Защитен ефект на екстракта от Джулис (Chenopodium Formosanum) срещу стареене на кожата, предизвикано от UV- и AGEs чрез облекчаване на оксидативния стрес и разграждането на колаген, част 1

Резюме: Стареенето на кожата е сложен процес, включващ фотостареене и гликационен стрес, които споделят някои основни пътища и имат общи медиатори. Те могат да причинят увреждане на кожата и разграждане на колаген чрез индуциране на оксидативен стрес и натрупване на реактивни кислородни видове (ROS). Chenopodium formosanum (CF), известен също като Djulis, е традиционна зърнена култура в Тайван. Това проучване изследва защитните механизми на CF екстракт срещу ултравиолетово (UV) лъчение и стрес, предизвикан от крайни продукти на гликиране (AGEs). Резултатите показват, че екстрактът от CF има силен антиоксидантен ефект и ефект на отстраняване на свободните радикали. Може да намали индуцираното от ултравиолетовите лъчи вътреклетъчно генериране на ROS и да инициира антиоксидантната защитна система чрез активиране на сигналния път на еритроидния фактор 2-свързан фактор 2 (Nrf2)/хем оксигеназа-1 (HO-1) във фибробластите на човешката кожа. CF екстракт модулира митоген-активирана протеин киназа (MAPK) и трансформиран растежен фактор-бета (TGF-) сигнални пътища за облекчаване на стареенето на кожата, предизвикано от оксидативен стрес. Освен това резултатите разкриват, че CF екстрактите не само насърчават синтеза на колаген, но също така подобряват разграждането на колаген, предизвикано от стареенето. Екстрактът от CF намалява индуцираното от AGEs производство на ROS и регулирането на рецепторите за AGEs (RAGE). Общите резултати предполагат, че CF екстрактът осигурява ефективна стратегия против стареене чрез предотвратяване на увреждане на кожата от оксидативен стрес и загуба на колаген с мощни антиоксидантни, анти-фотостареене и антигликационни дейности.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да пречиства DPPH свободните радикали и има способността да пречиства реактивните кислородни видове и да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена, а също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на анионите от свободните радикали на тимина.

Кликнете върху Cistanche Herba за анти-оксидация

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Ключови думи: Chenopodium formosanum; Джулис; ултравиолетова радиация; крайни продукти за усъвършенствано гликиране; гликационен стрес; реактивни кислородни видове

1. Въведение

Стареенето се определя като резултат от прогресивно намаляване на физиологичната функция на клетките и тъканите на тялото. По време на стареенето натрупването на увредени продукти постепенно засяга организацията и възстановителния капацитет на тъканта. Кожата, като защитна бариера за тялото, често е подложена на вътрешни и външни фактори на стареенето [1]. Преобладаващият външен фактор, който допринася за стареенето на кожата, е излагането на UV радиация на слънчева светлина, наречено фотостареене [2]. Освен стимулите от околната среда, натрупването на AGEs се счита за вътрешен фактор на хронологичното стареене, който задейства процеса на стареене на кожата чрез гликационен стрес [3].

Както ROS от околната среда, произведени от UV светлина, така и ендогенните ROS, образувани от оксидативен метаболизъм, регулират клетъчния оксидативен стрес и разрушават богатия на колаген екстрацелуларен матрикс (ECM), който е не само отличителен белег на стареенето на съединителната тъкан на кожата, но и основната причина за влошаване на кожата [ 4]. Увреждането на кръстосаните връзки на колагена отслабва дермалната структурна цялост и увеличава твърдостта и чупливостта на колагеновата мрежа, като по този начин насърчава образуването на бръчки, загуба на еластичност и сухота на кожата [5].

UVB лъчите са най-вредната вълнова лента на слънчевата радиация, достигаща до земята, което води до оксидативен стрес чрез стимулиране на образуването на ROS и участва в хиперпигментация, възпаление на кожата, имуносупресия, фотостареене и канцерогенеза [6,7]. Добре известно е, че Nrf2 действа като основен регулатор на клетъчната антиоксидантна защита срещу кожни фотоувреждания, медиирани от UV радиация. Клетките могат да елиминират оксидативния стрес и да предотвратят нараняване чрез регулиране на Nrf2/Kelch-подобен ECH-асоцииран протеин 1 (Keap1) сигнален път [8,9]. След излагане на ултравиолетови лъчи, прекомерното производство на ROS активира MAPK и ядрен фактор-kappa B (NF-κB), което от своя страна индуцира регулиране нагоре на матричните металопептидази (MMPs), кулминирайки в разграждането на колаген и еластин. В допълнение, активиращият протеин 1 (AP-1) инхибира TGF-сигнализирането и води до намаляване на синтеза на проколаген [10,11].

AGEs са хетерогенна група от молекули, образувани в резултат на гликиране, спонтанна неензимна реакция между редуциращите захари и аминогрупите на протеините [3]. Взаимодействието между AGEs и специфичен рецептор на AGEs (RAGE) задейства генерирането на ROS и променя генната експресия при нарушения, свързани с AGEs, като диабет и бъбречна недостатъчност [12,13]. AGE се натрупват в ECM протеини при стареене и Nε -(1-карбоксиметил)-L-лизин (CML), произведен чрез окислителна модификация, е основният гликиран протеин при хората [14,15]. По време на присъщото стареене, AGEs се експресират в епидермиса и дермата и може да се наблюдава значително повишено натрупване на AGEs в изложените на слънце участъци на кожата [16]. Освен това UV подобрява отлагането на AGEs чрез гликиране на мрежата от еластични влакна [17].

Chenopodium formosanum (CF), известен също като Djulis, е ядливо растение в Тайван и обикновено се готви с ориз или просо като основна храна. CF се счита за храна с висока хранителна стойност и източник на биоактивни съединения за човешкото здраве [18]. Освен изобилие от диетични фибри, нишесте, есенциални аминокиселини, ограничени в зърнените храни, и полифеноли [19,20], CF съдържа и клас съединения с дълга история на медицинска употреба, наречени фитоекдистероиди [21–24]. Предишни проучвания съобщават, че муковисцидозата показва няколко биологични активности, включително против затлъстяване [21], антихипертензивна [22], антихипергликемична [25,26], хепатопротективна [27-29], антикарциногенна [23,24,30,31], и свойства против стареене [19,32]. Въпреки това, нито подробните кожни защитни ефекти на CF екстракта, нито основните механизми срещу вътрешното и външното стареене на кожата, свързани с оксидативния и гликационния стрес, не са разкрити досега. Целта на това проучване беше да се изяснят антиоксидантните ефекти на екстракта от CF и да се изследват основните защитни механизми против стареене на екстракта от CF срещу разграждането на колаген от UV и AGE във фибробластите на човешката кожа.

2. Резултати

2.1. HPLC-ESI-MS/MS и MRM Количествен анализ

Анализът на съдържанието на целевите биоактивни съединения в екстракта от CF беше извършен чрез високоефективна течна хроматография (HPLC)-Mass/MS и методите за наблюдение на множество реакции (MRM). MRM йонната хроматограма и масспектърът при положителен режим на йонизация с електроспрей (ESI) на 20-хидроксиекдизон и рутин стандарт бяха показани в Допълнителни материали. Преходът от прекурсорния йон при m/z 481 към производството при m/z 371 за 20-хидроксиекдизон (Фигура S1a) и преходът от прекурсорния йон при m/z 611 към производството при m/z 3 Показани са 03 за рутин (Фигура S1b). Фигура S2 показва общата йонна хроматограма (TIC) и екстрахирана йонна хроматограма (EIC) на 20-хидроксиекдизон (m/z 481) и рутин (m/z 611) в CF екстракт. Съдържанието на рутин и 20-хидроксиекдизон в CF екстракт е съответно 14,5 ± 0.4 mg/g и 19,5 ± 0,6 mg/g.

2.2. Антиоксидантна активност и ефект на отстраняване на свободните радикали на CF екстракт

2.2.1. DPPH активност за отстраняване на свободни радикали

DPPH е често използван реагент за оценка на общата активност на антиоксидантите за улавяне на свободните радикали чрез откриване на способността на екстрактите да осигуряват водородни протони. Резултатът показа, че CF екстрактът проявява силна почистваща активност от 40,2 процента ± 3,3 процента при 50 µg/mL и 89,1 процента ± 2,6 процента при 500 µg/mL, докато почистващата активност на аскорбиновата киселина е 96,6 процента ± 2,3 процента при 10 µg/mL (Фигура 1а). Половината от максималната инхибиторна концентрация (IC50) на CF екстракт върху DPPH отстраняването на свободните радикали е 84,7 ± 13,0 µg/mL.

2.2.2. Намаляване на способността

Редукционната способност на CF екстракта, наблюдавана в настоящото изследване, е показана на Фигура 1b. Редуциращият капацитет на екстракта от CF е 51,3 процента ± 1.0 процента при 100 µg/mL и 66,9 процента ± 1,7 процента при 1000 µg/mL. Редукционният капацитет на сравнителната контролна аскорбинова киселина (100 µg/mL) е 79,7 процента ± 1,2 процента.

2.2.3. Супероксиден анионен радикал (O2 −) поглъщаща активност

Активността на улавяне на супероксидни анион радикали е 82,2 процента ± 6,1 процента за 250 µg/mL BHA (сравнителна контрола) и варира от 59,6 процента ± 3,5 процента до 73,1 процента ± 2,6 процента за 100–1000 µg/mL CF екстракт (Фигура 1c).

2.2.4. Активност на пречистване на водороден пероксид (H2O2).

Активността на поглъщане на водороден пероксид варира от 10,3 процента ± 1,1 процента до 61,1 процента ± 2,3 процента за 200–1500 µg/mL CF екстракт и е 96,3 процента ± 2,0 процента за BHA (250 µg/mL) ( Фигура 1d). IC50 на екстракт от CF е 956,5 ± 59,2 µg/mL за активност на извличане на водороден пероксид.

2.2.5. Активност на извличане на хидроксилни радикали (· OH).

Активностите за отстраняване на хидроксилни радикали на CF екстракт (100–1000 µg/mL) и сравнителния контролен манитол (µg/mL) са показани на Фигура 1e. Активността на извличане на хидроксилни радикали на 1000 µg/mL CF екстракт е 63,3 процента ± 3,5 процента, а тази на манитола (2500 µg/mL) е 69,7 процента ± 2,2 процента. Почистващият ефект на екстракта от CF е подобен на този на сравнителната контрола и IC50 на CF за активност по извличане на хидроксилни радикали е 240,7 ± 24,3 µg/mL.

2.2.6. Железен йон (Fe2 плюс) хелатираща активност

Фигура 1f показва металохелатиращата активност на CF екстракта и сравнителната контрола EDTA. Активността варира от 6,5 процента ± 1,4 процента до 67,6 процента ± 2,5 процента за 100–1000 µg/mL CF екстракт и 97,5 процента ± 2,0 процента за 100 µM EDTA. IC50 на CF екстракт е 625,5 ± 46,0 µg/mL за хелатиране на метали.

2.3. CF екстракт облекчава UV-индуцирана цитотоксичност в Hs68 клетки

За да се оцени цитотоксичният ефект на CF екстракт във фибробласти на човешка кожа (Hs68 клетки), жизнеспособността на клетките, третирани с CF екстракт, беше оценена чрез МТТ анализ. Както е показано на Фигура 2а, CF екстрактът не индуцира цитотоксичност в Hs68 клетки в диапазона на концентрация от 50–250 µg/mL; по този начин тези концентрации бяха избрани за следващите експерименти.

Клетките Hs68 бяха изложени на UVB радиация и жизнеспособността на клетките беше определена, за да се оцени защитният ефект на CF екстракта срещу фотоувреждане. Резултатите показват, че UVB (20–100 mJ/cm2) индуцирана от радиация цитотоксичност в Hs68 клетки по дозозависим начин (Фигура 2b). Независимо от това, Hs68 клетки бяха изложени на UVB (80 mJ/cm2) и впоследствие третирани с CF екстракт (100, 150, 200 и 250 µg/mL) в продължение на 24 часа; CF екстракт значително облекчава UV-индуцираната цитотоксичност (Фигура 2c).

2.4. Екстрактът от CF намалява UV-индуцираното вътреклетъчно генериране на ROS в Hs68 клетки

ROS може да индуцира свързан с фотостареенето на кожата протеин и сигнална трансдукция надолу по веригата, като причинява вътреклетъчен оксидативен стрес в човешката кожа. Флуорогенното багрило измерва количеството окислителни свободни радикали в клетките. След облъчване с UVB (80 mJ/cm2) в продължение на 2 часа, производството на ROS в клетки Hs68 се индуцира 216-кратно в сравнение с това в необлъчената група. Въпреки това, лечението със 100–250 µg/mL CF екстракт значително намалява генерирането на ROS. ROS бяха регулирани надолу 164-пъти в сравнение с радиационната група чрез CF екстракт при 250 µg/mL (Фигура 3).

2.5. Екстрактът от CF инициира антиоксидантната защитна система чрез активиране на Nrf2/HO-1 сигналния път в Hs68 клетки

2.5.1. Ефектите на CF екстракта върху UV-индуцираната експресия на Nrf2/HO-1

При нормални условия Keap1 образува комплекс с Nrf2 и насърчава убиквитинирането и разграждането на Nrf2. Въпреки това, сигналният път на Nrf2 се инициира, когато клетките се стимулират от оксидативния стрес на околната среда. В това проучване клетките Hs68 бяха третирани с CF екстракт, за да се наблюдават неговите ефекти върху Nrf2 сигналния път след UV лъчение. Както е показано на Фигура 4, UVB (40 mJ/cm2) индуцирана от радиация експресия на Nrf2 и намалена експресия на Keap1, докато екстрактът от CF (250 µg/mL) значително индуцира експресия на Nrf2 с 24-пъти в сравнение с групата на радиация . След UV облъчване и третиране с CF екстракт при 250 µg/mL протеиновата експресия на HO-1 се повишава с 2.5-пъти. Резултатите показват, че екстрактът от CF може да инициира антиоксидантния защитен механизъм чрез сигналния път Nrf2/HO-1 и да защити клетките от оксидативен стрес в биологична система.

2.5.2. Ефектите на CF екстракт върху UV-индуцирана ядрена транслокация на Nrf2

UV радиацията насърчава активирането на Nrf2 и транслокацията в ядрото на клетките. В това проучване беше извършен анализ на имунофлуоресцентно оцветяване с Nrf2 във фибробласти на човешка кожа, за да се определи нивото на активиране на Nrf2. Транслокацията на Nrf2 от цитоплазмата към ядрото се увеличава след UVB радиация, докато транслокацията също се засилва след лечение с CF екстракт (Фигура 5). Резултатите от анализа на имунофлуоресцентно оцветяване са в съответствие с експресията на Nrf2 на Фигура 4.

2.6. Клетъчен сигнален път, модулиран с фотостареене на кожата, свързан с CF екстракт в Hs68 клетки

2.6.1. Ефектите на CF екстракт върху UV-индуцирана експресия на MMP-1, -3, -9 и TIMP-1

UV радиацията индуцира фосфорилирането на MAPK, което задейства сигнална трансдукция надолу по веригата, за да активира транскрипционния фактор AP{{0}} и да подобри експресията на MMP. Когато кожата е изложена на оксидативен стрес, MMPs се регулират нагоре, което след това предизвиква разграждане на колаген и образуване на бръчки. Както е показано на фигура 6, UVB радиацията значително повишава експресията на MMP-1, -3 и -9 (2.2-кратно, 1.3-кратно и 15-кратно, съответно, в сравнение с контролната група), докато CF екстрактът отслабва експресията на MMPs. Третирането с CF екстракт при 250 µg/mL значително потиска нивата на UVB-индуцирана експресия на MMP-1, MMP-3 и MMP-9 с 1.1-кратно, 0 .9-кратно и 1.1-кратно съответно в сравнение с контролната група.

Тъканните инхибитори на металопротеиназите (TIMPs) са инхибитори на MMPs, експресирани в съединителната тъкан на кожата. Експресията на TIMP-1 беше намалена след UVB радиация и подобрена от CF екстракт (100–250 µg/mL) (Фигура 6). Тези резултати показват, че лечението с екстракт от CF предотвратява предизвиканото от ултравиолетовите лъчи повишаване на нивата на MMP-1, -3 и -9 и намаляването на TIMP-1; следователно екстрактът от CF може да намали индуцираното от ултравиолетовите лъчи разграждане на екстрацелуларния матрикс на кожата и да поддържа структурната цялост в дермата.

2.6.2. Ефектите на CF екстракта върху UV-индуцираната експресия на AP-1 и MAPK

UVB радиацията повишава експресията на pc-Jun и c-Fos (2.4- и 1.2-кратно в сравнение с контролната група), докато те се регулират надолу от CF екстракт (100–250 µg/ mL). Третирането с екстракт от CF значително намалява експресията на pc-Jun и c-Fos при 250 µg/mL (Фигура 7а). Фигура 7b показва, че експозицията на UVB повишава експресията на фосфорилиране на p38 и ERK до 2.1- и 1.5-кратно спрямо общите протеинови нива в Hs68 клетки. Въпреки това, лечението с CF екстракт (100-250 µg/mL) значително инхибира UVB-индуцираната свръхекспресия на MAPK. Фосфорилирането на p38 и ERK беше потиснато до базални нива с концентрация от 250 µg/mL на CF екстракт. Освен това CF екстрактът може да инхибира UV-индуцираната свръхекспресия на AP-1, като предпазва кожата от фотостареене.

2.6.3. Ефектите на CF екстракта върху UV-инхибираната експресия на TGF- и Smad3

TGF- играе централна роля в синтеза на извънклетъчния матрикс и контролира колагеновата хомеостаза в човешката дерма. Повишената ROS във фибробластите уврежда TGF-сигнализирането чрез понижаване на TGF- и Smad3 експресията, което води до загуба на колаген и разрушаване на дермалната тъкан в остарялата кожа. По подобен начин, в нашето проучване, UVB радиацията понижава експресията на TGF- и Smad3, за да инхибира синтеза на колаген. В сравнение с контролната група, експресията на TGF- и Smad3 е по-ниска в групата, облъчена с UVB; въпреки това екстрактът от CF (100–250 µg/mL) значително възстановява протеиновата експресия (Фигура 8).

2.7. Екстракт от CF атенюиран AGEs-индуцирано ROS производство и RAGE експресия в Hs68 клетки

За да се изследва ефектът на CF екстракт върху гликационния стрес, Hs68 клетките бяха третирани с CML. След третиране на клетките с CML (100 µg/mL) в продължение на 6 часа, генерираното количество ROS е 192-пъти по-високо от това в нетретираната група. Въпреки това, лечението с CF екстракт (100-250 µg/mL) значително намалява производството на ROS. ROS се регулира надолу 1.{9}}пъти в сравнение с групата, лекувана с ХМЛ, чрез CF екстракт при 250 µg/mL (Фигура 9). Освен това, ХМЛ (100 µg/mL) повишава значително експресията на RAGE до 2.{15}}пъти в сравнение с контролната група, но е отслабена чрез лечение с екстракт от CF (Фигура 10), което показва, че екстрактът от CF намалява основно индукцията причинени от CML.

2.8. Екстрактът от CF насърчава синтеза на колаген и подобрява индуцираното от стареенето разграждане на колаген в Hs68 клетки

2.8.1. Ефектите на CF екстракта върху синтеза на колаген

Hs68 клетките бяха третирани с CF екстракт (50-250 µg/mL) в продължение на 24 часа и експресията на проколаген тип I беше измерена с помощта на Western blotting. След лечение с CF екстракт, експресията на проколаген тип I беше значително повишена (1.7-кратно в сравнение с контролната група) (Фигура 11а). Общото съдържание на колаген в контролната група беше 14,93 ± 1,27 µg/mL, което се увеличи до 39.00 ± 2,39 µg/mL след лечение с 250 µg/mL екстракт от CF (Фигура 11b). Резултатите от експресията на проколаген тип I и общото съдържание на колаген показват, че CF екстрактът насърчава синтеза и производството на колаген.

2.8.2. Ефектите на CF екстракт върху UV и AGEs-индуцирано разграждане на колаген

Hs68 клетки, изложени на UVB (40 mJ/cm2) радиация или третирани с CML (100 µg/mL), бяха третирани с CF екстракт за 24 часа. Както е показано на Фигура 12а, общото съдържание на колаген е значително намалено след UVB облъчване и лечението с CF екстракт възстановява колагена и значително увеличава образуването на колаген при 250 µg/mL. Подобни резултати са показани при производството на колаген, третиран с CML и серия от CF екстракти. Екстрактът от CF отслабва третираното с CML намаление на общия колаген (Фигура 12b).

Тестът за имунофлуоресцентно оцветяване се използва за определяне на нивото на колаген във фибробластните клетки (Фигура 12с). Както UVB радиацията, така и лечението с CML намаляват съдържанието на колаген, докато CF екстрактите подобряват разграждането на колагена. Резултатите от анализа на имунофлуоресцентно оцветяване на CF екстракт върху колаген са в съответствие със съдържанието на колаген на фигури 11b и 12a,b.

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】