Протеомично ландшафтно картографиране на болестта на Бехчет с разграничаване на органите с използване на задълбочена плазмена протеомика за идентифициране на експресия на хиалуронов свързващ протеин 2, свързана със съдово засягане

Обективен.

Това проучване е предприето, за да се изясни патогенезата и хетерогенността на болестта на Бехчет (BD), включваща различни органи, като се използва задълбочена протеомика за идентифициране на биомаркерите за клинична оценка и лечение на пациенти с BD.

Методи.

Измерихме нивата на експресия на протеини в плазмени проби от 98 пациенти с BD и 31 здрави контроли, използвайки нашата платформа за задълбочена протеомика с масспектрометър за придобиване, независимо от данните, и микрочипове на антитела. Извършихме биоинформатични анализи на биологичните процеси и сигналните пътища, които бяха променени в групата на BD, и конструирахме протеомичен пейзаж на органно-разрешена патогенеза на BD. След това потвърдихме биомаркерите за тежестта на заболяването и съдовата подгрупа в независима кохорта от 108 пациенти с BD и 29 здрави контроли, използвайки ензимно-свързан имуносорбентен анализ.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Резултати.

Групата BD има 220 диференциално експресирани протеини, които дискриминират пациентите с BD (88,6%) и здрави контроли (95,5%). Биоинформационните анализи разкриха различни биологични процеси, свързани с патогенезата на BD, включително активиране на комплемента, зарастване на рани, ангиогенеза и имунитет, медииран от левкоцити. Освен това, конструираният протеомичен пейзаж на органно-разделени BD идентифицира протеомични характеристики на BD, свързани с различни органи и протеинови цели, които могат да бъдат използвани за разработване на лечение. Хиалуроновият свързващ протеин 2, тенасцин и серпин А3 бяха валидирани като потенциални биомаркери за клиничната оценка на съдовата BD и целите на лечението.

Заключение.

Нашите резултати предоставят ценна представа за патогенезата на органно-разделената BD по отношение на протеомичните характеристики и потенциалните биомаркери за клинична оценка и потенциални терапии за съдова BD.

ВЪВЕДЕНИЕ

Болестта на Бехчет (BD) е мултисистемен, хроничен васкулит, който е силно разпространен сред населението по древния търговски път, известен като Пътя на коприната. Проучване от 2016 г. установи, че разпространението на BD в Турция е 602 на 100,000 сред юношите/възрастното население (1). BD е силно хетерогенен и пациентите имат мултиорганно засягане, включително орални язви, генитални язви, увеит и кожни лезии; BD може да бъде фатален в резултат на разкъсани съдови аневризми или тежки неврологични усложнения. Молекулните характеристики на BD, свързани с различни органи, са неизвестни. Клиничните диагностични методи и последващите възможности за лечение зависят главно от клиничните симптоми. Въпреки това, няма налични биомаркери, които да позволяват диференциране на BD въз основа на участието на различни органи. В сравнение с геномиката, протеомиката предлага алтернативен подход за получаване на изобилна информация за патогенезата на BD и намиране на биомаркери за диагностика и терапия на BD. Lee et al откриха 22 диференциално експресирани протеина с помощта на 2-дименсионална електрофореза, комбинирана с матрично-асистирана лазерна десорбция/йонизация тандемна времепролетна масспектрометрия (2). Три уникални протеина в чревния BD (фибрин, аполипопротеин A-IV и серумен амилоид A) бяха допълнително валидирани в независима кохорта с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Използвайки масиви от цитокинови топчета Bio-Rad, съдържащи 25 възпалителни цитокини, Lopalco et al установиха, че gp130/секретиран интерлевкин-6 (IL-6) рецептор, секретиран IL-6 рецептор, IL{{19} } и серумните нива на тимусния стромален лимфопоетин са значително повишени в подгрупата на BD с мукокутанни прояви и очно засягане в сравнение с подгрупата само с мукокутанно засягане (3). Въпреки това информацията, получена в тези проучвания, е ограничена, тъй като групите протеини и пациенти са малки и идентифицираните биомаркери не са добре валидирани. За това проучване проведохме, доколкото ни е известно, първото всеобхватно профилиране на плазмен протеом на BD, използвайки нашата задълбочена протеомна платформа, интегрирана с независимия от данни масспектрометър за придобиване (DIA-MS) с адаптивни микрочипове на антитела (4). С данните от протеомиката анализирахме протеини, които са били различно експресирани между пациенти с BD и здрава контролна група и биологичните процеси и пътища на тези протеини относно патогенезата на BD. Освен това, ние конструирахме BD пейзаж с разделяне на органи и идентифицирахме протеомичните характеристики на всеки орган. Биомаркерите за съдова BD и тежестта на заболяването бяха валидирани в независима кохорта.

ПАЦИЕНТИ И МЕТОДИ

Това проучване е одобрено от Комитета по медицинска етика на Пекин Юниън Медикъл Колеж Болница (JS-2049). Тази статия не съдържа идентифицируеми данни за нито един пациент с BD или здрав контролен участник. Кохортата за откриване включва 98 пациенти с BD и 31 здрави контроли. Плазменият протеом се измерва в дълбочина с помощта на DIA-MS и микрочипове на антитела. Използвани са биоинформационни анализи за идентифициране на променените биологични механизми в групата на BD и за конструиране на протеомичния пейзаж на органно-разделения BD. Кандидат плазмените биомаркери бяха валидирани с помощта на ELISA в независими кохорти, включващи здрави контроли и пациенти с BD и артериит на Takayasu. Клиничните характеристики и информацията за лечението на кохортите за откриване и валидиране са показани в допълнителни таблици 1-6, а подробните експериментални процедури са описани в допълнителните материали, достъпни на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley. com/doi/10.1002/art.42348.

РЕЗУЛТАТИ

Характеристики на пациента. Клиничните характеристики на пациентите с BD и употребата им на глюкокортикоиди (GC) и имуносупресори по време на вземането на кръв са показани в допълнителна таблица 1, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi / 10.1002/чл.42348. В нашия протеомичен анализ не са наблюдавани значителни разлики в пола и възрастта между 98 пациенти с BD и 31 здрави контроли (кохорта за откриване) (допълнителна таблица 1). В групата на BD, 45, 38 и 15 пациенти са имали съответно лека, умерена и тежка BD. Всички пациенти с BD са имали орални язви, а > 20% са имали генитални язви (80,6%), кожни лезии (65,3%), очни лезии (23,5%) и съдово засягане (22,4%). Съдовото засягане на пациенти с BD в кохортата за откриване е показано в допълнителна таблица 2, а характеристиките на кохортите за валидиране, които са приложени за проверка на експресията на кандидат биомаркери, са показани в допълнителни таблици 3–5 (достъпни на уебсайта за артрит и ревматология приhttps://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348).

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Задълбочено профилиране на плазмен протеом при пациенти с BD с помощта на DIA-MS и микрочипове на антитела. Схематична илюстрация на изследването за профилиране на протеини е показано на Фигура 1А и Допълнителна Фигура 1, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi/ 10.1{{11} }02/арт.42348. Всички плазмени проби от пациенти с BD и здрави контроли бяха измерени с помощта на нашата задълбочена платформа за плазмена протеомика, състояща се от DIA-MS и микрочипове на антитела с висока възпроизводимост. Коефициентите на корелация на Spearman за откриване на плазмени протеини с помощта на микрочипове на антитела бяха съответно 0.98 и 0.93 в и между различни масиви (допълнителни фигури 2A и 2B, достъпни на уебсайта за артрит и ревматология на https ://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Коефициентът на корелация на Spearman за откриване на плазмен протеин с помощта на DIA-MS е 0,92 (диапазон 0,87–0,96; допълнителна фигура 2C). Представителни сканирани изображения от микрочипове на антитела за пациенти с BD и здрави контроли са показани на допълнителна фигура 3, достъпна на https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348. Резултатите показват, че като цяло плазмените протеини на пациенти с BD са били регулирани нагоре в сравнение с плазмените протеини на здрави контроли. С нашата задълбочена платформа за плазмена протеомика ние идентифицирахме 759 протеина (допълнителни фигури 1, 4 и 5, достъпни на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348), които бяха разпределени на приблизително 10 порядъка в плазмата (Фигура 1В). Тези протеини включват 410 протеинови биомаркери (База данни за биомаркери на плазмени протеини при човешки заболявания, онлайн на http://biokb.ncpsb. org. cn/hdpp/#/) и 388 терапевтични цели, които в момента са одобрени или са подложени на изследване в текущи клинични изпитвания (Therapeutic Target Database, онлайн на http://db.idrblab.net/ttd/) (Фигура 1B). Функционалните анотации на тези биомаркери и терапевтични цели показват, че тези протеини принадлежат към различни автоимунни и автовъзпалителни заболявания, включително BD, лупусен нефрит, анкилозиращ спондилит и васкулит (фигури 1C и 1D и допълнителни таблици 7 и 8, налични в Arthritis & Rheumatology уебсайт на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi/ 10.1002/art.42348). Тези резултати предполагат, че плазмените протеини, открити с нашата платформа, са тясно свързани с появата и развитието на BD.

Фигура 1. Протеомно профилиране на плазмени проби от пациенти с болестта на Бехчет (BD) с помощта на задълбочена протеомна платформа с независима от данни масова спектрометрия (DIA-MS) и анализ на микрочипове на антитела. Работен процес на нашето протеомично изследване на BD. B, Разпределение на концентрациите на плазмени протеини, открити с DIA-MS и микрочипове на антитела според референтните концентрации в база данни за човешки плазмени протеоми (http://www.plasmaproteomedatabase.org/). C, Заболявания, свързани с откритите протеинови биомаркери, които са идентифицирани с помощта на база данни за биомаркери на плазмени протеини на човешки заболявания (HDPP) (http://biokb.ncpsb.org.cn/hdpp/#/). D, Заболявания, свързани с откритите терапевтични целеви протеини, които са идентифицирани с помощта на терапевтична целева база данни (TTD) (http://db.idrblab.net/ttd/). Размерите на кръговете в C и D съответстват на броя на протеините, обогатени при всяко заболяване. HC=здрав контрол; FASP=подготовка на проби с помощта на филтър; QE-HF=Exactive HF Hybrid Quadrupole Orbitrap (ThermoFisher) масспектрометър; Strep-PE=стрептавидин-фикоеритрин; ELISA=ензимно-свързан имуносорбентен анализ; IgA=имуноглобулин А.

Анализ на широк протеом на диференциално експресирани плазмени протеини, свързани с BD. Допълнителна фигура 1, достъпна на https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ art.42348, показва блок-схемата на това как диференциално експресираните протеини от DIA-MS и резултатите от микрочипове на антитела са идентифицирани и интегрирани. Общо 493 протеина бяха насочени към DIA-MS, от които 379 протеина бяха задържани с<29 missing values in the BD group and < 7 missing values in the healthy control group. After 36 proteins with potential contaminations from blood cells (5) were removed, we analyzed 343 additional proteins for hypothesis testing, of which 166 proteins showed a statistically significant difference between the BD and healthy control groups. The antibody microarray detected 549 proteins. After 5 control proteins were removed, we retained 544 proteins for further analysis; of these, 74 proteins showed statistically significant differences between the BD group and the healthy control group (Supplementary Figure 1). In total, 220 (29.0%) of 759 proteins were significantly differently expressed between the BD group and the healthy control group (P < 0.05), as shown using our in-depth proteomics platform comprising DIA-MS and the antibody microarray (Figure 2A and Supplementary Figures 1 and 5, available at https:// onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). The number of differentially expressed proteins is 10-fold more than previously reported (2,3,6). Among these proteins, 5 were identified as potential plasma or serum biomarkers in proteomics research for patients with BD, including haptoglobin, apoprotein, transthyretin, immunoglobulin light chain, and immunoglobulin heavy chain. Furthermore, growth arrest–specific 6, resistin, von Willebrand factor (VWF), and others were also identified to be increased in the BD group (Figure 2B). We identified 215 new proteins associated with BD, including serpin A3 (SERPINA3), glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D1 (GPLD1), and attractin (ATRN) (Figure 2C).

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

За да определим дали пациентите с BD могат да бъдат разграничени от здрави контроли, извършихме непредубеден йерархичен клъстерен анализ на 220 диференциално експресирани протеина (P < 0.05), в който { {3}}.0% от пациентите с BD и 86.4% от здравите контроли са групирани (допълнителна фигура 6, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley. com/doi/ 10.1002/чл.42348). Сред 130 диференциално експресирани протеини (P <0.01), открихме, че 88.6% от пациентите с BD и 95.5% от здравите контроли са групирани (Фигура 2D). Допълнителен частичен дискриминантен анализ на най-малките квадрати разкри, че пациентите в групата на BD са ясно разграничими от здравите контроли според класификацията на диференциално експресирани протеини (допълнителна фигура 7, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley. com/doi/10.1002/art.42348). Обогатяването на заболявания с помощта на платформата DisGeNET (7) допълнително показва, че тези диференциално експресирани протеини са значително свързани с възпаление и автоимунни и съдови заболявания, включително BD и васкулит (Фигура 2E и допълнителна таблица 9, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на https ://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). В нашия биоинформатичен анализ с помощта на Cytoscape и CluGo бяха идентифицирани следните 8 основни биологични процеса в BD: 1) активиране на комплемента, 2) регулиране на нивата на плазмените липопротеинови частици, 3) заздравяване на рани, 4) ангиогенеза, 5) медииран от левкоцити имунитет, 6 ) пептидазна активност, 7) положителна регулация на клетъчното активиране и 8) миграция на левкоцити (Фигура 2F и допълнителна таблица 10, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348 ). Тези биологични процеси се сближават с патологичния механизъм на възпаление и коагулация по време на развитието на BD, при който липидните профили и модификацията от оксидативен стрес по време на възпаление водят до ендотелна дисфункция и съдови събития (8–11).

Последователно, най-значимият път от базата данни на KEGG (достъпна на http://www.genome.ad.jp/kegg) е каскадите на комплемента и коагулацията (Фигура 3A), където 38 протеина (P < 0).05 ) бяха идентифицирани, включително 19 комплемента (C) компонента (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, C4B, C4b-свързващ протеин алфа верига [C4BPA], C5, C6, C7, C8 алфа верига, C8 бета верига, C8 гама верига [C8G], C9, фактор на комплемента [CF] B, CFH, CFH-свързан протеин 4 [CFHR4], CFI и протеин, подобен на компонентен рецептор 1), 5 коагулационни фактора (F11, F12, F13B, F5 и F9 ), 4 протеина, свързани с коагулацията (тъканен тип плазминогенен активатор [PLAT], протеин С, антикоагулантен протеин S [PROS1] и VWF) и 5 ​​протеина от семейство серпин (SERPINA1, SERPINC1, SERPIND1, SERPINF2 и SERPING1). Двадесет и пет протеина в каскадата бяха лекарствени цели за терапевтично лечение (Фигура 3B). Интересното е, че повечето протеини, включени в пътя на KEGG и каскадите на комплемента и коагулацията, се припокриват с тези, участващи в най-обогатените биологични процеси на коагулация на кръвта/заздравяване на рани (Фигура 3B и допълнителна таблица 10, достъпна на https://onlinelibrary.wiley.com/ doi/10.1002/арт.42348.). Няколко пътя на патогенна инфекция бяха идентифицирани с помощта на анализ на пътя на KEGG в проучването, включително инфекция със Staphylococcus aureus, прионна болест, коклюш, инфекция с човешки папиломен вирус, инфекция с херпес симплекс вирус 1 и взаимодействия на вирусен протеин с цитокини и цитокинов рецептор, подчертавайки ролята на патогенната инфекция в BD (допълнителна фигура 8A, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология наhttps://onlinelibrary.

Фигура 2. Протеините са диференцирано експресирани между пациенти с BD и здрави контролни групи, идентифицирани чрез DIA-MS и микрочипове на антитела. Диаграма на вулкан, илюстрираща нерегулираните протеини при пациенти с BD спрямо здрави контролни групи. Значително регулирани нагоре и регулирани надолу протеини (P < 0.05) са посочени съответно като червени и сини точки. B, Графики на разсейване, показващи интензитета на експресия на представителни протеини в плазмата на пациенти с BD и здрави контроли. Символите представляват отделни проби; хоризонталните линии показват медианата. C, диаграма на Venn, сравняваща броя на диференциално експресираните протеини при пациенти с BD, идентифицирани в нашето проучване, с тези, идентифицирани в предишни проучвания. D, Анализ на йерархично групиране на диференциално експресирани протеини (P < 0.01) между BD и здрави контролни групи, където 88,6% от пациентите с BD и 95,5% от HCs са групирани. Прекъснатата правоъгълна област показва всяка група заедно със съответните силно експресирани протеини. E, Обогатяване на заболявания (извлечени от платформата DisGeNET), свързани с нерегулирани протеини при пациенти с BD спрямо здрави контроли (log10 [q стойност] < -15). F, Значително обогатени биологични процеси, идентифицирани с помощта на диференциално експресирани протеини при пациенти с BD в сравнение със здравните контроли (P < 0.05). *=P < 0,05; **=P < 0,01; ***=P < 0,001; ****=P < 0,0001. GAS6=спиране на растежа – специфично 6; RETN=резистин; VWF=фактор на фон Вилебранд; SERPINA3=серпин А3 (1-антихимотрипсин); GPLD1=гликозилфосфатидилинозитол-специфична фосфолипаза D1; ATRN=атрактин (вижте Фигура 1 за други определения).

Фигура 3. Сигнални пътища, свързани с патогенезата на BD. A, Значително обогатени сигнални пътища, свързани с диференциално експресирани протеини при пациенти с BD спрямо здрави контроли, идентифицирани с помощта на базите данни KEGG и Reactome (P < 0.01). Червеният шрифт показва пътища, свързани с коагулацията на кръвта и активирането на комплемента. B, Каскади на комплемента и коагулацията, идентифицирани с помощта на базата данни KEGG, показващи най-значимите асоциации с диференциално експресирани протеини при пациенти с BD спрямо здрави контроли. Посочени са сигнатурните протеини, които могат да бъдат насочени от известни одобрени лекарства. C и D, значително обогатеният протеинов домен (C) и клетъчните компоненти (D), идентифицирани от значително експресираните протеини при пациенти с BD спрямо здрави контроли (P <0,01). В A, C и D дължините на стълбовете показват логаритмична основа 10 на стойността на P, а числата до стълбовете показват броя на протеините, включени във всяка категория. IGF=инсулиноподобен растежен фактор; IGFBP=инсулиноподобен растежен фактор свързващ протеин; C=допълнение; ER=ендоплазмен ретикулум; ECM=извънклетъчен матрикс; CUB=допълва C1r/C1s, Uegf и Bmp1; EGF=епидермален растежен фактор; Нагоре=повишено регулиране; Надолу=регулирано надолу (вижте Фигура 1 за други определения).

wiley.com/doi/10.1002/art.42348) (12–17). Пътят на KEGG на инфекция със Staphylococcus aureus, включващ 13 диференциално експресирани протеини (P <0,05), е значително обогатен (някои от тях са маркирани в допълнителна фигура 8B), което предполага ролята на инфекцията със Staphylococcus aureus в патогенезата на BD (18, 19). И накрая, анализът на обогатяването идентифицира комплементни домейни, включително домейна, богат на протеини за контрол на комплемента, Sushi repeat, мембранно-атакуващия комплекс/перфорин, компонента на комплемента C1q домейн и CUB домейна (за комплементи C1r/C1s, Uegf и Bmp1 ) (Фигура 3C). Анализът на обогатяването на клетъчните компоненти разкрива, че регулираните нагоре протеини са обогатени, наред с други, в съдържащия колаген екстрацелуларен матрикс, лумен на секреторни гранули, тромбоцитна алфа гранула и плазмени липопротеинови частици, но регулираните надолу протеини са основно обогатени в извънклетъчно пространство и екзозома (Фигура 3D).

За да изследваме влиянието на лечението върху плазмените протеини, групирахме пациенти с BD според лечението с GCs и имуносупресори. Пациентите с BD със или без лечение могат да бъдат ясно разграничени от здрави контроли (допълнителна фигура 9A, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art. 42348). Анализът показа, че повечето биологични процеси, които са се променили при пациенти с BD, които са били лекувани, спрямо пациенти с BD, които не са били лекувани с GCs и имуносупресори, са свързани с регулирането на имунологичните отговори (допълнителна фигура 9B). Ние също така сравнихме диференциалната експресия на плазмени протеини между пациенти с BD без лечение и пациенти с BD, които са получавали GC и имуносупресивно лечение. Резултатите идентифицират 68 диференциално експресирани протеини (P <0,05), участващи, например, в регулирането на нивата на плазмените липопротеинови частици и клирънса и активността на ендопептидаза от серинов тип (допълнителна фигура 10, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на https:// onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348).

Протеомичен пейзаж на разделящия орган BD. BD е силно хетерогенно заболяване с мултиорганно засягане, представящо се с различни фенотипни прояви (допълнителна таблица 1, достъпна на https://onlinelibrary.wiley. com/doi/10.1002/art .42348). Проучванията се опитват да подкатегоризират BD въз основа на клинични прояви (20–23). За да изследваме хетерогенността сред пациенти с BD въз основа на протеомични данни, ние извършихме неконтролирано консенсусно групиране на 220 диференциално експресирани протеини (Фигура 4А). Анализът на основните компоненти разкри ясно отделяне на подтип I и подтип II от подтип III (Фигура 4B). Подтип I-специфични протеини участват главно в коагулацията на кръвта и активирането на комплемента, подтип II-специфични протеини участват главно в глюкозния и протеиново-липидния метаболизъм, а подтип III-специфични протеини участват във възпалителния отговор (Фигура 4D и Допълнителна Фигура 11, наличен на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Въпреки че не са открити статистически значими разлики по отношение на клиничните характеристики сред групите BD с протеомичен подтип, ние открихме, че подтип I и подтип II са сходни (Фигура 4B), което е в съответствие с резултатите от анализа на основните компоненти. Пациентите с BD с подтип I и подтип II са имали по-висок процент на тежки симптоми, включително засягане на нервната система (13,8% сред подтип I и 8,2% сред подтип II спрямо 0% сред подтип III) и съдово засягане (27,6% сред подтип I и 22,4% % сред подтип II срещу 0% сред подтип III). Въпреки че пациентите с BD с подтип III са имали относително леки до умерени симптоми, те са имали по-висок процент кожни лезии (87,5% сред подтип III спрямо 51,7% сред подтип I и 65,3% сред подтип II) (Фигура 4E, допълнителна таблица 11, достъпен на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Има натрупани доказателства, показващи промени в множество биологични процеси по време на развитието на BD, включително автовъзпаление, редокс дисбаланс, метаболомни промени, дислипидемия и коагулационна дисфункция (8,24–27). Следователно, нашите резултати предполагат, че въпреки че пациентите с BD, които принадлежат към подтип I и подтип II протеомични групи, имат по-висока тежест на BD, биологичните механизми за двете групи може да са различни.

растение цистанче, повишаващо имунната система

Извършихме клъстерен анализ на кохортата BD въз основа на клинични данни (пол, възраст, оценка на тежестта и клинични прояви), използвайки {{0}}етапен клъстерен анализ (23). Както е показано на Фигура 4E, пациентите с BD са класифицирани в 2 групи (групи 1 и 2), където пациентите са категоризирани по симптоми като орални язви, кожни лезии, очни лезии и генитални язви. Пациентите с BD в клъстер 1 са имали значително по-голяма честота на фенотип на артрит, включващ симптоми на артралгия (40,0%) и засягане на стомашно-чревната (8,9%), съдовата (48,9%) и нервната (22,2%) система в сравнение с пациентите с BD в клъстер 2. След това сравнихме клиничната и протеомичната класификация в една и съща група BD. Резултатите показват, че пациентите в класификациите на протеомични подтипове I и II и в клиничен клъстер 1 споделят подобни клинични характеристики, като пациентите показват мултиорганно (т.е. стомашно-чревна, съдова и нервна система) участие и по-висока тежест на заболяването (Фигура 4E). Обратно, пациентите в класификацията на протеомичния подтип III и в клиничния клъстер 2 показват сходни клинични характеристики, като никой не демонстрира засягане на стомашно-чревния тракт, съдовата и нервната система. Тези констатации могат да бъдат допълнително подкрепени от непредубедени йерархични клъстерни анализи (Фигура 4F), при които пациентите в протеомичен подтип III са групирани с клиничен клъстер 2, а пациентите в протеомичен подтип I и II са групирани с клиничен клъстер 1. Тези резултати демонстрират потенциалната полезност на протеомната класификация при посочване на хетерогенност и тежест на BD. Терапевтичната стратегия за пациенти с BD до голяма степен зависи от клиничните характеристики и засегнатия орган. Въпреки това, протеомичните характеристики на органно-разделения BD са неизвестни.

Фигура 4. Класификация на пациенти с BD с помощта на плазмена протеомика и клинични променливи. A, Heatmap на консенсусната матрица, показваща съпътстващи пропорции на пациенти с BD с всеки протеомичен подтип. B, Анализ на основните компоненти на протеомични подтипове I, II и III при пациенти с BD, показващи забележителни разлики между клъстерите. C, Анализ на йерархично групиране на диференциално експресирани протеини (P < 0.05, средна разлика в експресията P > 0,2) в 3-те протеомични подтипа при пациенти с BD. D, Функционални групи от биологични процеси според специфичните протеини, свързани с 3-те подтипа. E, Разпределение на демографските и клиничните характеристики на пациентите с BD според протеомичните подтипове и клъстерите за клинична класификация. F, Разпределение на всяка клинична характеристика според протеомични подтипове и клинични класификационни клъстери в кохортата BD, въз основа на непредубеден йерархичен клъстерен анализ. Вижте фигура 1 за дефиниции.

Фигура 5. Картографиране на ландшафта на BD с разделяне на органи с помощта на плазмена протеомика. A, Протеомичен пейзаж на BD с разделени органи. Вляво: Диаграма, илюстрираща кратната промяна в експресията на протеин при пациенти с BD спрямо здрави контроли според фенотипа. Трите блока представляват, отляво надясно, здрави контроли, пациенти с BD без (wo) съответни симптоми и пациенти с BD със съответните симптоми. Интензитетът на цвета на всеки блок е пропорционален на кратната промяна в протеиновата експресия между BD и здравите контролни групи. Червеното и синьото показват съответно регулирани нагоре и регулирани надолу протеини. Вдясно, биологичният процес, свързан с всеки диференциално експресиран протеин, със сивия интензитет на квадратчетата, показващи log10-базирана P стойност и число, показващо броя на протеините, включени във всяка категория. B, Корелация (на Pearson или Spearman) между експресията на хиалуронан-свързващ протеин 2 (HABP2), тенасцин C (TNC) и серпин A3 (1-антихимотрипсин) (SERPINA3) и оценките за тежест на пациенти с BD. Засенчването показва 95% CI. C, графики на Violin, показващи интензитета на експресия на HABP2, TNC и SERPINA3 спрямо тежестта на заболяването при здравия контрол и групите с лека, умерена и тежка BD. Символите представляват отделни проби; пунктираната червена хоризонтална линия показва медианата, като горната и долната пунктирани черни линии показват интерквартилния диапазон. *=P < 0.{{20}}5; **=P < 0.01; ***=P < 0,001; ****=P < 0,0001. Вижте фигура 1 за дефиниции.

По този начин ние идентифицирахме 58 протеина, специфично експресирани в различни групи пациенти с BD, които показват различни фенотипове на органи (Фигура 5А). Нашето търсене в базата данни на DrugBank (достъпна на https://go.drugbank.com/) разкри, че 26 протеина, а именно аполипопротеин A-IV, CFI, церулоплазмин (CP), глутамат дехидрогеназа 1 (GLUD1), хиалуронов свързващ протеин 2 (HABP2), F5, SERPINC1, SERPINA3, трансферинов рецепторен протеин 1 (TFRC), VWF, SERPINF2, CD44, Fc регионален рецептор III-A, аланин аминотрансфераза 1, левкотриен A-4 хидролаза, пропротеин конвертаза тип субтилизин/кексин 9, ангиотензиноген, C8G, хаптоглобин, пептидил-пролил цис-транс изомераза A, селенопротеин P, SERPIND1, SERPING1, C4BPA, лимфотоксин алфа, C4B и интертрипсин тежка верига 4, са мишени на терапевтични лекарства, използвани в клиники или в процес на разработка (Допълнителна таблица 12, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi/ 10.1002/art.42348.). Сред фенотипите фенотипът на артрит, включващ симптоми на артралгия, е обогатен с биологичните процеси, свързани с автоимунитета, включително регулирането на хуморалния имунен отговор, медииран от циркулиращи имуноглобулини, регулиране на В-клетъчно-медииран имунитет и регулиране на медиирания от имуноглобулин имунен отговор ; стомашно-чревният фенотип е свързан с регулирането на активирането на комплемента и В-клетъчно-медиирания имунитет; фенотипът, участващ в сърцето, е свързан с активността на цитокиновия рецептор, регулирането на метаболитния процес на колаген и разглобяването на извънклетъчния матрикс; фенотипът на епидидимит е свързан с отговора на острата фаза; и фенотипът на кожната лезия е свързан с активност на инхибитор на ендопептидаза от серинов тип, коагулация на кръвта, хуморален имунен отговор, медииран от циркулиращия имуноглобулин, и други процеси (Фигура 5А и допълнителна таблица 13, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на https://onlinelibrary .wiley.com/doi/ 10.1002/art.42348).

Съдовият фенотип има най-голям брой диференциално експресирани протеини, включително GLUD1, тенасцин С (TNC), XC мотив хемокинов лиганд 2, епидермален растежен фактор, съдържащ фибулин извънклетъчен матричен протеин 1, HABP2, F5, ATRN, SERPINC1, GPLD1, инсулиноподобен растежен фактор свързващ протеин 6, лектин маноза-свързващ 2, SEPRINA3, TFRC, VWF, SERPINF2 и рибонуклеаза А член на семейство 4 (Фигура 5А). Анализът на биоинформатика допълнително разкрива, че тези диференциално експресирани протеини участват в дегранулацията на тромбоцитите, коагулацията на кръвта, посттранслационното протеиново фосфорилиране, активността на инхибитора на ендопептидазата от серинов тип и острия възпалителен отговор, наред с други функции. Всички тези резултати демонстрират протеомичния пейзаж на органно-разделени BD, от които може да се разработи персонализирано лекарство за целевите протеини във всеки фенотип на орган.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Identification of plasma proteins related to BD severity. Among the 220 unique differentially expressed proteins (P < 0.05), 28 were positively correlated with the severity of BD (Figures 5B and 5C and Supplementary Figure 12, available on the Arthritis & Rheumatology website at https://onlinelibrary. wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Seven proteins displayed a linear correlation with the severity score, namely, TNC, HABP2, SERPINA3, F5, ATRN, C4B, and CFH (Figure 5B and Supplementary Figure 12A). The expression of these 7 proteins was up-regulated in the severe BD group compared with the mild and moderate BD groups and the healthy control group, as indicated in the scatter plot in Figure 5C (see also Supplementary Figure 12A). Next, we selected and validated 7 protein candidates (TNC, HABP2, SERPINA3, ATRN, C4BPA, GPLD1, and C5) in an independent cohort composed of 108 patients with BD and 29 healthy controls by using quantitative ELISA (Supplementary Table 3, available at https://onlinelibrary.wiley. com/doi/10.1002/art.42348). The reproducibility of the ELISA for the validation of plasma proteins was >0.9 (Допълнителна фигура 13, достъпна на https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ art.42348). Повишените плазмени нива на HABP2, TNC и SERPINA3 бяха потвърдени в групата на BD в сравнение със здравата контролна група (Фигура 6A), както и тяхната корелация с тежестта на заболяването (Фигури 6B и 6C). Ние също така сравнихме експресията на HABP2, оценена с помощта на ELISA, между пациенти с BD (n=39) и контролни групи от пациенти с артериит на Takayasu (n=8) и здрави контроли (n=10 ) (Допълнителна фигура 14 и допълнителна таблица 5, достъпни на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348.). Резултатите показват, че концентрацията на HABP2 е значително по-висока в групата на BD, отколкото концентрацията в артериит на Takayasu и здрави контролни групи (допълнителна фигура 14), което показва специфичността на HABP2 като потенциален биомаркер за диагностика на BD.

Съгласно степента на тежест на Krause съдовите симптоми имат максимална тежест. По този начин ние разделихме пациентите на съдови BD и неваскуларни BD групи според наличието на венозна тромбоза, артериална стеноза, оклузия, дилатация или аневризма (допълнителна таблица 4, достъпна на https://onlinelibrary. wiley.com/doi/1 0.10{{20}}2/арт.42348). Сравнихме нивата на експресия на HABP2, TNC и SERPINA3 сред васкуларните BD, неваскуларните BD и здравите контролни групи. Резултатите показват, че 3-те протеина са значително повишени в групата на съдовата BD (Фигура 6D). Беше извършен и анализ на кривата на работните характеристики на приемника за HABP2, TNC и SERPINA3, в който бяха определени граничната стойност, чувствителността и специфичността (допълнителна таблица 14, достъпна на https://onlinelibrary.wiley.com/doi/1{{24 }}.1002/арт.42348.). Резултатите показват, че HABP2 (площ под кривата [AUC] 0,68, чувствителност 0,69 и специфичност 0,69) и TNC (AUC 0,71, чувствителност 0,58 и специфичност 0,77) могат да разграничат съдова от несъдова BD. Нивата на 3-те биомаркера бяха сравнени между пациенти с неактивна и активна съдова BD. Резултатите показват, че нивата на експресия на HABP2, TNC и SERPINA3 са постоянно по-високи при пациенти с BD, независимо от васкуларната BD активност (допълнителна фигура 15, достъпна на уебсайта за артрит и ревматология на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi /10.1002/арт.42348).

Фигура 6. Валидиране на съдовите BD биомаркери, оценени чрез ELISA в независимата кохорта. A, C и D, плазмени концентрации (Conc) на хиалуронан-свързващ протеин 2 (HABP2), тенасцин C (TNC) и серпин A3 (1-антихимотрипсин) (SERPINA3) в здравата контролна група спрямо всички BD пациенти (A), спрямо пациенти с BD в групите с леко, умерено и тежко заболяване (C) и спрямо пациенти с неваскуларна BD (N-VBD) и васкуларна BD (VBD) (D). B, Корелация (на Pearson или Spearman) между концентрациите на HABP2, TNC и SERPINA3 и резултатите за тежест на BD. Засенчването показва 95% CI. *=P < 0.05; **=P < 0.01; ***=P < 0,001; ****=P < 0,0001. Вижте фигура 1 за дефиниции.

Корелационен анализ между плазмените протеини, оценката на текущата активност на болестта на Бехчет и клиничните данни. HABP2, TNC и SERPINA3 показаха повишени нива в групата с активен BD в сравнение с неактивния BD и здрави контролни групи (P < 0.001) (допълнителна фигура 16A, налична в Arthritis & Rheumatology уебсайт на адрес https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Нивото на SERPINA3 беше повишено в групи с високи резултати от формуляра за текуща активност на болестта на Бехчет (BDCAF) (допълнителна фигура 16B). Освен това, при пациенти с BD, нивата на SERPINA3 и BDCAF резултатите са положително корелирани (r=0.39, p=0.0036), докато нивата на HABP2 и TNC не показват положителна корелация с BDCAF резултати. Допълнително анализирахме корелацията между плазмените нива на пациента и клиничните данни (допълнителна фигура 17А и допълнителна таблица 15, достъпни на https://onlinelibrary.wiley.com/doi/ 10.1002/art.42348.). Коефициентът на корелация r> 0,3 беше подчертан в диаграмата на хордата. Представителните диаграми на разсейване са показани на допълнителни фигури S17B–G. Резултатите показват, че нивата на HABP2, TNC и SERPINA3 корелират положително с нивото на С-реактивния протеин, броя на неутрофилите, ширината на разпределение на червените кръвни клетки, съотношението неутрофили към лимфоцити, броя на тромбоцитите и ширината на разпределение на тромбоцитите. Всички тези резултати показват, че HABP2, TNC и SERPINA3 са функционално свързани с възпаление, ендотелна функция и активиране на тромбоцитите и могат да служат като биомаркери за показване на тежестта и активността на BD, което трябва да бъде валидирано в различна клинична кохорта в бъдеще .

ДИСКУСИЯ

BD е системен васкулит с хетерогенна клинична изява, която отразява различните патогенни механизми, отговорни за предизвикване на възпаление в артериите и вените с всякакъв размер в човешките тъкани и органи. В това проучване ние идентифицирахме голям набор от нерегулирани протеини (n=220) в групата пациенти с BD, които участват в различни биологични процеси, и използвахме биоинформатичен анализ, за ​​да определим взаимодействието между имунитета и възпалението, наличието на тромбоза и патологичната роля, медиирана от системата на комплемента при BD. Анализът на KEGG допълнително разкрива връзката на BD с каскадите на комплемента и коагулацията и бактериалната инфекция. Системата на комплемента медиира вродения имунитет и възпалението за защита срещу патогени чрез дегранулация, хемотаксис, фагоцитоза, сигнален път на В-клетъчен рецептор и клетъчен лизис от мембранно-атакуващия комплекс, докато коагулационните каскади са замесени в противовъзпалителния отговор, вазодилатацията, повишена ендотелна пропускливост и активиране на тромбоцитите. Използвайки данни за асоцииране в целия геном, Bakir-Gungor et al показаха, че каскадите на комплемента и коагулацията са 1 от 6-те споделени пътя между турски и японски пациенти с BD, което подкрепя нашите резултати от генетичния фон и допълнително демонстрира възпалителния механизъм и васкулопатията/ тромбофилия в патогенезата на BD (28). Медиираният от левкоцити имунитет, положителната регулация на клетъчното активиране и миграцията на левкоцитите демонстрират активните имунни и възпалителни реакции при BD. Неутрофилите се активират, за да произвеждат свободни кислородни радикали и неутрофилни извънклетъчни капани, причинявайки възпалително увреждане на съдовите ендотелни клетки, венозна тромбоза и аневризми. Реактивните кислородни видове, произведени от активни неутрофили, също могат да причинят окисление и модификация на липиди и липопротеини, особено липопротеини с ниска плътност, както е показано с повишена липидна пероксидация (9, 11), което впоследствие увеличава сърдечно-съдовия риск (9, 10) и, в на свой ред, увеличава възпалителния отговор (10). Това събитие е в съответствие с биологичните процеси на регулиране на нивата на плазмените липопротеинови частици и ремоделирането на протеин-липидния комплекс, наблюдавани в нашето изследване. Доказателствата от нашето проучване са в съответствие с констатациите от Emmi et al, свързващи производството на левкоцитни реактивни кислородни видове и плазмената липидна пероксидация (8).

Консенсусният клъстерен анализ, използващ протеомика, разкрива хетерогенността на пациентите с BD. Пациентите с подтип I са имали по-тежки симптоми, които могат да бъдат свързани с активния биологичен процес на кръвосъсирване и активиране на комплемента. Обратно, пациентите с подтип III са имали относително леки симптоми и възпалителният отговор може да бъде основният патологичен процес в тази подгрупа. Освен това идентифицирахме протеомичните характеристики на пациентите с BD с различно участие на органи. Нашите биоинформатични анализи ефективно илюстрират функциите на протеиновите характеристики на всеки фенотип на органа, както е илюстрирано от връзката между автоимунитета и фенотипа на артрит със симптоми на артралгия (29-31). Големи съдови събития, очни лезии и неврологично засягане са основните причини за заболеваемост и смъртност (16). Лечението на BD зависи от вида на засегнатия орган и тежестта на заболяването в тази органна система. Въпреки това, доколкото ни е известно, към днешна дата не е налична таргетна терапия за BD. Нашите резултати предполагат, че диагностичните процедури и терапията за всеки органно-разрешен BD може да се различават поради хетерогенността на патогенните механизми. Някои ключови протеини могат да бъдат лекарствени цели за фенотипове, включително стомашно-чревни, неврални, очни, ставни и съдови лезии.

Делът на пациентите със съдова BD сред различни раси и етноси варира от 7,7% до 43% (32); заболяването почти винаги е свързано с високорискова артериовенозна тромбоза и/или аневризма, висока тежест на заболяването и кумулативна 5-годишна честота на рецидиви от 38,4% (33). Счита се, че имунитетът и възпалителните фактори допринасят за съдовото засягане и проявите при BD. Известно е, че увреждането на ендотелните клетки води до склонност към тромботичен риск (34). Освен това увредените съдови стени след фиброза могат да доведат до отслабени артериални стени и разтягане на съдовите стени с последващи аневризми (35,36). Нередности, стеснения и оклузия могат също да бъдат предизвикани по време на остро възпаление и след фиброза (37), докато хроничното възпаление допълнително насърчава дисфункционалните вазодилататорни свойства на ендотела (38). HABP2, наричан също фактор VII-активираща протеаза, първоначално е открит чрез способността му да се свързва с хиалуронова киселина, гликозаминогликан, който има роля в регулирането на ендотелната клетъчна бариера (39) и участва в коагулацията на кръвта и фибринолизата (40). Предишни проучвания съобщават, че HABP2 може да активира възпаление, апоптоза и клетъчен растеж в съдовата гладка мускулатура и ендотелните клетки (41-43) и може да служи като регулатор на съдовата цялост и пропускливост чрез протеазно-активираните рецептори (PARs; подобно на тромбина). )/RhoA/ Rho-свързана протеин киназа (ROCK) сигнален път (44). Заглушаването (използвайки малка интерферираща РНК) на HABP2 или PAR/RhoA/ROCK инхибира HABP2-медиираното разрушаване на ендотелната клетъчна бариера (44). TNC е провъзпалителен извънклетъчен матричен гликопротеин, който допринася за образуването и разкъсването на плака чрез активиране на тромбоцитите или понижаване на тъканния плазминогенен активатор (45). Серумните нива на TNC са свързани с тежестта на атеросклерозата (46) и е доказано, че преходната експресия на TNC се регулира нагоре по време на съдово увреждане, но се изчиства след приключване на възстановяването (45).

SERPINA3, известен също като 1-антихимотрипсин, инхибира няколко серинови протеази, особено катепсин G (47). В допълнение към възпалителните клетки, по-малко контрактилните гладкомускулни клетки могат да бъдат дедиференцирани до макрофагоподобен фенотип, който също може да бъде източник на цитокини и SERPINA3 на мястото на нараняване на съдовата стена (48). Предишни проучвания показват, че активната роля на SERPINA3 в отрицателното регулиране на пролиферацията на васкуларни гладкомускулни клетки (49) или инхибиране на натрупването на неутрофили (47) може да бъде предсказваща появата на нежелани сърдечно-съдови събития. Въпреки това, дали SERPINA3 играе роля по време на патогенезата на васкулит при пациенти с BD или е продукт на патогенния процес, остава неясно. Трябва да се отбележи, че лекарството HABP2 хиалуронова киселина е анионен, несулфатиран гликозаминогликан, демонстриращ противовъзпалително действие, възстановяване на рани, регенериране на тъкани и други важни свойства; хиалуроновата киселина е изследвана при лечение на рак, офталмология, артрология, пневмология, ринология и урология и за други приложения (50). Има няколко малки молекули (цинков ацетат, цинков сулфат, цинк, цинков хлорид), насочени към SERPINA3 (допълнителна таблица 12, достъпна на https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/art.42348). Тези резултати показват, че биомаркерите, идентифицирани в нашата работа, могат също да служат като цели при разработването на нови терапии за пациенти с BD. Нашето проучване има няколко ограничения. Първо, броят на плазмените проби беше ограничен; биомаркерите, идентифицирани в нашето проучване, трябва да бъдат валидирани в различна и по-голяма кохорта с различни автовъзпалителни и автоимунни заболявания като контроли. Второ, резултатите трябва да бъдат проверени в кохорти от пациенти с BD, които не са лекувани досега. Трето, биологичните функции на биомаркерните протеини в патогенезата на BD трябва да бъдат изследвани в бъдещи проучвания, като се използват клетъчни и животински модели.

Взети заедно, доколкото ни е известно, това е първото проучване, което цялостно анализира протеомичните характеристики на BD, разделен от органи. Резултатите осигуряват фундаментална представа за хетерогенността и патогенезата на BD и подчертават плазмените протеини (HABP2, TNC и SERPINA3) като потенциални биомаркери за бъдеща клинична оценка и лечение на съдов BD.

ПРЕПРАТКИ

1. Bas¸ Y, Seçkin HY, Kalkan G, et al. Изследване на честотата на болестта на Бехчет и рецидивиращ афтозен стоматит: най-голямото разпространение в Турция. Balkan Med J 2016;33:390–5.

2. Lee HJ, Kim JH, Kim SW и др. Протеомен анализ на серумен амилоид като потенциален маркер при чревна болест на Бехчет. Dig Dis Sci 2017; 62: 1953–62.

3. Lopalco G, Lucherini OM, Lopalco A, et al. Сигнатури на цитокини при кожно-лигавична и очна болест на Бехчет. Front Immunol 2017; 8:200.

4. Xu M, Deng J, Xu K и др. Задълбочената серумна протеомика разкрива биомаркери за тежестта на псориазиса и реакцията към традиционната китайска медицина. Тераностика 2019; 9: 2475–88.

5. Geyer PE, Voytik E, Treit PV, et al. Профилиране на плазмен протеом за откриване и избягване на отклонения, свързани с пробите, при изследвания на биомаркери. EMBO Mol Med 2019;11:e10427.

6. Mao L, Dong H, Yang P и др. MALDI-TOF/TOF-MS разкрива повишен серумен хаптоглобин и амилоид А при болестта на Бехтерев. J Proteome Res 2008; 7: 4500–7.

7. Piñero J, Ramírez-Anguita JM, Saüch-Pitarch J, et al. Платформата за знания DisGeNET за геномика на заболяванията: актуализация от 2019 г. Нуклеинови киселини Res 2020; 48: D845–55.

8. Emmi G, Bagni G, Lastraioli E, et al. Уникален профил на циркулираща миРНК подчертава тромбовъзпалението при синдрома на Бехчет. Ann Rheum Dis 2022; 81: 386–97.

9. Orem A, Yandi YE, Vanizor B, et al. Оценка на автоантитела срещу окислително модифициран липопротеин с ниска плътност (LDL), чувствителност на LDL към окисление, серумни липиди и нива на липиден хидропероксид, общ антиоксидантен статус, активност на антиоксидантни ензими и ендотелна дисфункция при пациенти с болест на Бехчет. Clin Biochem 2002; 35:217–24.

10. Kayatas K, Karatoprak C, Cebeci F, et al. Наличие на ниски липидни нива при пациенти с болест на Бехтерев като протектор срещу атеросклероза. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2013;17:2330–4.

11. Buldanlioglu S, Turkmen S, Ayabakan HB, et al. Азотен оксид, липидна пероксидация и антиоксидантна защитна система при пациенти с активна или неактивна болест на Бехчет. Br J Dermatol 2005; 153: 526-30.

12. Cho SB, Zheng Z, Ahn KJ и др. Серумна IgA реактивност срещу GroEL на Streptococcus sanguinis и човешки хетерогенен ядрен рибонуклеопротеин А2/В1 при пациенти с болест на Бехчет. Br J Dermatol 2013; 168: 977–83.

13. Zheng Z, Sohn S, Ahn KJ и др. Серумна реактивност срещу UL48 протеин тип 1 на вируса на херпес симплекс при пациенти с болест на Бехчет и миши модел, подобен на болестта на Бехчет. Acta Derm Venereol 2015; 95: 952–8.

14. Lule S, Colpak AI, Balci-Peynircioglu B, et al. Серумът на болестта на Бехчет е имунореактивен към неврофиламентна среда, която споделя общи епитопи на бактериалния HSP-65, предполагаем тригер. J Autoimmun 2017; 84: 87–96.

15. Tong B, Liu X, Xiao J, et al. Имунопатогенеза на болестта на Бехтерев. Front Immunol 2019; 10: 665.

16. Greco A, De Virgilio A, Ralli M, et al. Болест на Бехчет: нови прозрения за патофизиологията, клинични характеристики и възможности за лечение. Autoimmun Rev 2018; 17: 567–75.

17. Марта М, Сантос Е, Коутиньо Е и др. Ролята на инфекциите при болестта на Бехчет и невро-синдрома на Бехчет. Autoimmun Rev 2015; 14: 609–15.

18. Hatemi G, Bahar H, Uysal S, et al. Пустулозните кожни лезии при синдрома на Бехчет не са стерилни. Ann Rheum Dis 2004; 63: 1450–2.

19. Galeone M, Colucci R, D'Erme AM, et al. Възможна инфекциозна етиология на болестта на Бехчет. Pathologi Res Int 2012; 2012: 595380.

20. Karaca M, Hatemi G, Sut N, et al. Клъстерът папуло-пустулозна лезия/артрит при синдрома на Бехчет също се групира в семейства. Ревматология (Оксфорд) 2012; 51: 1053–60.

21. Tascilar K, Melikoglu M, Ugurlu S, et al. Съдово засягане при синдрома на Бехчет: ретроспективен анализ на асоциациите и времевия курс. Ревматология (Оксфорд) 2014; 53: 2018–22.

22. Zou J, Luo JF, Shen Y, et al. Клъстерен анализ на фенотипове на пациенти със синдром на Бехчет: голямо кохортно проучване от референтен център в Китай. Артрит Res Ther 2021; 23:45.

23. Soejima Y, Kirino Y, Takeno M, et al. Промените в дела на клиничните клъстери допринасят за фенотипната еволюция на болестта на Бехчет в Япония. Артрит Res Ther 2021; 23:49.

24. Leiba M, Seligsohn U, Sidi Y, et al. Тромбофилните фактори не са водещата причина за тромбоза при болестта на Бехчет. Ann Rheum Dis 2004; 63: 1445–9.

25. Becatti M, Emmi G, Silvestri E, et al. Активирането на неутрофилите насърчава окислението на фибриногена и образуването на тромби при болестта на Бехчет. Тираж 2016; 133: 302–11.

26. Zheng W, Wu X, Goudarzi M, et al. Метаболомни промени, свързани с болестта на Бехчет. Артрит Res Ther 2018; 20: 214.

27. Xu J, Su G, Huang X и др. Метаболомният анализ на вътреочния хумор идентифицира анормален метаболизъм на аминокиселини и мастни киселини при болестта на VogtKoyanagi-Harada и Behcet. Front Immunol 2021; 12: 587393.

28. Bakir-Gungor B, Remmers EF, Meguro A, et al. Идентифициране на възможни патогенни пътища при болестта на Бехчет, като се използват данни от проучване за асоцииране в целия геном от две различни популации. Eur J Hum Genet 2015; 23: 678–87.

29. Tong D, Lönnblom E, Yau AC, et al. Споделен епитоп на колаген тип XI и тип II се разпознава от патогенни антитела при мишки и хора с артрит. Front Immunol 2018; 9: 451.

30. Durlik-Popinska K, _ Zarnowiec P, Lechowicz Ł, et al. Антитела, изолирани от пациенти с ревматоиден артрит срещу лизин-съдържащ липополизахарид Proteus mirabilis O3 (S1959), могат да реагират с колаген тип I. Int J Mol Sci 2020;21:9635.

31. Jung JH, Han KD, Lee YB et al. Болестта на Бехчет се свързва с множествена склероза и ревматоиден артрит: корейско популационно проучване. Дерматология 2021: 1–6.

32. Düzgün N, Ates¸ A, Aydintug OT, et al. Характеристики на съдовото засягане при болестта на Бехчет. Scand J Rheumatol 2006; 35: 65–8.

33. Tascilar K, Melikoglu M, Ugurlu S, et al. Съдово засягане при синдрома на Бехчет: ретроспективен анализ на асоциациите и времевия курс. Ревматология (Оксфорд) 2014; 53: 2018–22.

34. Le Joncour A, Martos R, Loyau S, et al. Критичната роля на неутрофилните екстрацелуларни капани (NET) при пациенти с болест на Behcet. Ann Rheum Dis 2019; 78: 1274–82.

35. Al-Basheer M, Hadadin F. Тип образуване на аневризма при васкуларна болест на Behcet. Heart Lung Circ 2007; 16: 407–9.

36. Chambers JC, Haskard DO, Kooner JS. Съдова ендотелна функция и механизми на оксидативен стрес при пациенти със синдром на Бехчет. J Am Coll Cardiol 2001; 37: 517–20.

37. Demirtürk OS, Tünel HS, Alemdaroglu U. Съдови прояви на болестта на Бехчет. В: Gonul M, Kartal S, редактори. Болест на Бехтерев. Лондон: IntechOpen; 2017 г.

38. Aksu K, Donmez A, Keser G. Индуцирана от възпаление тромбоза: механизми, болестни асоциации и управление. Curr Pharm Des 2012; 18: 1478–93.

39. Choi-Miura NH, Tobe T, Sumiya J, et al. Пречистване и характеризиране на нов хиалуронан-свързващ протеин (PHBP) от човешка плазма: той има три EGF, крингъл и серин протеазен домен, подобен на активатор на хепатоцитен растежен фактор. J Biochem 1996; 119: 1157–65.

40. Kanse SM, Parahuleva M, Muhl L, et al. Фактор VII-активираща протеаза (FSAP): съдови функции и роля при атеросклерозата. Thromb Haemost 2008; 99: 286–9.

41. Byskov K, Boettger T, Ruehle PF, et al. Фактор VII активираща протеаза (FSAP) регулира експресията на възпалителни гени в съдовата гладка мускулатура и ендотелните клетки. Атеросклероза 2017; 265: 133–9.

42. Парахулева MS, Maj R, Hölschermann H, et al. Регулиране на функцията на моноцити/макрофаги чрез активираща фактор VII протеаза (FSAP). Атеросклероза 2013; 230: 365–72.

43. Kannemeier C, Al-Fakhri N, Preissner KT et al. Фактор VII-активираща протеаза (FSAP) инхибира медиираната от растежен фактор клетъчна пролиферация и миграцията на съдови гладкомускулни клетки. FASEB J 2004; 18: 728–30.

44. Mambetsariev N, Mirzapoiazova T, Mambetsariev B, et al. Свързващият протеин 2 на хиалуроновата киселина е нов регулатор на съдовата цялост. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010;30:483–90.

45. Midwood KS, Hussenet T, Langlois B, et al. Напредък в биологията на тенасцин-C. Cell Mol Life Sci 2011; 68: 3175–99.

46. ​​Gao W, Li J, Ni H, et al. Tenascin C: потенциален биомаркер за прогнозиране на тежестта на коронарната атеросклероза. J Atheroscler Thromb 2019; 26: 31–8.

47. Sanchez-Navarro A, Gonzalez-Soria I, Caldiño-Bohn R, et al. Интегративен изглед на серпините в здравето и болестта: приносът на SerpinA3. Am J Physiol Cell Physiol 2021; 320: C106–18.

48. Сорокин V, Woo CC. Роля на Serpina3 в съдовата биология. Int J Cardiol 2020; 304: 154–5.

49. Qian LL, Ji JJ, Guo JQ и др. Защитна роля на serpina3c като нов инхибитор на тромбина срещу атеросклероза при мишки. Clin Sci (Лондон) 2021; 135: 447–63.

50. Fallacara A, Baldini E, Manfredini S, et al. Хиалуроновата киселина през третото хилядолетие. Полимери (Базел) 2018;10.