Количествено определяне на невритна дегенерация с повишена точност и ефикасност в in vitro модел на болестта на Паркинсон Част 1

Резюме

Невритната дегенерация е свързана с ранни стадии на невродегенеративни заболявания като болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон (PD) и амиотрофична латерална склероза. Един метод, който обикновено се използва за анализиране на невритна дегенерация, включва изчисляването на индекс на дегенерация (DI) след използването на инструмента Analyze Particles на ImageJ за откриване на невритни фрагменти в микрографии на култивирани клетки. Въпреки това, DI анализите са предразположени към няколко вида грешки при измерване, могат да отнемат много време за изпълнение и са ограничени в приложението.

Невродегенерацията се отнася до промени, които настъпват в или около невроните, които могат да повлияят на човешката когнитивна функция, интелигентност, емоция, поведение и т.н. Много хора смятат, че невродегенерацията е тясно свързана с влошаването на паметта, но това може да не е така.

Първо, невродегенерацията не означава непременно, че паметта намалява с възрастта. Някои хора могат да запазят добра памет и дори да могат да разберат праведността. Това е така, защото паметта на човек се влияе от комбинация от фактори като упражнения, диета и начин на живот.

Второ, човешкият мозък може да възстанови нови невронни връзки и да формира нови спомени, което се нарича пластичност. Независимо от възрастта, мозъкът непрекъснато се учи и формира нови спомени. Следователно невродегенерацията е просто естествена промяна в мозъка и не означава непременно, че паметта ще се влоши.

И накрая, поддържането на оптимистична нагласа също може да подобри паметта на човек. Безпокойството и стресът могат да имат неблагоприятни ефекти върху мозъка, което води до загуба на паметта. Позитивното отношение може да насърчи здравето на мозъка и да подобри паметта и когнитивните способности.

За да обобщим, невродегенерацията не води непременно до загуба на паметта и оптимистичното отношение към живота може да ни помогне да поддържаме добра памет и когнитивни способности. Следователно трябва да поддържаме оптимистична нагласа и да засилим управлението на упражненията, диетата и начина на живот, за да поддържаме здравето на мозъка и паметта. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си. Cistanche може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивото на ацетилхолин и растежни фактори. Тези вещества са много важни за паметта и ученето. Освен това месото може също да подобри притока на кръв и да насърчи доставката на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно храна и енергия, като по този начин подобрява жизнеността и издръжливостта на мозъка.

Щракнете върху познайте начините за подобряване на мозъчната функция

Тук описваме подобрен метод за извършване на DI анализи. Точността на измерванията беше подобрена чрез модифициране на критериите за избор за откриване на невритни фрагменти, премахване на артефакти на изображението и неневритни материали от изображенията и оптимизиране на контраста на изображението. Такива подобрения бяха внедрени в ImageJ макрос, който позволява бърз и напълно автоматизиран DI анализ на множество изображения. Макросът включва операции за автоматизирано отстраняване на клетъчни тела от микрографии, като по този начин разширява приложението на DI анализи за използване в експерименти, включващи дисоциирани култури.

Представяме експериментални открития, подкрепящи това, че в сравнение с конвенционалния метод, подобреният метод за анализ дава измервания с повишена точност и изисква значително по-малко време за изпълнение.

Освен това, ние демонстрираме полезността на метода за изследване на невритна дегенерация в модел на клетъчна култура на PD чрез провеждане на експеримент, разкриващ ефектите на c-Jun N-терминална киназа (JNK) върху невритна дегенерация, предизвикана от оксидативен стрес в човешки мезенцефални клетки. Този подобрен метод за анализ може да се използва за придобиване на нова представа за факторите, които са в основата на невритната дегенерация и прогресията на невродегенеративните разстройства.

Ключови думи:

Дегенерация на аксони; индекс на дегенерация; невритна дегенерация; невродегенерация; оксидативен стрес; Болестта на Паркинсон.

Изявление за значимост

Невритната дегенерация е клетъчно събитие, свързано с ранните етапи на множество видове невродегенеративни разстройства. Молекулярните фактори, които регулират невритната дегенерация, остават слабо разбрани и съществуващите методи за изследване на невритната дегенерация имат ограничено приложение и ефективност. Тук ние идентифицираме модификации на широко използвана процедура за анализ на невритна дегенерация, която намалява грешката при измерване.

Такива методологични подобрения бяха включени в макрос ImageJ, като по този начин се улесни бързият и напълно автоматизиран анализ на невритна дегенерация, използвайки големи набори от микрографии. Използвайки модел на клетъчна култура на болестта на Паркинсон (PD), ние демонстрираме, че макрото улеснява по-точни и ефективни измервания на невритна дегенерация, като същевременно разширява пригодността на метода за анализ за експерименти, включващи дисоциирани култури.

Въведение

Невритната дегенерация е клетъчен процес, при който аксоните или дендритите претърпяват прогресивна дисфункция и морфологични промени, водещи до загуба на целостта на невритите. Невритната дегенерация е еволюционно запазен процес, който е от решаващо значение за правилното установяване на невронни мрежи по време на развитието на централната нервна система (Neukomm и Freeman, 2014).

Въпреки това, процесът се задейства и в отговор на различни форми на нараняване като механично увреждане или излагане на лекарства, използвани за химиотерапия (Salvadores et al., 2017). Освен това, невритната дегенерация е свързана с прогресията на различни свързани с възрастта невродегенеративни разстройства, включително болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон (PD), болест на Хънтингтън и амиотрофична латерална склероза.

Интересното е, че за всички такива невродегенеративни разстройства натрупващите се доказателства сочат, че невритната дегенерация е ключово събитие в ранен стадий, което предшества смъртта на невроните или появата на клинични симптоми (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert and Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et al., 2020). По този начин проучвания, изследващи фактори, които регулират този клетъчен процес, могат да разкрият нови цели за лечение на различни невродегенеративни състояния.

Изследването на невритна дегенерация е особено важно за разбирането на PD, заболяване, характеризиращо се с натрупване на протеинови агрегати, съдържащи a-синуклеин, прогресивна загуба на допаминергични неврони в substantia nigra pars compacta (SNpc) и развитието на различни двигателни и когнитивни симптоми (Aarsland et al., 2017).

Доказателства от постмортални и човешки образни изследвания показват, че а-синуклеиновите агрегати са по-изобилни в невронните влакна, отколкото в клетъчните тела, и разграждането на допаминергичните аксони се случва в по-голяма степен, отколкото загубата на допаминергични неврони в SNpc по време на периода, водещ до клинично начало (Tagliaferro и Burke, 2016).

Докато молекулярните взаимодействия, които допринасят за прогресивното влошаване на допаминергичните неврити, остават неразбрани, последните доказателства показват, че дегенерацията на невритите може да бъде медиирана от събития, независими от сигналните каскади, лежащи в основата на невронната смърт (Fukui, 2016; Geden и Deshmukh, 2016). По този начин проучванията, които директно оценяват физиологичните основи на невритната дегенерация, са от решаващо значение за разработването на терапии, които възпрепятстват ранната прогресия на PD.

В отговор на доказателствата за централната роля на невритната дегенерация в прогресията на невродегенеративните разстройства, бяха разработени различни методи за измерване на невритната дегенерация с помощта на микрографии на култивирани неврони. Например, установени са множество различни методи за измерване на дегенерация на неврит с помощта на софтуер за откриване на намален брой или дължина на неврит (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Въпреки това, тъй като такива методи не оценяват директно невритната фрагментация, интерпретацията на резултатите за определяне на влиянието на променливата върху невритната дегенерация може да бъде объркана от потенциалните ефекти на променливата върху невритния растеж. Някои изследователски групи също са измервали невритната дегенерация чрез субективно точкуване на изображения на невритите въз основа на морфологичните характеристики и степента на видима фрагментация (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Този алтернативен метод обаче отнема много време и може да доведе до грешка на изследователя.

Един метод, който улеснява обективното и директно измерване на невритната фрагментация, включва използването на алгоритъма за анализиране на частици на ImageJ за измерване на площта на невритните фрагменти в микрографии на култивирани клетки. Измерванията се използват за изчисляване на индекс на дегенерация (DI), скала между {{0}}.0 и 1,0, отразяваща степента на невритна дегенерация (Sasaki et al., 2009).

Докато DI анализите могат да се използват за откриване на различна степен на фрагментация на неврит, точността на измерванията обикновено е ограничена от няколко източника на грешки и приложението на метода е ограничено предимно до експлантни култури или клетки, отгледани в отделени микрофлуидни устройства. Освен това, DI анализите отнемат време, когато се екстраполират към големи набори от изображения. По този начин се опитахме да преодолеем тези ограничения чрез модифициране на процедурата за DI анализ, за ​​да улесним по-голяма точност и ефективност, като същевременно разширим приложимостта.

В настоящото проучване ние идентифицираме няколко източника на грешка, обикновено свързани с DI анализи и докладваме методологични ревизии, които намаляват различните форми на грешка. Ние включваме процедурните подобрения в макрос на ImageJ, наречен Автоматизиран индекс на невритна дегенерация (ANDI), за да автоматизираме напълно DI анализите от големи комплекти изображения. Работата на ANDI Macro изисква само софтуер и файлове с отворен код и свободно достъпни. Измерванията, получени с помощта на ANDI, се възползват от повишена точност, като същевременно значително намаляват времето, необходимо за извършване на анализите.

Освен това, ние демонстрираме как новият метод за анализ може да бъде приложен за извършване на точно и бързо измерване на невритна дегенерация в модел на клетъчна култура на PD, включващ дисоциирани клетки, отгледани без компартментализация. Взети заедно, тези методологични подобрения могат да доведат до нов поглед върху факторите, лежащи в основата на важен клетъчен процес, свързан с невродегенерацията.

Материали и методи

Клетъчна култура

Култури от човешки мезенцефални клетки на Lund (LUHMES) бяха установени в слайдове с камера с осем ямки Lab Tek II, покрити с поли-L-орнитин (PLO) и фибронектин, поли-D-лизин (PDL) и ламинин, и четирите субстрата, или не субстрати, както е посочено. За да се покрият с PLO и фибронектин, слайдовете се инкубират една нощ при стайна температура с разтвор, съдържащ 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, каталог #P3655).

След промивания със стерилна вода (Avantor), предметните стъкла се инкубират с 2 mg/ml фибронектин (Sigma-Aldrich, каталожен #F0895) в продължение на 3 часа при 37 градуса. След това слайдовете се промиват със стерилен PBS (Corning Life Sciences, каталог #21-040-CV) и се оставят да изсъхнат на въздух. За да се покрият с PDL и ламинин, слайдовете се инкубират при стайна температура с разтвор, съдържащ 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, каталог #P7280) и 10 mg/ml ламинин (Corning, каталог #354232).

След инкубиране за една нощ, слайдовете се промиват със стерилен PBS и се оставят да изсъхнат на въздух. За да се покрият и четирите субстрата, гореспоменатите процедури бяха извършени последователно. LUHMES клетки (ATCC, RRID: CVCL_B056) се поставят в покритите камерни предметни стъкла при посочените плътности в среда за диференциация, състояща се от DMEM/F12 (Invitrogen, каталожен #11330057), допълнена с 2 mM глутамин (VWR), 1% (v/v) N-2 добавка, 1 mg/ml тетрациклин (Sigma-Aldrich, каталожен #87128-25G), 1 mM N6,29-одибутириладенозин cAMP (db-cAMP ; Enzo Life Sciences, каталог #BML-CN125-0100) и 2 ng/ml невротрофичен фактор, получен от глиална клетъчна линия (GDNF; R&D Systems, каталог #212-GD-010).

Освен когато е посочено друго, всички култури се посяват при плътност от 115 000 клетки на ямка. Подмяна на 50% обемна среда се извършва на всеки 48 часа до лечението. За да се предотврати генетичен дрейф, клетъчни запаси, които са били пасирани шест или по-малко пъти, са използвани за всички експерименти.

Експериментите, включващи първични култури от симпатични неврони, бяха одобрени от Комитета за грижа и използване на животните в Университета на Източен Кентъки или Университета на Вирджиния. Горните цервикални ганглии бяха дисектирани от постнатални ден 0–6 C56Bl/6 мишки, инкубирани при 37 градуса в буфер за ензимна дисоциация и промити с растежна среда за отстраняване на протеолитичните ензими и стрити.

Клетъчните суспензии се посяват при плътност от 7000 клетки на ямка в слайдове с камера с осем ямки Lab Tek II. Средите бяха сменени на ден in vitro (DIV) 1, последвано от подмяна на средата през ден. Средата беше допълнена с цитозин арабинофуранозид (Ara-C, Millipore-Sigma) на DIV1–DIV3, за да се предотврати растежа на не-невронални клетки, последвано от отстраняване на Ara-C от средата за най-малко 24 часа преди лечението, както е посочено. За експерименти, проведени в Университета на Източен Кентъки, включващи третиране с водороден пероксид, предметните стъкла на камерата бяха покрити с 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, каталог #P3655), 2 mg/ml фибронектин, 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, каталог #P7280) и 10 mg/ml ламинин (Corning, каталожен #354232) преди употреба и дисоциацията се извършва чрез 30-минутна инкубация в буфер, състоящ се от DMEM (ThermoFisher, каталожен #11960- 044), съдържащ 0,025% трипсин (Corning Life Sciences, каталог #25-053-CI) и 0,3% колагеназа (Worthington Biochemical, каталог #LS004176).

Растежната среда за такива експерименти се състои от DMEM, допълнен с 10% фетален говежди серум (Invitrogen, каталожен #26140-079), 2 mM L-глутамин (Corning, каталожен #25-005-CI) и 40 ng/ml нервен растежен фактор (Fisher Scientific, каталог #13-257-019); 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) се използва за отстраняване на неневронни клетки.

За експерименти, проведени в Университета на Вирджиния, включващи отнемане на NGF, клетките бяха поставени върху предметни стъкла, покрити със 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) и 10 mg/ml ламинин (Invitrogen), и дисоциацията беше извършена през 20-min инкубиране в буфер, състоящ се от DMEM/F12, съдържащ BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), колагеназа тип 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), дезоксирибонуклеаза 1 (Millipore Sigma) и хиалуронидаза (Sigma-Aldrich). Растежната среда за такива експерименти се състои от DMEM, допълнен с 10% фетален волски серум (Invitrogen), 1 U/ml пеницилин/стрептомицин (Invitrogen) и 45 ng/ml NGF (пречистен от слюнчените жлези); 10 mM Ara-C се използва за отстраняване на не-невронни клетки.

Клетъчни лечения

Диференцираните LUHMES клетки бяха изложени на посочените концентрации на {{0}}хидроксидопамин (6-OHDA; Sigma-Aldrich, каталожен #162957) или разтвор на носител на техния пети ден в средата за диференциация. Запаси от 6- OHDA бяха приготвени в охладен PBS, съдържащ 0.02% аскорбат (Sigma-Aldrich, каталожен #A5960), и аликвотни части бяха съхранени в защитени от светлина флакони под инертен газ при 80 градуса. След 24 часа третиране, клетките се фиксират чрез инкубиране в PBS, съдържащ 4% параформалдехид (PFA) в продължение на 25 минути при стайна температура.

За да се определи ролята на c-Jun N-терминална киназа (JNK) при невритна дегенерация, предизвикана от оксидативен стрес, културите се третират предварително в продължение на 1 час с 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, каталожен #S5567) или разтвор на носител преди пълната подмяна на средата със среда, съдържаща 7,5 mM 6-OHDA, 7,5 mM 6-OHDA и 10 mM SP600125, или разтвори за носители. Запаси от SP600125 бяха приготвени чрез разтваряне на инхибитора в стерилен диметилсулфоксид (DMSO) и замразени аликвоти бяха съхранени в защитени от светлина флакони, пълни с инертен газ при 20 градуса. Обработките се извършват така, че клетките се излагат на не повече от 0.1% DMSO.

Първичните култури от симпатикови неврони бяха третирани на DIV5. За експерименти, включващи невритна дегенерация, предизвикана от водороден пероксид, културите бяха изложени на 500 mM водороден пероксид (Sigma-Aldrich, каталог #H1009-100ML) или разтвор на носител, състоящ се от стерилна вода (Cytiva, каталог #SH30529.02) за 24 ч.

За експерименти, включващи отнемане на NGF, SCG културите или са получили подмяна на среда с растежна среда, или са били подложени на лишаване от NGF. SCG културите, които трябва да бъдат лишени от NGF, се изплакват три пъти с растежна среда без NGF и след това се инкубират в свободна от NGF среда за растеж в продължение на 80 часа без промени в средата. След третиране, клетките се фиксират чрез инкубиране в 4% PFA в PBS за 30 минути, последвано от отстраняване на PFA чрез изплакване с PBS.

Оцветяване и флуоресцентна микроскопия

За експерименти с LUHMES клетки, както и експерименти, включващи симпатикови неврони, третирани с водороден пероксид, предметни стъкла с осем ямкови камери, съдържащи фиксирани клетки, бяха пермеабилизирани с 0.1% Triton X-100 в PBS и блокирани за 1 час с 10% нормален кози серум в PBS, съдържащ 0,1% Triton X-100. След това слайдовете се инкубират с първично антитяло, специфично за b I тубулин (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) в блокиращ разтвор при 4 градуса за една нощ. Впоследствие предметните стъкла се промиват с PBS, инкубират се с вторично антитяло, свързано с Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB _142495) за 90 минути при стайна температура и се подлагат на допълнителни промивания.

За експерименти, включващи оцветяване с тирозин хидроксилаза (TH), предметните стъкла бяха подложени на допълнителна инкубация в PBS, съдържащ 10% нормален кози серум, 0,1% Triton X-100, антитяло, специфично за TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) при 4 градуса през нощта. След това предметните стъкла се промиват с PBS, инкубират се с вторично антитяло, свързано с Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889), и се подлагат на допълнителни промивания с PBS.

След завършване на имуномаркирането за b III-тубулин или ТН, предметните стъкла се инкубират с 5 mg/ml 49,69-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; каталожен #D9542) в PBS за 5 минути. След това слайдовете се промиват с PBS и покривните стъкла се монтират с помощта на среда за монтиране Fluoromount G (Southern Biotech, каталог #0100-01).

За експерименти, включващи симпатикови неврони, подложени на отнемане на NGF, предметните стъкла бяха блокирани за 1 час чрез инкубиране при стайна температура в буфер, състоящ се от 5% нормален кози серум (Life Technologies) и 0.0005% Triton X-100 в PBS, последвано от инкубиране в първичен разтвор на антитяло, съдържащ миши анти-миши Tuj1 (1:1000, Covance) за една нощ при 4 градуса. Впоследствие предметните стъкла се промиват с PBS, инкубират се в продължение на 1 час в кози анти-миши IgG Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) и 0,1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) в блокиращ буфер, подлагат се на допълнителни изплаквания с PBS и се оставят да изсъхне. Слайдовете бяха монтирани с Fluoromount-G (Southern Biotech, каталог #0100-01) и съхранени при стайна температура.

Предметни стъкла, съдържащи клетки LUHMES, бяха визуализирани с обектив 20 на Nikon Eclipse II Ti-U инвертирана микроскопска система с Lumencor Mira 4-канал LED източник на светлина. 1280 1024-пикселните изображения са заснети с помощта на Nikon DSQi1Mc 5 MP CCD камера и NIS Elements 3.22.15 (версия 738). С изключение на случаите, когато е посочено друго, всички изображения с фазов контраст бяха заснети с помощта на настройки за интензитет на светлината и време на експозиция, които дадоха среден фонов интензитет от 165 в 8-битови изображения.

За да се намали засенчването на фона или други несъответствия, преди всяка сесия на микроскопия се заснема изображение на празна ямка и се използва за корекция на фона по време на клетъчно изобразяване с LUHMES. Слайдове, съдържащи симпатични неврони, култивирани в Университета на Източен Кентъки или Университета на Вирджиния, бяха изобразени с помощта на Zeiss LSM 800 микроскопска система или Zeiss LSM 980 микроскопска система, съответно. Изображенията бяха заснети при 20 увеличение и 1024 1024 разделителна способност с помощта на Zen софтуер (Carl Zeiss Microscopy).

Анализ на жизнеспособността на клетките

Диференцирани клетъчни култури LUHMES бяха установени върху предметни стъкла с камера с осем ямки Lab Tek II, които бяха покрити, както е посочено, с различни субстрати. Промяна на 50% среда се извършва на всеки 48 часа и клетките се фиксират с 4% PFA в PBS на шестия ден от диференциацията. Слайдове, съдържащи фиксирани клетки, бяха подложени на оцветяване с DAPI и изображения на ядрено оцветяване бяха заснети с Nikon Eclipse II Ti-U система с обърнат микроскоп и Nikon DS-Fi1 5 MP CCD камера.

Клетките бяха оценени като здрави или нездравословни от заслепен изследовател въз основа на външния вид на ядрата. Клетки с намалена ядрена площ или ядрена фрагментация се оценяват като нездравословни. Броят на здравите клетки на изображение се оценява за най-малко пет зрителни полета за условие във всеки експеримент.

DI измервания

Традиционните DI измервания бяха извършени с помощта на пакет Fiji Is Just ImageJ (FIJI), съдържащ ImageJ 1.52p чрез метод, включващ широко цитирани параметри за DI анализ (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Лорето и др., 2020; Шин и Чо, 2020). Осембитови изображения на диференцирани LUHMES клетки с добре разделени аксонови трактове бяха подложени на бинаризация, използвайки алгоритъма за бинаризация по подразбиране, с бинарни опции, конфигурирани да произвеждат изображение с черни клетки на преден план и бял фон.

Инструментът за рисуване със свободна ръка беше използван за ръчно проследяване на всички области на изображението, включващи клетъчни тела, и всички черни пиксели бяха преобразувани в бели в проследените региони. Инструментът за измерване на ImageJ беше приложен за измерване на общата черна зона на бинаризираните изображения, включващи изключително неврити. След това беше приложен инструментът за анализиране на частици, като се използва настройка за размер от 20–10,000 пиксела и настройка за кръглост от 0,2–1,0 за откриване на невритни фрагменти. Сумираната площ на всички невритни фрагменти след това беше разделена на общата черна зона, за да се изчисли DI на изображението.

За експерименти, свързани с оптимизиране на параметрите на размера за идентифициране на невритни фрагменти, бяха използвани критерии за кръговрат от {{0}}.2–1.00 за всички измервания на частици. Приставката Particle Remover (версия 20{{10}}4/02/09), разработена от Wayne Rasband, е получена от https://imagej.nih.gov/. Където е посочено, прилагането на приставката за премахване на частици, използвайки параметри за размер от 0–9 пиксела и параметри за кръглост от 0,0–1,0, беше извършено за премахване на малки, неневритни обекти от бинаризирани изображения, получени от фазово-контрастни микрографии.

По подобен начин параметрите на размера от {{0}}–4 пиксела и параметрите на кръговрата от 0–1.0 бяха използвани за отстраняване на малки обекти от бинаризирани изображения, получени от флуоресцентни микрографии, представляващи имунооцветяване с b III-тубулин. Освен ако не е посочено друго, преди DI анализ всички изображения с фазов контраст бяха подложени на подобряване на контраста чрез използване на ImageJ за прилагане на справочна таблица (LUT) с минимум 90 и максимум 205.

Измерване на изкуствена фрагментация

Култури, съдържащи здрави LUHMES клетки, бяха фиксирани с 4% PFA на техния шести ден на диференциация и имуномаркирани за b III-тубулин. Използвайки 20 обектива, 1280 1024-пикселни фазово-контрастни микроснимки и флуоресцентни микроснимки, всяка изобразяваща идентични зрителни полета, бяха заснети от региони с произволна извадка. Бяха заснети общо десет комплекта изображения от девет отделни култури.

ImageJ беше използван за генериране на бинаризирани копия на оригиналните фазово-контрастни и флуоресцентни микроснимки, както и копия на фазово-контрастни микроснимки, които бяха бинаризирани след усилване на контраста чрез прилагане на LUT с минимум 90 и максимум 205. За всеки комплект на изображения, заслепен изследовател идентифицира малка 150 150-пикселова област от оригиналната фазово-контрастна микрофотография, включваща изключително здрави и непокътнати неврити.

След това размерът и координатите на региона бяха съхранени в мениджъра на региона на интерес (ROI) на ImageJ и използвани за извършване на DI измервания в аналогични региони на бинаризирани изображения от същия набор от изображения. DI измерванията бяха извършени с помощта на традиционния метод, включващ параметри за размера на фрагмента от 20 -10, 000 пиксела. Тъй като всички измерени региони съдържат изключително непокътнати неврони, всички открити фрагменти се считат за изкуствени фрагменти.

АНДИ Макро

Макросът ANDI е написан с помощта на езика за макроси ImageJ. Макросът включва поредица от операции, които позволяват на потребителя да избира пътища за три директории, една директория, съдържаща изображения на неврони, имуномаркирани за невронален маркер като b III-тубулин, втора директория, съдържаща съответните изображения, изобразяващи ядрено оцветяване, и трета директория предназначен за запазване на файлове с резултати. Площите на фрагментите и общите невритни площи на изображенията в избраните директории след това се изчисляват чрез поредица от ImageJ операции. Накратко, изображение, изобразяващо ядрено етикетиране, се отваря, подлага се на усилване на контраста и се бинаризира. Плъгинът за премахване на частици се използва за премахване на малки, неядрени артефакти от бинаризираното изображение, а бинаризираното изображение е подложено на поредица от разширения и ерозии.

Съответно изображение на клетки, имуномаркирани за b III-тубулин (или друг невронален маркер) се отваря и се подлага на усилване на контраста. След това бинаризираното изображение, изобразяващо уголемени клетъчни ядра, се изважда от изображението, включващо клетки, имуномаркирани за b III-тубулин, като по този начин се генерира изображение, включващо изключително неврити. След това невритното изображение се бинаризира и се подлага на премахване на частици между 0 и 4 пиксела. Площта на невритния фрагмент се изчислява чрез прилагане на алгоритъма за анализиране на частици за измерване на частици с кръглост между 0.2 и 1.0 и размер между 5 и 10,0000 пиксела. Общата невритна площ се изчислява чрез прилагане на инструмента за измерване за изчисляване на общата черна зона. Изображение, изобразяващо бинаризираната невритна област с подчертани фрагменти, се записва в директория, посочена от потребителя, заедно с .csv файлове, отчитащи фрагментираната невритна област и измерванията на общата невритна област.

В допълнение към гореспоменатите операции в макроса са включени няколко допълнителни операции, за да се поддържа лесна употреба и да се ограничат грешките на потребителя. Те включват функции, които премахват информацията за мащаба от изображенията и гарантират, че измерванията се получават в пикселни единици; конфигурирайте цветовите настройки на ImageJ и бинарните опции за подходящо изваждане и бинаризация на изображението; проверете дали избраните директории за изображения на оцветяване с b III-тубулин и оцветяване с DAPI съдържат равен брой изображения; затворете използваните преди това изображения, за да увеличите времето за обработка; ясни резултати от предишни анализи преди извършване на нови анализи; и предотвратяване на грешки, свързани със създаването на .ini файл от Windows 10.

За експерименти, включващи анализи на симпатикови неврони, макросът ANDI беше преработен, за да включва операция, която представя диалогов прозорец, позволяващ на потребителя да контролира колко пъти бинаризираните изображения на ядрата ще бъдат разширени. Версията на ANDI, включваща тази ревизия, беше наречена ANDI v1.1. Промяната на стойността в диалоговия прозорец на по-голямо число увеличава размера на премахване на сома, докато промяната на стойността на по-ниско число намалява размера на премахване на сома. Стойността по подразбиране е 12, което е броят на разширенията, използвани за всички експерименти, включващи LUHMES клетки. Стойност 16 беше използвана за отстраняване на по-големи участъци от клетъчно тяло по време на анализи на симпатикови неврони.

ANDI Macro е с отворен код и е свободно достъпен за използване или модифициране чрез следния URL адрес: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Точната работа на ANDI е проверена с помощта на множество персонални компютри с операционна система Windows 10. Набор от изображения, включващ клетъчни култури LUHMES, показващи различни степени на невритна дегенерация, също е достъпен на гореспоменатия уеб адрес и може да се използва за изследване на точното изпълнение на макроса от други видове компютри. Уеб адресът също така осигурява достъп до протокол, описващ как да използвате макроса.

Времеви оценки

За да се оцени времето, необходимо за ръчно извършване на DI измервания, фазово-контрастни микрографии, изобразяващи LUHMES клетки, които са третирани с разтвор на носител, 2,5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA или 7,5 mM 6-OHDA бяха подложени на DI точкуване, използвайки предварително установени методи (Kraemer et al., 2014). Всяко изображение беше подложено на подобряване на контраста и бинаризация. След това инструментът за свободна ръка на ImageJ беше използван за цифрово премахване на всички изобразени клетъчни тела от бинаризираните изображения. Инструментът Analyze Particle беше използван за измерване на фрагменти с кръглост между 0.2 и 1.0 и размер между 20 и 10,000 пиксела, а инструментът Measure беше използван за определяне на общата невритна площ.

Стойностите за фрагментирана невритна площ и обща невритна площ бяха прехвърлени в електронна таблица в Microsoft Excel и математическа операция в Excel беше използвана за изчисляване на DI резултатите. След отваряне на изображение с ImageJ беше измерено времето, необходимо за ръчно изпълнение на всяка от тези процедури. Средните времена за анализ бяха изчислени от общо 36 изображения. Изображенията са получени от девет независими препарата от клетъчна култура и анализите са извършени с помощта на едно изображение за условие на третиране от всеки препарат от клетъчна култура. За да се определи скоростта на DI измерванията, извършени с помощта на макроса ANDI, същите набори от изображения бяха използвани за определяне на времето, необходимо за отваряне на макроса в ImageJ, изпълнение на макро операциите, прехвърляне на данните в електронна таблица на Excel и изчисляване на DI.

Статистика

Количествените сравнения са представени като графики с кутии и мустаци, където средната линия представлява медианата, кутиите се простират до 25-ия и 75-ия персентил, а мустаците изобразяват 5-ия и 95-ия персентил. Средните стойности бяха статистически сравнени в GraphPad Prism 9.1.2 чрез повторени измервания ANOVA с post hoc сравнения, използвайки корекция на Sidák. Нормалността на количествените данни беше тествана с помощта на теста Shapiro-Wilk в IBM SPSS 26.

Когато предположението за нормалност беше нарушено (фигури 1C, 3D), груповите сравнения бяха проведени чрез непараметричния тест на Friedman с теста на Dunn, извършен за post hoc сравнения. Корелационните анализи са изобразени като диаграми на разсейване и включват линии с най-добро съответствие. Такива връзки бяха анализирани с помощта на корелации продукт-момент на Pearson или r на Spearman, когато предположението за нормалност беше нарушено. Нормалността на остатъците за корелационен анализ беше оценена чрез визуална проверка на съответните QQ графики.

Корелационните коефициенти на продукт-момент на Pearson бяха сравнени един с друг с помощта на асимптотичния z-тест на Steiger (Steiger, 1980; Lee and Preacher, 2013). Не са изключени извънредни стойности. Статистическата значимост беше приета при р, 0,05. P-стойностите се закръглят до четири знака след десетичната запетая и се съобщават в основния текст. Размерите на ефекта и 95% доверителни интервали също се отчитат за параметрични анализи, като размерите на ефекта са описани в основния текст, а доверителните интервали са изброени в таблица 1.

Наличност на данни

Допълнителни данни за настоящата статия ще бъдат споделени при разумно искане.

Достъпност на кода

Кодът/софтуерът, описан в статията, е свободно достъпен онлайн на https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Кодът е достъпен като разширени данни 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com