Бързо едновременно определяне на шест ефективни компонента в Cistanche Tubulosa чрез близка инфрачервена спектроскопия

1. Въведение

Cistanche (Hoffmg. Et Link) е многогодишно фанерогамно растение от семейство Orobanchaceae. Повечето видове, принадлежащи към рода Cistanche, са били използвани като лечебно растение от хилядолетия в Китай; имат репутация на превъзходен тоник; и са известни като "Женшена на пустините". Cistanche tubulosa е облигатен паразит по корените на многогодишното растение Tamarix chinensis. Той е документиран в Китайската фармакопея като автентичен източник наЦистани Херба(китайско име: Roucongrong) от изданието от 2005 г. Съвременните фармакологични изследвания на видовете Cistanche започват през 80-те години на миналия век. Фармакологичните изследвания показват, че екстрактите от растения Cistanche притежават широк спектър от действия, като лечение на бъбречна недостатъчност и старчески запек, подобряване на способността за учене и запаметяване, против болестта на Алцхаймер, повишаване на имунитета, против стареене, против умора и др. През последните три десетилетия всеобхватни и систематични фармакологични изследвания бяха комбинирани с фитохимични изследвания, за да се осветли материалната основа на полезните ефекти на корените на растенията Cistanche. Тези проучвания показват, че фенилетаноидните гликозиди (PhG) са основните ефективни компоненти в растенията Cistanche, които играят ключова роля в лечението на бъбречна недостатъчност, импотентност, против стареене и болестта на Алцхаймер. Съдържанието на два PhG (ехинакозид и вербаскозид) се изискваше в Китайската фармакопея. Междувременно въглехидрати като манитол, захароза, глюкоза и фруктоза в растенията Cistanche притежават слабителната функция и въглехидратните клъстери наCistanche растенияса използвани за лечение на запек.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОВИШАВАНЕ НА ТЕСТОСТЕРОН PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Дивите ресурси на C. tubulosa са разпространени главно в района около пустинята Такламакан в южния автономен регион Синдзян в Китай. Подобно на много други видове, използвани като традиционни китайски лекарства (TCM), C. tubulosa има голяма икономическа стойност и е почти изчезнал в дивата си среда поради прекомерно събиране. Култивирането на C. tubulosa започва през 90-те години в Китай, за да се осигури доставката на суровини за Cistanches Herba, както и да се защитят дивите растителни ресурси. Към 2017 г. близо 13 хиляди ха култивирани C. tubulosa съществуват в префектура Хотан в Синдзян. Необходим е напредък в технологията на засаждане за разширяване на култивирането, както и за подобряване на качеството на C. tubulosa.

Основната цел на култивирането на C. tubulosa е производството на Cistanches Herba, богато на тези ефективни компоненти. Въпреки това, съдържанието на ефективните компоненти вЦистани Херба, като PhG и олигозахариди, могат да бъдат значително повлияни от много фактори по време на производството. Трябва да се проучи система за откриване в реално време на качеството на C. tubulosa. Следователно е необходимо да се разработи метод с висока производителност, за да се изпълни изискването за анализиране на голям брой проби за кратък период от време. Традиционно, определянето на тези първични ефективни компоненти, като PhG и въглехидрати, в C. tubulosa обикновено се постига с помощта на високоефективна течна хроматография (HPLC). Въпреки че е точен и надежден, той отнема време и трудоемко за събиране и обработка на данни. В допълнение, много време и усилия също са необходими за подготовката на пробата, която обикновено включва пулверизация, екстракция и филтриране на HPLC анализи. Следователно са необходими ясен принцип и лесен за работа инструмент за получаване на относително голямо количество данни. За щастие, близката инфрачервена спектроскопия (NIRS) се използва широко за оценка на селскостопански продукти, храни, медицински проби и фармацевтични продукти, тъй като е бърза, както и неразрушителна. Следователно NIRS може точно да отговаря на изискванията за ефективни измервания на TCM и, не е изненадващо, NIRS е приложен за качествена идентификация и количествено определяне на съединения в TCM.

В това проучване съдържанието на шест ефективни компонента, включителноехинакозид, вербаскозид, манитол, захароза, глюкоза и фруктозав 116 партиди проби от C. tubulosa, които бяха събрани от префектура Хотан в Синдзян през 2013–2015 г., бяха определени за първи път чрез HPLC. След това моделите за калибриране на тези шест компонента бяха установени с метода на частичната регресия на най-малките квадрати (PLSR). След това тези модели бяха валидирани с коефициентите на корелация и грешките при прогнозиране в комплектите за калибриране. Резултатите показват, че разработеният метод може да се използва като надежден метод за количествен анализ на C. tubulosa.

2. Резултати

2.1. HPLC анализ

Съдържанието наехинакозид и вербаскозидбяха определени чрез добре дефиниран HPLC-UV метод в литературата и четири въглехидрата (манитол, захароза, глюкоза и фруктоза) бяха определени чрез добре дефиниран HPLC-ELSD метод в литературата за всичките 116 проби. Подготовката на пробите и методите за определяне са описани в раздели 3.1 и 3.3. Фигура 1 показва характеристичните хроматограми на смесените стандарти. Може да се види, че всичките шест ефективни компонента са разделени от базовата линия и следователно могат да бъдат количествено определени. HPLC методът е валидиран преди тестването на пробата. Основните резултати от метода HPLC са изброени в таблица 1. Благоприятна линейна връзка (r=0.9998) и възстановяване (98,5%) на метода за определяне на ехинакозид са показани в резултатите, същият резултат като всичките пет компоненти. Следователно съдържанието на шестте ефективни компонента може да се определи точно. Всички определени диапазони на съдържание са обобщени в таблица 1.

2.2. NIRS анализ

Фигура 2 показва NIR спектрите (4000–10,000 cm−1) на пробите от C. tubulosa. Значителни пикове на абсорбция се появяват от 4000 cm-1 до 7500 cm-1 във всички проби, докато леки колебания се появяват от 7500 cm-1 до 10 000 cm-1. Базовият дрейф на NIR спектрите се появи, защото пробата лесно се повлиява от фактори като размер на частиците и цвят (Фигура 2А). Бяха използвани математически предварителни обработки на спектрите, за да се намали до известна степен влиянието на ненужната информация. Математическите предварителни обработки включват първо извеждане (1-во извеждане), второ извеждане (2-ро извеждане), стандартно нормално разнообразие (SNV) и мултипликативна корекция на разсейване (MSC). Фигура 2B показва второто извеждане на NIR спектрите на C. tubulosa и се наблюдават значителните вариации, настъпили от три области, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 и 7000–7500 cm−1.

2.3. Създаване на модели за количествено калибриране

Частичната регресия на най-малките квадрати (PLSR) е класически метод за моделиране и се прилага широко в количествените модели поради високото качество на резултатите. Предимствата на PLSR включват неговата добра способност за прогнозиране и относителна простота. PLSR също се прилага широко при създаването на модели за количествено калибриране на TCM [25]. Въз основа на предварително обработените NIR спектри беше създаден модел за количествен анализ на NIR за шестте ефективни компонента в C. tubulosa с помощта на метода PLSR с данни от HPLC анализ като истински стойности. 116-те проби бяха разделени на случаен принцип в комплекти за калибриране и валидиране със съотношение 3:1. Най-подходящите условия за калибриране бяха избрани чрез нисък RMSEC и висок коефициент на корелация.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Избор на вълнов диапазон за моделите за калибриране

Изборът на подходяща вълнова лента беше важна стъпка за изграждане на модел за калибриране. В това изследване бяха сравнени спектрите на NIR интервала от 4000–7500 cm−1 (препоръчан от софтуера за анализатор на TQ) и 4000–10 000 cm−1. Беше наблюдавано, че този диапазон е неподходящ за калибриране в интервала между 4000 cm−1 и 7500 cm−1 от таблица 2. Следователно, в настоящото изследване спектралните интервали за шестте химични съставки бяха избрани от интервала от 4000 до 10 000 cm−1 чрез сравняване на характеристиките на RMSEC и коефициента на корелация.

2.3.2. Избор на оптимален брой фактори за моделите за калибриране

PLSR обяснява максималното количество променливост в данните чрез намаляване на размерността на спектралните данни чрез изчисляване на фактори. Проблемът с "недостатъчната годност" се появи поради недостатъчна информация, произтичаща от ограничен брой фактори; обаче, изборът на фактори, по-големи от оптималните стойности, въведени в модела, ще доведе до проблема с "прекомерното оборудване". Или „недостатъчното оборудване“, или „прекомерното оборудване“ ще намалят предсказващата сила на установените модели [22]. Фигура 3 показва връзката между RMSECV и факторите за всичките шест съединения. Затова избрахме тези фактори, съответстващи на най-ниските стойности на RMSECV. Оптималният избор на фактори за моделите за калибриране е посочен в таблица 3.

2.3.3. Избор на спектрална предварителна обработка за моделите за калибриране

Друг критичен влиятелен фактор за моделите за калибриране е спектралната предварителна обработка, която е насочена към намаляване на влиянието на разсейването и дрейфа на базовата линия, подобряване на съотношенията сигнал/шум и премахване на неравномерни вариации. Методите за мултипликативна корекция на разсейването (MSC) и стандартните нормални променливи (SNV) бяха използвани за елиминиране на влиянието на разсейването на радиацията. За да се решат ефектите от дрейфа на базовата линия, спектрите на 1-ви и 2-ри производни бяха сравнени и беше избрано 2-ро извеждане. За желания ефект ние изгладихме спектрите с филтърния алгоритъм на Savitzky-Golay (SG) преди извличането, за да предотвратим увеличаването на шума. Таблица 3 показва информацията за спектралната предварителна обработка и резултатите от нея за моделите за калибриране.

2.4. Оценка на утвърдените модели

Един добър модел за калибриране на NIRS трябва да има ниски стойности на RMSEC и RMSEP, както и висок коефициент на корелация (r) и малки разлики между RMSEC и RMSEP. Моделите за калибриране на шестте избрани съединения бяха установени съгласно процедурите, споменати по-горе (Таблица 3). Стойностите RMSEC и r за калибровъчния набор от ехинакозид бяха съответно 27,6 и 0.9808. Параметрите на ефективността на други модели на химични съединения са изброени в таблица 3, от която можем да заключим, че установените модели дават задоволителни прогнозни резултати и могат да се използват за бърз количествен анализ на C. tubulosa. Графиките на разсейване на шестте химични съединения са показани на Фигура 4, за да направят моделите за калибриране по-описателни и визуално наблюдавани. Както е показано на фигура 4, възникнаха малки разлики между прогнозните и измерените стойности, тъй като повечето точки бяха разпределени около регресивната крива с уравнение като y=x. Следователно на Фигура 4 се наблюдават отлични прогнозни показатели.

3. Материали и методи

3.1. Приготвяне на пробата

Сто и шестнадесет проби от C. tubulosa бяха събрани от префектура Хотан в автономния регион Синдзян от 2013 до 2015 г. Всички проби бяха култивирани, но бяха събрани на различни етапи на растеж. Прясното тегло на пробите варира от 20 g до 1000 g. След изсушаване на слънце, изсушените проби се натрошават и пресяват през 60-мрежесто сито.

3.2. Събиране на NIR спектроскопски данни

NIR спектрите на пробите бяха събрани на интервал от 8 cm−1 в спектралната област от 4000–10 000 cm−1 със система Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA), оборудвана с ръчен адаптер за отразяване на оптични влакна. Всеки спектър е получен чрез осредняване на 64 сканирания. Всички проби бяха оставени да се уравновесят до стайна температура (25 ◦C) преди сканиране на NIR спектрите, за да се гарантира, че пробите са анализирани при същата температура. Влажността в лабораторията се поддържаше на нивото на околната среда.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. HPLC събиране на данни

3.3.1. Подготовка за екстракция

Един грам прах от C. tubulosa се екстрахира с 50 mL 50% метанол в конична колба с ултразвук (500 W, 40 KHz) в продължение на 30 минути. Екстрактът се съхранява при 4 ◦C. Супернатантата на екстракта се филтрира, за да се получи проба за HPLC анализ.

3.3.2. Едновременно определяне на ехинакозид и вербаскозид с HPLC-UV

Течният хроматографски анализ беше извършен на Shimadzu UHPLC система (Shimadzu, Киото, Япония), състояща се от две LC-20ADXR единици за доставяне на разтворител, LC-20AD помпа, SIL-20ACXR auto пробоотборник, колонна пещ CTO-20AC, детектор SPD-M20A DAD, дегазатор DGU-20A3R и контролер CBM-20A.

Колона Grace Prevail Carbohydrate ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm), използвана за хроматографските разделяния, се поддържа при 35 ◦C. Подвижната фаза се състоеше от ацетонитрил (A) и 0.1% воден разтвор на мравчена киселина (B) и беше доставена, следвайки градиентната програма, както следва: 0–7 минути, линеен градиент от 10–20% А; 7–15 минути, 20% A; и 15–20 минути, линеен градиент от 20–10% А. Скоростта на потока на подвижната фаза е 0,4 mL/min. UV мониторинг се извършва при 330 nm.

3.3.3. Едновременно определяне на манитол, захароза, глюкоза и фруктоза с HPLC-ELSD

HPLC беше извършена на Agilent 1100 серия LC система (Пало Алто, Калифорния, САЩ), състояща се от G1322A дегазатор, G1311A кватернерна помпа, G1311A автосамплер, G1316A контролер на температурата на колоната и G1315B DAD детектор.

Колона Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 × 250 mm, 5 µm) се използва за хроматографски разделяния и се поддържа при температура на колоната от 25 ◦C. Подвижната фаза се състои от ацетонитрил и вода (77:23, v/v) и изократен съюзник, доставен при скорост на потока от 0,7 mL/min. Отпадъчните води се наблюдават с помощта на детектор за разсейване на светлина при изпаряване (ELSD) с параметри по подразбиране.

3.4. Обработка на данни

TQ Analyst (версия 8.0, Thermo Scientific, Медисън, Уисконсин, САЩ) беше използван за извършване на разделянето на комплектите за калибриране и валидиране, предварителна математическа обработка на спектрите, установяване на модели за калибриране и други изчисления . За направата на фигурите е използван Origin (версия 9.1).

4. Изводи

В това проучване ние предложихме бърз и неразрушителен метод за едновременен анализ наехинакозид, вербаскозид, манитол, захароза, глюкоза и фруктозавC. tubulosaот NIRS. Анализите на стойностите на RMSEC, коефициента на корелация, RMSEP и Rp показаха, че установените количествени NIR модели могат да се използват за точно прогнозиране на съдържанието на шестте избрани ефективни компонента вC. тубулоза. В сравнение с HPLC, методът NIRS, докладван в това проучване, може да спести значителен труд и време, като същевременно поддържа задоволителна способност за количествен анализ. Следователно описаният тук метод има потенциал да бъде използван при контрола на качеството наC. tubulosaи по този начин да ръководи развитието на технологиите за отглеждане и обработка наC. тубулоза.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%