Кверцетинът отслабва мозъчните окислителни промени, предизвикани от наночастици железен оксид при плъхове

Контакт:tina.xiang@wecistanche.comза повече подробности

Резюме: Терапията с наночастици железен оксид (IONP) има различни ползи за здравето, но високи дози или продължителна терапия може да предизвика окислителни клетъчни увреждания, особено в мозъка. Затова проведохме настоящото проучване, за да проучим защитната роля накверцетиндобавка срещу окислителните промени, предизвикани в мозъците на плъхове поради IONPs. Четиридесет възрастни мъжки плъхове албиноси бяха разпределени в равни пет групи; контролата получи нормална основна диета, групата на IONP беше интраперитонеално инжектирана с IONPs от 50 mg/kg телесно тегло (BW), а групите, лекувани с кверцетин, имаха IONPs плюс Q25, IONPs плюс Q50 и IONPs плюс Q100, които бяха перорално заменени с кверцетин с дози от 25, 50 и 100 mg кверцетин/kg телесно тегло дневно, съответно, прилагани със същата доза IONPs за 30 дни. IONP индуцират значително повишаване на малондиалдехида (MDA) и значително намаляват редуцирания глутатион (GSH) и окисления глутатион (GSSG). Следователно, IONP значително индуцират тежки увреждания на мозъчната тъкан поради отлагането на желязо, което води до окислителни промени със значително повишаване на мозъчната креатин фосфокиназа (CPK) и ацетилхолинестераза (AChE). Освен това, IONP индуцират значително намаляване на мозъчния епинефрин, серотонин и мелатонин с понижаване на регулирането на пероксизомен пролифератор-активиран рецептор-гама коактиватор 1-алфа (PGC-1a) и митохондриален транскрипционен фактор A (mtTFA)mRNA изрази. IONP индуцира апоптоза в мозъка, наблюдавана чрез повишаване на каспаза 3 и намаляване на нивата на експресия на В-клетъчен лимфом 2 (Bcl2). Добавянето на кверцетин значително поразява мозъкаоксидативни уврежданияпо дозозависим начин. Следователно добавянето на кверцетин по време на IONPs е силно препоръчително, за да се извлекат ползите от IONPs с по-малко опасности за здравето.

Ключови думи: наночастици железен оксид; оксидативен стрес; кверцетин; антиоксидант

1. Въведение

Наночастиците от железен оксид (IONP) се използват за насочване на лекарства, доставяне на гени, маркиране на клетки, контрастно средство при магнитно резонансно изображение и хипертермична терапия[1]. Използва се и като хранителна добавка в обогатени с желязо напитки и зърнени храни за човешка консумация [2] освен многобройни промишлени употреби при пречистване на отпадъчни води, газови сензори и полупроводникови сорбенти, смазки, пигменти и покрития [3]. Въпреки това, разнообразната употреба на IONPs предизвиква претоварване с желязо и последващо иницииране на оксидативен стрес в различни органи [4]. Поглъщането, вдишването и проникването през кожата са основните пътища за навлизане на IONP[5]. В кръвния поток IONPs се свързват с плазмените протеини и се разпределят в различни тела

органи, включително черен дроб, далак, бъбрек, бял дроб и сърце, и проникват през кръвно-мозъчната бариера (BBB), предизвиквайки оксидативни увреждания [6,7]. Желязото, освободено от IONPs, причиняващо генериране на реактивни кислородни видове (ROS), води до сериозни окислителни промени в липидите, протеините и ДНК [8,9].

кверцетин(3,3',4',5,7-пентахидроксифлавон) ефлавоноидприсъства в плодове (ябълки, горски плодове, череши и червено грозде) и зеленчуци (лук и броколи) в допълнение към много семена, елда, ядки, цветя, кори, зелен чай и зехтин [10]. Кверцетинът има изобилие от ценни ефекти, включващи противовъзпалителни, антиоксидантни, антимутагенни, антиисхемични, антивирусни и анти-стареене ефекти [11-17]. Кверцетинът е липофилен и може да проникне през кръвно-мозъчната бариера (BBB)[18]. Освен това, кверцетинът проявява потенциална антиоксидантна роля чрез усилване на редуцирания глутатион (GSH) и регулиране на медно-цинкова супероксид дисмутаза (SOD1)[17]. Кверцетинът може да хелатира желязото, инхибирайки реакцията на Fenton и инхибирайки генерирането на ROS [19]. Следователно, кверцетинът е потенциално терапевтично средство за множество невродегенеративни заболявания и невронални увреждания [20]. Theантиоксидантпотенциалът на кверцетин ни насърчи да проведем настоящото проучване, за да изследваме защитния потенциал на кверцетин срещу окислителните промени, предизвикани от IONP върху мозъчните тъкани.

Кликнете, за да научите повече за продуктите

2. Резултати

2.1. Размер и такса на IONP

SEM изображение на IONPs, както е показано на Фигура 1, разкрива сферична форма със среден размер от 16.34-22.88 nm, като същевременно притежава положителна стойност на зета потенциала плюс 22,8 mV (Фигура 2).

2.2. Мозъчен оксидативен стрес и антиоксидантен статус

Нивата на продукта на липидната пероксидация малондиалдехид (MDA) бяха значително повишени в групата на IONPs (p<0.05) while="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps="" +="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" (figure="" 3a).mda="" levels="" in="" ionps+="" q25=""><0.01), ionps+=""><0.01) and=""><0.01) were="" significantly="" decreased="" compared="" with="">

Нивата на GSH в мозъчния хомогенат са значително намалени в IONPs (p<0.001), ionps+=""><0.001),ionps+o50><0.001) and="" ionps+="" o100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.in="" ionps+q100,="" the="" gshlevels="" were="" significantly="" increased="" than=""><0.001) and="" ionps+="" q25(p=""><0.01), as="" represented="" in="" figure="">

Нивата на окисления глутатион (GSSG) са значително повишени в IONPs (p<0.001), ionps+q25=""><0.001),><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="">

Въз основа на данните от GSH и GSSG, стойностите на съотношението GSH/GSSG са значително намалени в IONPs (p<0.001), ionps+="" q25,ionps+="" q50="" and="" ionps+="" o100="" compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 3d).="" in="" ionps+="" q100,="" gsh/gssg="" ratio="" values="" were="" significantly="" increased="" in="" comparison="" with=""><0.01)and ionps+q25=""><>

2.3. Дейности на мозъчната креатин фосфокиназа (CPK) и ацетилхолинестераза (AChE)

CPK активностите са значително повишени в IONPs (стр<0.001), ionps="" +="" q25=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" in="" comparison="" with="" the="" ionp="" groups,="" cpk="" activities="" were="" significantly="" decreased="" in=""><0.01),><0.01) and="" ionps+q100=""><0.001)(figure>

На фигура 4B активностите на AChE са значително повишени в IONPs (p<0.001), ionps=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps+q25=""><0.01), ionps+q50=""><0.001)and ionps+q100(p=""><0.001) than="" ionps.in="" addition,="" ache="" activities="" were="" significantly="" decreased=""><0.001) in="" ionps+="" q100="" compared="" with="" ionps+="">

2.4.Мозъчни хормони епинефрин, серотонин и мелатонин

Нивата на епинефрин в мозъчните хомогенати са значително намалени в IONPs (стр<0.001), ionps+="" q25=""><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group(figure="" 4c).in="" the="" ionps+="" q25=""><0.05),ionps+><0.001)and ionps+q100=""><0.001)groups, the="" epinephrine="" levels="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" ionps.="" furthermore,="" the="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps="" +="">

Както може да се види на Фигура 4D, нивата на серотонин са значително намалени в IONPs (стр<><0.001),><0.01) and=""><0.05)compared with="" the="" control="" group.="" in="" ionps+="" q100,="" the="" levels="" significantly="" increased=""><0.05) than="" ionps="" +="">

Нивата на мелатонин в мозъчните хомогенати са значително намалени в IONPs (p<0.001), ionps+=""><0.001) and="" ionps+="" q50=""><0.01) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 4e).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" levels="" in="" the=""><0.01) and="" ionps="" +=""><0.001)groups were="" significantly="" increased.="" it="" significantly="" increased=""><0.001)in ionps="" +="" q100="" compared="" with="" ionps="" +="">

2.5. Мозъчна експресия на PGC-1a и mtTFA иРНК

Активираният с пероксизомен пролифератор рецептор гама коактиватор 1-алфа(PGC-1a) mRNA експресионни промени са значително намалени в IONPs(p<0.001) and="" ionps+q25=""><0.05) and="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q100=""><0.001)compared with="" the="" control="" group="" (figure="" 5a).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" pgc-1a="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q50=""><0.05) and="" ionps+q100=""><0.001).in addition,="" pgc-1a="" expression="" levels="" in="" ionps+="" o100="" were="" significantly="" increased="" (p=""><0.001)compared with="" the="" ionps="" +="" q25="" and="" ionps="" +="" q50="">

В IONPs (стр<0.001), ionps+="" q25="" (p=""><0.001)and ionps+=""><0.05), the="" mrna="" expression="" levels="" of="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a="" (mttfa)="" were="" significantly="" decreased="" than="" in="" the="" control="" group="" while="" they="" significantly="" increased="" in="" ionps+q50=""><0.01) and="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps+="" q25.mttfa="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased=""><0.05) in="" ionps+o100="" in="" comparison="" with="" ionps+q50="" (figure="">

2.6. Оценка на оцветяване с хематоксилин (H) и еозин (E) на мозъчни срезове

Хистологичните оценки на мозъчната тъкан показват, че контролната група показва нормална хистологична структура на слоевете на малкия мозък (Фигура 6А). В групата с IONP, малкият мозък показва силно изчерпване на клетъчния слой на Purkinje (Фигура 6B), докато това изчерпване на клетките на Purkinje слой, дължащ се на IONPs, беше облекчен в групите IONPs плюс Q25 (Фигура 6C), IONPs плюс Q50 (Фигура 6D) и IONPs плюс Q100 (Фигура 6E) по дозозависим начин.

Плъховете в контролната група показаха нормална хистологична структура на менингите и мозъчната кора (Схема 1А), докато менингите на плъхове, третирани с IONPs, показаха конгестия на субменингеалните кръвоносни съдове (Схема 1В). В групите с IONP, главният мозък на мозъка на плъховете показват сателитоза, невронофагия (Схема 1C), глиоза (Схема 1D) и спонгиоза (Схема 1E) освен конгестия на хороидния плексус (Схема 1F).

Както може да се види в схема iF, мозъкът на плъхове в групата с IONPs плюс Q25 показва спонгиоза (къси стрелки) и конгестия на субменингеалните кръвоносни съдове. Освен това, главният мозък на плъхове в групата на IONPs плюс Q50 показва лека спонгиоза и задръстване на кръвоносни съдове (Схема 1H). Мозъкът на плъхове в групата IONPs плюс Q100 показва относително нормална хистологична структура на менингите и кората на главния мозък (Схема 1I).

2.7. Оценка на мозъчните участъци с пруско синьо оцветяване

Мозъчните участъци на контролната група показват отрицателно оцветяване с пруско синьо (Фигура 7А). В групата на IONPs, петна с пруско синьо оцветяване бяха разпознати в мозъчни участъци (Фигура 7B). Напротив, интензитетът на петната с пруско синьо оцветяване на участъците от групата IONPs беше отслабен от кверцетин в групите IONPs плюс Q25 (Фигура 7C), IONPs плюс Q50 (Фигура 7D) и IONPs плюс Q100 (Фигура 7E) в дозозависим начин.

2.8. Нива на протеини на каспаза 3 и Bcl2 в мозъчни участъци

Контролната група показа отрицателна експресия на протеинови нива на каспаза 3 (Фигура 8А), докато те бяха силно експресирани в IONPs (Фигура 8В).Третирани с кверцетингрупи (Фигура 8C-E) показват ниска експресия на каспаза 3 в сравнение с IONPs. Напротив, Bcl2 беше значително експресиран в IONPs плюс Q25 (Фигура 9C), IONPs плюс Q50 (Фигура 9D) и IONPs плюс Q100 (Фигура 9E) в сравнение с IONPs (Фигура 9B) и контролната група (Фигура 9A).

3. Дискусия

Излагането на IONP води до желязо и неговото отлагане в меките тъкани, особено в мозъка [21]. В настоящото изследване разпознахме отлагането на желязо в мозъка, доказано чрез оцветяване с пруско синьо и морфологични промени, наблюдавани чрез оценка на оцветяване с H и E. Dhakshinamoorthy и др. [22] демонстрират, че съдържанието на желязо е повишено значително в мозъчната тъкан на групите, третирани с IONP, в сравнение с контролата. Това беше оценено чрез оцветяване с пруско синьо на мозъчните области и доказано от сини петна във фронталния кортекс, хипокампуса и малкия мозък. El-Sayed и др. [23] също заявяват значително повишаване на нивата на желязо в мозъчната тъкан поради прилагането на IONP при плъхове.

IONP могат да имат по-голяма способност да проникнат през BBB и да предизвикат наранявания на мозъчни клетки, отколкото други клетки на органи [24, 25]. Друго обяснение може да бъде, че повишените нива на желязо

в мозъка, поради свързването на желязото с трансферина, задейства регулирането на рецепторите за желязо в мозъка и, следователно, транспортира желязото през BBB [26].

Свободните фейони реагират с H2O2, за да генерират ROS в реакционния процес на Fenton [27]. Повишената ROS повишава пропускливостта на външната митохондриална мембрана, липидната пероксидация, увреждането на протеина и ДНК веригата се скъсва [28]. Theоксидативен стресна ROS води до повишаване на мозъчните нива на продукта на липидната пероксидация, MDA, както е посочено в настоящото проучване при плъхове, третирани с IONP. По подобен начин, Dhakshinamoorthy et al, [22] съобщават за значително повишаване на нивата на MDA в мозъчните тъкани на мишки, третирани с IONP. Реди и др.[26] също така заяви, че нивата на MDA са значително повишени в мозъчната тъкан при висока доза, но незначително увеличение при ниска доза при плъхове, третирани с IONP. Gaharwar и Paulraj [5] разкриват, че нивата на MDA са значително повишени при плъхове, третирани с IONP. По подобен начин, IONP индуцират окислителното увреждане на кардиомиоцитите, наблюдавано от високо производство на MDA и намалени концентрации на GSH [29].

Авторите в няколко проучвания са изследвали защитния ефект на природните продукти или техните екстракти срещу страничните ефекти, свързани с IONPs, включително екстракти от Echinacea purpurea [30] и Antlriscus sulvestris [31]. В настоящото проучване изследвахме защитната роля на кверцетин срещу токсичността на IONPs в мозъците на плъхове. Добавянето на кверцетин към третирани с IONP плъхове намалява нивата на MDA в мозъчната тъкан и нашите резултати са в съответствие с тези, получени от Dong et al. [32], които заявяват, че кверцетинът намалява липидната пероксидация чрез понижаване на нивата на MDA в мозъчната тъкан при плъхове. Това може да се обясни със способността на кверцетина да намалява ROS, следователно, инхибирайки липидната пероксидация и предотвратявайки образуването на MDA [33]. Това се приписва на катехоловата група (В пръстен) и ОН групата в позиция 3 на А и С пръстена, които имат оптимално отстраняване на свободните радикали [17].

GSH е съществена част от клетъчната антиоксидантна защита, която директно реагира с ROS и други реактивни видове [34]. В настоящото проучване мозъчните нива на GSH са значително намалени при плъхове, третирани с IONP, но нивата на GSSG са значително повишени. Reddy et al [26] посочват изчерпването на нивата на GSH в мозъчната тъкан на плъхове, третирани с IONP и предполагат, че това може да се дължи на повишено използване на GSH в реакции на конюгация като част от механизъм за детоксикация, следователно намаленият GSH намалява и окислява GSSG увеличена. Съвместното приложение на IONP-третирани плъхове с кверцетин възстановява това чрез повишаване на GSH и намаляване на нивата на GSSG в мозъчната тъкан. Тези резултати са в хармония със Singh et al. [35], които съобщават за повишаване на нивата на GSH в мозъчната тъкан, което показва антиоксидантния потенциал на кверцетина. Dong и др. [32] също разкрива, че кверцетинът променя генната експресия на еритроидния 2-фактор 2 (Nrf2) ядрен фактор. Nrf2 следователно стимулира производството на антиоксидантен ензим в мозъчните тъкани.

В настоящото проучване CPK е значително повишена в мозъчната тъкан на плъхове, третирани с IONP. В буферирането на клетъчната енергия и предаването на енергия CPK/фосфокреатинът играе основна роля, особено в клетки с високи и променливи енергийни нужди като неврони [36]. Следователно, активирането на CPK/фосфокреатиновата система и промените в експресията на CPK могат да бъдат по-ранен индикатор за оксидативен и биоенергиен стрес в клетката [37] като компенсация за намаляване на производството на енергия поради оксидативен стрес. Съвместното приложение на плъхове, третирани с IONP, с кверцетин намалява CPK в мозъчната тъкан, Lemmens et al. [38] демонстрира понижение на CPK активността поради добавяне на кверцетин.

Активността на AChE в нервната тъкан е отговорна за хидролизата на ацетилхолин (Ach) до холин в синапсите и нервно-мускулната връзка [39]. В настоящото проучване AChE е значително увеличен при плъхове, третирани с IONP и този резултат е в хармония с Dhakshinamoorthy et al. [22], които разпознават значително повишение на активността на AChE в мозъчната тъкан на плъхове, третирани с IONP, при които натрупването на желязо от IONPs променя холинергичната система.

Невротрансмитерите са ендогенни химични вещества, които позволяват на невроните да комуникират в цялото тяло; те позволяват на мозъка да изпълнява различни функции в химическото синаптично предаване [40]. В настоящото проучване концентрациите на епинефрин, серотонин и мелатонин в мозъчните тъкани са значително намалени при плъхове, третирани с IONP.

Юсеф и др. [41] съобщават, че нивата на серотонин и допамин са значително намалени в мозъчната тъкан при плъхове, третирани с IONP. Обратно, кверцетинът повишава концентрациите на епинефрин, серотонин и мелатонин в мозъчните тъкани в сравнение с IONP. Singh и др. [35l твърди, че кверцетинът повишава серотонина, норепинефрина и допамина.

Митохондриалната биогенеза поема основна роля в поддържането на митохондриалната хомеостаза, за да отговори на клетъчните физиологични нужди на нервните клетки [42]. PGC-1a е ко-транскрипционен регулаторен фактор, който индуцира митохондриална биогенеза и насърчава експресията на mtTFA [43]. В настоящото изследване нивата на експресия на PGC-1a и mtTFA са значително намалени в мозъчната тъкан при плъхове, третирани с IONP. Нашите резултати бяха в съответствие с тези, получени от Yousef et al. [44]. Те илюстрират, че митохондриалната биогенеза, представена от PGC-la и mtTFA, значително намалява тяхната експресия в мозъчната тъкан при плъхове, изложени на IONP, което показва намалена митохондриална биогенеза и репликация и транскрипция на mtDNA, които могат да доведат до митохондриална дисфункция. Съвместното приложение на плъхове, третирани с IONP, с кверцетин възстановява това намаление чрез повишаване както на експресиите на PGC-1a, така и на mtTFA в мозъчната тъкан и нашите резултати са в хармония с Sharma et al.[45] които съобщават, че кверцетинът повишава експресията на PGC-1a, NRF-1, NRF-2 и mtTFA. Те предполагат, че поради намаляването на ROS от индуцирания от кверцетин PGC{{17 }}повишаване, това доведе до активиране на NRF-1 и NRF-2 стимулирана експресия на mtTFA.

Кверцетинът намалява апоптотичния ефект на IONPs чрез значително намаляване на каспаза 3 и повишаване на нивата на експресия на Bcl2 в мозъчни имунохистохимични секции. Това откритие подкрепяантиоксидантпотенциал на кверцетин. По подобен начин, лечението с кверцетин отслабва увеличаването на каспаза 3 при исхемично мозъчно увреждане при плъхове [46,47] и Bcl2 при мишки, третирани с липополизахарид [48].

4. Материали и методи

4.1.Реактиви и химикали

Прах от наночастици железен (ⅡI) оксид беше получен от Sigma-Aldrich (Луис, Мо, САЩ), който беше разтворен в дейонизирана вода преди употреба. Кверцетинът е прахообразна форма, също се получава от Sigma-Aldrich, който се разтваря в диметилсулфоксид (DMSO) и дестилирана вода в съотношение съответно 1:20 преди употреба. DMSO, по-голям или равен на 99,6 процента, е закупен от Sigma-Aldrich. Други химикали и дейонизирана вода бяха закупени от Центъра за следдипломни изследвания и изследвания към Александрийския университет.

4.2. Етична декларация

Проучването е одобрено в отговор на насоките на "Ръководството на NIH за грижа и използване на лабораторни животни" от Комитета по етика на Факултета по ветеринарна медицина на Александрийския университет, Египет.

4.3. Характеризиране на IONP

Морфологията и размерът на частиците на IONPs бяха изследвани чрез сканиращ електронен микроскоп (SEM). Зарядът на частицата също се определя чрез зета потенциал с помощта на ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK).

4.4.Животни, жилища и експериментален дизайн

Четиридесет здрави възрастни мъжки плъхове албиноси с тегло 150± 20 телесно тегло (BW) бяха закупени от отдела за развъждане на животни, Медицински изследователски институт на Александрийския университет, Египет. Животните бяха държани в метални клетки при контролирани условия на околната среда с оптимална температура (23±2), влажност (55±5) и цикъл тъмно/светло (12 часа) и свободен достъп до основна хранителна диета (Таблица 1) и питейна вода. Всички животни бяха настанени две седмици преди експеримента за аклиматизация. Плъховете бяха разпределени на случаен принцип в пет групи (по осем плъха всяка); контролата получи нормална основна диета и вода ad libitum, групата на IONPs беше инжектирана интраперитонеално с IONPs 50 mg/kg BW три пъти седмично[49], групата на IONPs плюс Q25 mg беше приложена със същата доза

от IONPs и сондирано с 25 mg кверцетин/kg телесно тегло дневно, групата на IONPs плюс Q50 се прилага със същата доза IONPs и се прилага със сонда с 50 mg кверцетин/kg телесно тегло дневно, а групата на IONPs плюс Q100 се прилага със същата доза IONPs и се прилага със сонда със 100 mg кверцетин/kg телесно тегло дневно [17]. Всички лечения са поддържани в продължение на 30 дни.

4.5. Вземане на проби

В края на експеримента, плъховете са гладни в продължение на 12 часа и са анестезирани с помощта на интраперитонеална инжекция на кетамин/ксилазин (100 mg/kg/10 mg/kg), след което са евтаназирани и мозъкът е незабавно дисектиран, изплаква се с охладен нормален физиологичен разтвор 0,9 процента и се разделя на три части; първият е използван за биохимични анализи. Втората част се поддържа при -80 степен за екстракция на иРНК и RT-PCR оценка, докато последната част се промива с фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS, рН 7,4) и се фиксира в 4 процента параформалдехид, разтворен в PBS за 48 часа за фиксиране на проба.

4.6. Биохимични анализи

Части от всеки мозък на плъх се хомогенизират в студен фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS) и се центрофугират за 10 минути при 4 градуса при 1435 × g. Малондиалдехид (MDA), GSH, окислен глутатион (GSSG) и креатин фосфокиназа (CPK) бяха определени от търговските комплекти на Biodiagnostic Co. (Giza, Египет). Ензимните активности на ацетилхолинестеразата (AChE) в мозъчни хомогенати се определят чрез колориметричен комплект за анализ (BioVision Co., Milpitas, СА, САЩ). Нивата на епинефрин, серотонин и мелатонин в мозъчни хомогенати също се определят с помощта на комплекти ELISA (BioVision Co., Milpitas, СА, САЩ).

4.7. Екстракция на иРНК и RT-PCR

Общата РНК се екстрахира от пробите с помощта на комплектите за екстракция на проста РНК на производителя easy-RED (iNtRON Biotechnology, Inc., Gyeonggi-do, Южна Корея). Първата верига сДНК беше получена с помощта на HiSen Script cDNA (iNtRON Biotechnology, Inc.) пакет. Бяха използвани специфични праймери за амплифициране на избрани гени с глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) като стабилен домакински ген (Таблица 2). Експресията на mRNA беше постигната с помощта на Strata ген MX3005P PCR в реално време (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ) и ТОП истинска TM PreMIX SYBR Green qPCR основна смес (кат. RT 500, Enzynomics, Daejeon, Южна Корея), следвайки инструкциите на производителя. Относителните концентрации на генна експресия бяха оценени с помощта на 2-AAct метода, както е описано от Pfaffl [50].

4.8. Хистопатологично изследване

Използвайки традиционната техника за включване на парафин, фиксираните образци бяха дехидратирани чрез нарастващи градуси етанол, изчистени в три ксиленови смени и бяха завършени чрез вграждане в парафин при 65 градуса С. Срезове с дебелина 4 um бяха оцветени с хематоксилин и еозин (Н и Е) [51].

Мозъчните срезове се хидратират чрез поредица от намаляващи концентрации на алкохол и се поставят в 20% разтвор на калиев фероцианид с 20% разтвор на НС1 за 30 минути. Предметните стъкла се измиват, дехидратират, изчистват с ксилен и се наблюдават под микроскоп за синьо оцветяване или съдържание на желязо [52].

4.9.Имунохистохимично изследване

Стандартната имунохистохимична техника на пероксидаза от хрян (HRP) беше приложена към положително заредените слайдове на парафиновите тъканни срезове. Съгласно указанията на производителя бяха използвани заешка анти-плъхова каспаза 3 (Lab Vision, Fremont, CA, USA) и Bcl2 (DAKO, Glostrup, Denmark). Пет части с дебелина на um от главния мозък, малкия мозък, гръбначния мозък и седалищния нерв бяха депарафинизирани, рехидратирани и предварително обработени с 3 процента водороден пероксид (H2O2), за да се блокира ендогенната пероксидазна активност. Извличането на антиген се извършва чрез поставяне на предметни стъкла в микровълнова фурна за 10 min в 10 mM натриев цитратен буфер (рН 6,0). Слайдовете се инкубират с първичното антитяло и след това се изплакват с Tris-буферен физиологичен разтвор и вторичното антитяло. Предметните стъкла се инкубират с 3,3/-диаминобензидин (DAB) субстратен хромогенен разтвор и след това се оцветяват обратно с хематоксилин на Mayer. Изображения на 10 различни полета бяха изобразени при увеличение × 400.

4.10. Статистически анализ

Еднопосочна ANOVA с post hoc многообхватни тестове на Tukey беше използвана за анализа на данните с помощта на GraphPad Prism v.5https://www.graphpad.com/, достъпен на 10 март 2021 г. (GraphPad, Сан Диего, Калифорния, САЩ) . Всички декларации за значимост зависят от стр<0.05. 5.="">

Наночастици железен оксид (IONPs), инжектирани интраперитонеално в доза от 50 mg/kg BW, предизвикват окислителни промени в мозъка, докато кверцетинът в дози от 25, 50 и 100 mg/kg BW облекчава мозъчните оксидативни увреждания, индуцирани от IONPs. Следователно, кверцетинът е обещаваща хранителна добавка заедно с IONP терапията.

Препратки

1. Мазде, М.; Рахиминеджад, ME; Нили-Ахмадабади, А.; Ranjbar, A. Неврологични разстройства и оксидативен токсичен стрес: Роля на металните наночастици. Jundishapur J. Nat. Pharm. произв. 2016, 11, e27628. [CrossRef]

2. Фидлър, MC; Валчик, Т.; Davidsson, L.; Zeder, C.; Сакагучи, Н.; Джунея, LR; Hurrell, RF Микронизиран, диспергируем железен пирофосфат с висока относителна бионаличност при хора. бр. J. Nutr. 2004, 91, 107–112. [CrossRef]

3. Ramimoghadam, D.; Багери, С.; Хамид, SBA Напредък в електрохимичния синтез на наночастици от магнитен железен оксид. J. Magn. Магн. Матер. 2014, 368, 207–229. [CrossRef]

4. Гахарвар, САЩ; Кумар, С.; Rajamani, P. Индуциран от наночастици железен оксид хемопоетичен и имунологичен отговор при плъхове. RSC Adv. 2020, 10, 35753–35764. [CrossRef]

5. Гахарвар, САЩ; Paulraj, R. Наночастици от железен оксид, предизвикани от окислително увреждане в периферните кръвни клетки на плъх. J. Biomed. Sci. инж. 2015, 8, 274–286. [CrossRef]

6. Фън, К.; Liu, Y.; Huang, J.; Чен, К.; Huang, J.; Xiao, K. Поемане, разпределение, изчистване и токсичност на наночастици железен оксид с различни размери и покрития. Sci. Rep. 2018, 8, 1–13. [CrossRef] [PubMed]

7. Гахарвар, САЩ; Мийна, Р.; Rajamani, P. Биоразпределение, клирънс и морфологични промени на интравенозно прилагани наночастици железен оксид при мъжки плъхове Wistar. Вътр. J. Nanomed. 2019, 14, 9677–9692. [CrossRef] [PubMed]

8. Палмиери, Б.; Sblendorio, V. Оксидативни стрес тестове: Преглед на надеждността и употребата, Част II. Евро. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2007, 11, 383–399.

9. Накви, С.; Самим, М.; Абдин, MZ; Ахмед, FJ; Майтра, AN; Прашант, CK; Dinda, AK Зависеща от концентрацията токсичност на наночастиците от железен оксид, медиирана от повишен оксидативен стрес. Вътр. J. Nanomed. 2010, 5, 983–989. [CrossRef]

10. Дейвид, AVA; Arulmoli, R.; Parasuraman, S. Прегледи на биологичното значение на кверцетин: биоактивен флавоноид. Pharmacogn. Rev. 2016, 10, 84–89.

11. Ву, В.; Ли, Р.; Ли, X.; Той, Дж.; Jiang, S.; Лиу, С.; Yang, J. Кверцетинът като антивирусен агент инхибира навлизането на вируса на грип A (IAV). Вируси 2015, 8, 6. [CrossRef]

12. Акдемир, FNE; Гюлчин, ˙I.; Карагьоз, Б.; Soslu, R. Quercetin предпазва скелетните мускули на плъх от исхемично-реперфузионно увреждане. J. Enzym. инхиб. Med. Chem. 2016, 31, 162–166. [CrossRef] [PubMed]