потенциал за плодовитост. BMC геном. 2018, 19, 129. [CrossRef]

51. Ван Мелдер, Ф.; Van Coppernolle, S.; Borloo, J.; Риналди, М.; Li, RW; Chiers, K.; Van den Broeck, W.; Vercruysse, J.; Claerebout, E.; Geldhof, P. Гранулирана екзоцитоза на гранулизин и гранзим В като потенциален ключов механизъм в индуцирания от ваксина имунитет при говеда срещу нематода Ostertagia ostertagi. заразявам. имунна. 2013, 81, 1798–1809. [CrossRef] [PubMed]

52. Тейлър, JL; Браун, Б. Л. Структурна основа за дисрегулация на синтазата на аминолевулинова киселина при човешко заболяване. J. Biol. Chem. 2022, 298, 101643. [CrossRef] [PubMed]

53. Трапани, JA; Sutton, VR Granzyme B: Проапоптотични, антивирусни и антитуморни функции. Curr. мнение Immunol. 2003, 15, 533–543. [CrossRef] [PubMed]

54. Campanile, G.; Baruselli, PS; Лимон, А.; D'Occhio, MJ Локално действие на цитокини и имунни клетки в комуникацията между концепцията и матката по време на критичния период на ранно развитие на ембриона, прикрепване и имплантиране - Последици за оцеляването на ембриона при говеда: преглед. Териогенология 2021, 167, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

55. Bougarne, N.; Weyers, B.; Десмет, SJ; Deckers, J.; Рей, DW; Staels, B.; De Bosscher, K. Молекулярни действия на PPARalpha при липидния метаболизъм и възпалението. Ендокр. Rev. 2018, 39, 760–802. [CrossRef]

56. Соболев, В.В.; Чепурина, Е.; Корсунская, И.М.; Geppe, NA; Чебишева, SN; Соболева, AG; Мезенцев, А. Ролята на транскрипционния фактор PPAR-гама в патогенезата на псориазис, кожни клетки и имунни клетки. Вътр. J. Mol. Sci. 2022, 23, 9708. [CrossRef]

57. Песен, С.; Атия, RR; Connaughton, S.; Niesen, MI; Ness, GC; Елам, MB; Хори, RT; Кук, Джорджия; Park, EA Пероксизомен пролифератор-активиран рецептор алфа (PPARalpha) и PPAR гама коактиватор (PGC-1alpha) индуцират карнитин палмитоилтрансфераза IA (CPT-1A) чрез независими генни елементи. Mol. клетка. Ендокринол. 2010, 325, 54–63. [CrossRef]

58. Зюзенкова, О.; Plutzky, J. Ретиноиден метаболизъм и реакции на ядрени рецептори: Нови прозрения за координирана регулация на комплекса PPAR-RXR. FEBS Lett. 2008, 582, 32–38. [CrossRef]

59. Espenshade, PJ; Hughes, AL Регулиране на синтеза на стерол в еукариоти. Annu. преп. Женет. 2007, 41, 401–427. [CrossRef]

60. Ван Меер, Г.; Voelker, DR; Feigenson, GW Мембранни липиди: Къде са и как се държат. Нац. Rev. Mol. клетка. Biol. 2008, 9, 112–124. [CrossRef]

61. Агилар-Балестър, М.; Herrero-Cervera, A.; Vinue, A.; Martinez-Hervas, S.; Gonzalez-Navarro, H. Влияние на метаболизма на холестерола върху функцията на имунните клетки и атеросклерозата. Хранителни вещества 2020, 12, 2021. [CrossRef] [PubMed]

62. Мамедова, Л.К.; Юан, К.; Laudick, AN; Флеминг, SD; Машек, ДГ; Брадфорд, BJ Toll-подобен рецептор 4 сигнализиране е необходимо за индуциране на експресия на глюконеогенен ген от палмитат в клетки на човешки чернодробен карцином. J. Nutr. Biochem. 2013, 24, 1499–1507. [CrossRef] [PubMed]

63. Сото-Хередеро, Г.; Гомес де Лас Херас, MM; Габанде-Родригес, Е.; Oller, J.; Mittelbrunn, M. Glycolysis-ключов играч във възпалителния отговор. FEBS J. 2020 г., 287, 3350–3369. [CrossRef] [PubMed]

64. Комински, DJ; Кембъл, EL; Colgan, SP Метаболитни промени в имунитета и възпалението. J. Immunol. 2010, 184, 4062–4068. [CrossRef]

65. Афакан, Ню Джърси; Yeung, AT; Pena, OM; Hancock, RE Терапевтичен потенциал на защитните пептиди на гостоприемника при резистентни на антибиотици инфекции. Curr. Pharm. Дес. 2012, 18, 807–819. [CrossRef]

66. Auvynet, C.; Rosenstein, Y. Многофункционални защитни пептиди на гостоприемника: Антимикробни пептиди, малките, но големи играчи във вродения и адаптивен имунитет. FEBS J. 2009, 276, 6497–6508. [CrossRef]

67. Хилчи, Алабама; Wuerth, K.; Hancock, RE Имунна модулация чрез многостранни катионни защитни (антимикробни) пептиди на гостоприемника. Нац. Chem. Biol. 2013, 9, 761–768. [CrossRef]

68. Ченг, З.; Buggiotti, L.; Салавати, М.; Марчители, С.; Палма-Вера, С.; Wylie, A.; Takeda, H.; Танг, Л.; Кроу, Масачузетс; Wathes, DC; и др. Глобални транскриптомични профили на циркулиращи левкоцити при крави в ранна лактация с клиничен или субклиничен мастит. Mol. Biol. 2021 г., 48, 4611–4623. [CrossRef]

69. Foley, C.; Чапваня, А.; Каланан, JJ; Уистън, Р.; Миранда-КасоЛуенго, Р.; Lu, J.; Meijer, WG; Лин, DJ; O'Farrelly, C.; Meade, KG Интегриран анализ на локалните и системни промени, предшестващи развитието на следродилен цитологичен ендометрит. BMC геном. 2015, 16, 811. [CrossRef]

70. Мачадо, VS; Silva, TH Адаптивен имунитет в следродилната матка: Потенциално използване на ваксини за контрол на метрит. Териогенология 2020, 150, 201–209. [CrossRef]

71. Лей, К.; Hoffman, HM; Kubes, P.; Касатела, Масачузетс; Zychlinsky, A.; Хедрик, CC; Catz, SD Неутрофили: Нови прозрения и отворени въпроси. Sci. Immunol. 2018, 3, eaat4579. [CrossRef] [PubMed]

72. Wahl, SM; Feldman, GM; McCarthy, JB Регулиране на левкоцитната адхезия и сигнализиране при възпаление и заболяване. J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 789–796. [CrossRef] [PubMed]

73. Шуберт, К.; Полте, Т.; Бониш, У.; Шадер, С.; Holtappels, R.; Hildebrandt, G.; Lehmann, J.; Саймън, JC; Anderegg, U.; Saalbach, A. Thy-1 (CD90) регулира екстравазацията на левкоцити по време на възпаление. Евро. J. Immunol. 2011, 41, 645–656. [CrossRef] [PubMed]

74. Драймюлер, Д.; Pruessmeyer, J.; Шумахер, Й.; Fellendorf, S.; Хес, FM; Seifert, A.; Бабендрайер, А.; Bartsch, JW; Ludwig, A. Металопротеиназата ADAM8 насърчава набирането на левкоцити in vitro и при остро възпаление на белите дробове. Am. J. Physiol. Белодробна клетка. Mol. Physiol. 2017, 313, L602–L614. [CrossRef]

75. Костелник, К.Б.; Баркър, А.; Шулц, С.; Мичъл, TP; Rajeeve, V.; Уайт, IJ; Aurrand-Lions, M.; Nourshargh, S.; Cutillas, P.; Nightingale, TD Динамичният трафик и оборотът на JAM-C е от съществено значение за миграцията на ендотелните клетки. PLoS Biol. 2019, 17, e3000554. [CrossRef] [PubMed]

76. Стили, Р.; Farooq, SM; Гордън, JR; Stadnyk, AW Функционалното значение зад експресирането на два типа IL-8 рецептори върху PMN. J. Leukoc. Biol. 2009, 86, 529–543. [CrossRef]

77. Bouton, AH; Ригинс, РБ; Bruce-Staskal, PJ Функции на адаптерния протеин Cas: конвергенция на сигнала и определяне на клетъчни отговори. Oncogene 2001, 20, 6448–6458. [CrossRef]

78. Чен, X.; Cheng, Z.; Джан, С.; Werling, D.; Wathes, DC Комбинирането на проучвания за асоцииране в целия геном и диференциални анализи на данни за генна експресия идентифицира кандидат-гени, засягащи мастит, причинен от два различни патогена в млечната крава. Отворете J. Anim. Sci. 2015, 5, 358–393. [CrossRef]

79. Chang, GW; Hsiao, CC; Peng, YM; Виейра Брага, FA; Kragten, NA; Remmerswaal, EB; van de Garde, MD; Straussberg, R.; Konig, GM; Костенис, Е.; и др. Адхезионният G протеин-свързан рецептор GPR56/ADGRG1 е инхибиторен рецептор в човешки NK клетки. клетка. Rep. 2016, 15, 1757–1770. [CrossRef]

80. Bi, J.; Tian, ​​Z. NK клетъчна дисфункция и контролна имунотерапия. Отпред. Immunol. 2019, 10, 1999. [CrossRef]

81. Минути, А.; Gallo, A.; Лопреято, В.; Bruschi, S.; Piccioli-Cappelli, F.; Уболди, О.; Trevisi, E. Ефект на размера на котилото върху препарталния метаболитен и аминокиселинен профил при заек. Animal 2020, 14, 2109–2115. [CrossRef] [PubMed]

82. Crookenden, MA; Moyes, KM; Кун-Шерлок, Б.; Lehnert, K.; Уокър, CG; Loor, JJ; Мичъл, MD; Мъри, А.; Дукипати, VSR; Vailati-Riboni, М.; и др. Транскриптомичен анализ на циркулиращи неутрофили в метаболитно стресирани перипартални пасящи млечни крави. J. Dairy Sci. 2019, 102, 7408–7420. [CrossRef] [PubMed]

83. Шарма, JN; Ал-Омран, А.; Parvathy, SS Роля на азотния оксид при възпалителни заболявания. Инфламофармакология 2007, 15, 252–259. [CrossRef] [PubMed]

84. Martino, MR; Гутиерес-Агилар, М.; Yiew, NKH; Lutkewitte, AJ; Сингър, JM; Маккомис, Канзас; Фъргюсън, Д.; Liss, KHH; Yoshino, J.; Renkemeyer, MK; и др. Заглушаването на аланин трансаминаза 2 в диабетния черен дроб отслабва хипергликемията чрез намаляване на глюконеогенезата от аминокиселини. Cell Rep. 2022, 39, 110733. [CrossRef] [PubMed]

85. Висок, AR; Yvan-Charvet, L. Холестерол, възпаление и вроден имунитет. Нац. Rev. Immunol. 2015, 15, 104–116. [CrossRef]

86. Wathes, D.; Cheng, Z.; Mareiy, W.; Fouladi-Nasht, A. Полиненаситени мастни киселини и плодовитост при женски бозайници: Актуализация. CABI Rev. 2013, 8, 1–14. [CrossRef]

87. Алипур, А.; van Oostrom, AJ; Израелян, А.; Verseyden, C.; Collins, JM; Frayn, KN; Плокер, TW; Елте, JW; Castro Cabezas, M. Активиране на левкоцитите чрез богати на триглицериди липопротеини. Артериосклер. Thromb. Vasc. Biol. 2008, 28, 792–797. [CrossRef]

88. Кастолди, А.; Монтейро, LB; van Teijlingen Bakker, N.; Sanin, DE; Рана, Н.; Корадо, М.; Камерън, AM; Hassler, F.; Мацушита, М.; Капута, Г.; и др. Синтезът на триацилглицерол засилва възпалителната функция на макрофагите. Нац. Общ. 2020, 11, 4107. [CrossRef]

89. Bell, AW Регулиране на метаболизма на органичните хранителни вещества по време на прехода от късна бременност към ранна лактация. J. Anim. Sci. 1995, 73, 2804–2819. [CrossRef]

90. Мур, DAPSU; Varga, G. BUN и MUN: Тестване на карбамиден азот при млекодайни говеда. Компендиум 1996, 18, 712–720.

91. Wathes, DC; Борн, Н.; Cheng, Z.; Ман, GE; Тейлър, VJ; Coffey, MP Множествени корелационни анализи на метаболитни и ендокринни профили с плодовитостта при първораждащи и многократни крави. J. Dairy Sci. 2007, 90, 1310–1325. [CrossRef] [PubMed]

92. Абе, Р.; Донъли, SC; Пенг, Т.; Букала, Р.; Metz, CN Фиброцити от периферна кръв: Път на диференциация и миграция към местата на раната. J. Immunol. 2001, 166, 7556–7562. [CrossRef] [PubMed]

93. Шрайер, С.; Triampo, W. Популацията от редки клетки в кръвта. Какво представлява и за какво е добро? Клетки 2020, 9, 790. [CrossRef] [PubMed]

94. Лин, Аляска; Янас, IV; Bonfield, W. Антигенност и имуногенност на колаген. J. Biomed. Матер. Рез. 2004, 71, 343–354. [CrossRef]

95. Roche, JR; Бърк, CR; Crookenden, MA; Heiser, A.; Loor, JL; Майер, С.; Мичъл, MD; Phyn, CVC; Turner, SA Плодовитостта и преходната млечна крава. Възпроизвеждане Фертил. Dev. 2017, 30, 85–100. [CrossRef]

96. Галвао, К.Н.; Фламинио, MJ; Brittin, SB; Спер, Р.; Фрага, М.; Caixeta, L.; Ричи, А.; Охрана, CL; Бътлър, WR; Gilbert, RO Асоциация между заболяване на матката и показатели за неутрофили и системен енергиен статус при крави Холщайн в лактация. J. Dairy Sci. 2010, 93, 2926–2937. [CrossRef]

97. Дал, Мисури; Maunsell, FP; De Vries, A.; Galvao, KN; Риско, Калифорния; Hernandez, JA Доказателство, че маститът може да причини загуба на бременност при млечни крави: систематичен преглед на наблюдателни проучвания. J. Dairy Sci. 2017, 100, 8322–8329. [CrossRef]

98. Hansen, PJ; Сото, П.; Natzke, RP Мастит и плодовитост при говеда - възможно участие на възпаление или имунна активация в ембрионална смъртност. Am. J. Reprod. Immunol. 2004, 51, 294–301. [CrossRef]

99. Малиновски, Е.; Gajewski, Z. Мастит и нарушения на плодовитостта при крави. пол. J. Vet. Sci. 2010, 13, 555–560.

100. Едмънсън, AJ; Lean, IJ; Уивър, LD; Фарвър, Т.; Уебстър, Джорджия. Таблица за оценка на телесното състояние за млечни крави Холщайн. J. Dairy Sci. 1989, 72, 11. [CrossRef]

101. Ларсен, Т.; Rontved, CM; Ingvartsen, KL; Велс, Л.; Bjerring, M. Ензимна активност и протеини от острата фаза в млякото, използвани като индикатори за остър клиничен E. coli LPS-индуциран мастит. Animal 2010, 4, 1672–1679. [CrossRef] [PubMed]

102. Крог, Масачузетс; Хостенс, М.; Салавати, М.; Grelet, C.; Соренсен, Монтана; Wathes, DC; Ферис, CP; Марчители, С.; Синьорели, Ф.; Наполитано, Ф.; и др. Вариации между и в рамките на стадото в биомаркерите за кръв и мляко при крави Холщайн в ранна лактация. Animal 2020, 14, 1067–1075. [CrossRef] [PubMed]

103. Буджоти, Л.; Cheng, Z.; Wathes, DC; Gplus, EC Извличането на некартографирани показания в говежди RNA-Seq данни разкрива разпространението на говежди херпесен вирус-6 при европейските млечни крави и свързаните промени в техния фенотип и транскриптом на левкоцити. Вируси 2020, 12, 1451. [CrossRef] [PubMed]

104. Белтман, ME; Форде, Н.; Фърни, П.; Картър, Ф.; Roche, JF; Lonergan, P.; Crowe, MA Характеризиране на генната експресия на ендометриума и метаболитни параметри при говежди юници, даващи жизнеспособни или нежизнеспособни ембриони на 7-ия ден след осеменяване. Възпроизвеждане Фертил. Dev. 2010, 22, 987–999. [CrossRef] [PubMed]