за повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Sante Princero Berlingerio^1,†, Джунлинг Хе^2,†, Лиес Де Гроф ³, Харолд Татер⁴, Томас Нортън⁴, Питер Баатсен ⁵, Сара Кайроли⁶, Бианка Гофредо⁶, Питър де Вите ⁷, Ламбертус ван ден Хойвел^1,8, Ханс Й. Баелде²и Елена Левченко^1,*

^{Част I: Бъбречни и екстраренални прояви при модел на цистиноза при възрастни риби зебра}

¹Лаборатория по детска нефрология, KU Leuven, 3000 Leuven, Белгия; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (SPB); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (LvdH)

²Катедра по патология, Медицински център на университета Лайден, 2300 RC Лайден, Холандия; J.He@lumc.nl (JH); j.j.baelde@lumc.nl (HJB)

³ Изследователска група за развитие и регенерация на невронни вериги, KU Leuven, 3000 Leuven, Белгия; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Група на M3-BIORES, Отдел за инженерство за здравето на животните и хората, KU Leuven, 3000 Leuven, Белгия; harold.taeter@kuleuven.be (HT); tomas.norton@kuleuven.be (TN)

⁵Молекулярна невробиология, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Белгия; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶Отделение по педиатрична медицина, Лаборатория по отдел за метаболитна биохимия, Детска болница Bambino Gesù, IRCCS, 00146 Рим, Италия; sara.cairoli@opbg.net (SC); biancamaria.goffredo@opbg.net (BG)

⁷Лаборатория за молекулярно биооткриване, KU Leuven, 3000 Leuven, Белгия; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Катедра по детска нефрология, Медицински център на университета Radboud, 6525 GA Nijmegen, Холандия

^*Кореспонденция: elena.levtchenko@uzleuven.be; Тел.: плюс 32-16-34-38-22

^† Тези автори допринесоха еднакво за тази работа.

Резюме:цистинозае рядко, нелечимо, автозомно рецесивно заболяване, причинено от мутации в гена CTNS. Този ген кодира цистинозата на лизозомния цистин транспортер, което води до натрупване на лизозомален цистин във всички клетки на тялото, като бъбреците са първите засегнати органи. Текущото лечение с цистеамин намалява натрупването на цистин, но не обръща проксималната тубулна дисфункция, гломерулно увреждане или загуба набъбречнафункция. В нашето предишно проучване ние разработихме модел на цистиноза при рибка зебра чрез безсмислена мутация в гена CTNS и показахме, че ларвите на рибка зебра рекапитулиратбъбрекфенотип, описан при хора. В настоящото проучване ние характеризирахме възрастнияцистинозамодел на рибка зебра и оцени дългосрочните ефекти на болестта върхубъбреки екстраренален органи чрез биохимични, хистологични изследвания, изследвания на плодовитостта и локомоторната активност. Установихме, че възрастниятцистинозаРиба зебра показва натрупване на цистин в различни органи, променена морфология на бъбреците, нарушена пигментация на кожата, намалена плодовитост, променена локомоторна активност и очни аномалии. Като цяло нашите данни показват, че възрастниятцистинозамоделът на рибка зебра възпроизвежда няколко човешки фенотипа на цистиноза и може да бъде полезен за изучаване на патофизиологията и дългосрочните ефекти на новите терапии.

Ключови думи:бъбрекзаболяване;цистиноза; модел рибка зебра;бъбречнаи екстраренален проявление; фенотипни характеристики на възрастни

1. Въведение

цистинозае автозомно рецесивно нарушение на съхранението, причинено от мутации в гена CTNS, който кодира цистинозата на лизозомния цистин протонен ко-транспортер, пренасящ цистин от лизозомния лумен до цитозола. Няколко органа участват в заболяването, като мускули, тестиси, очи и мозък, и сред всички,бъбрециса първите и най-силно засегнати органи [1]. Най-честият и тежък клиничен вариант е инфантилната нефропатияцистиноза, при което първата клинична изява ебъбречнаСиндром на Fanconi, характеризиращ се с увредена проксимална тубулна епителна клетка

(PTE) реабсорбция, водеща до загуба с урината на аминокиселини, глюкоза, протеини с ниско до средно молекулно тегло и други метаболити. Увреждането на PTEC е последвано от прогресивна гломерулна дисфункция и, когато не се лекува, води до краен стадийбъбрекзаболяване [1]. Настоящият терапевтичен подход се състои от цистеамин, който е аминотиол, изчерпващ цистина, който разрушава дисулфидния мост на цистеина, което води до образуването на аминокиселина цистеин и цистеамин-цистеинов смесен дисулфид. Последната молекула може да напусне зозомите чрез аминокиселинен транспортер PQLC2[2]. Въпреки това, лечението с цистеамин, въпреки че намалява натрупването на лизозомен цистин, само забавя прогресията на заболяването [3–5]. Следователно по-нататъшното разбиране на патогенезата нацистинозаи разработването на нов терапевтичен вариант все още са в дневния ред на изследванията. Разработени са няколко животински модела, за да се обобщи фенотипът на цистиноза [6,7]. Един от най-използваните модели е мишка Ctns−/− C57BL/6, която развива натрупване на цистин и лека проксимална тубулопатия. Въпреки това, той не показва гломерулно увреждане и е установено, че фенотипът зависи от генетичния фон [8].

Към днешна дата моделите на рибки зебра са се превърнали в привлекателен инструмент за изследване на човешки заболявания поради няколко предимства като тяхното бързо развитие, висока плодовитост, по-ниски разходи за поддръжка и наличието на лесно приложими технологии за редактиране на гени [9]. В предишно проучване ние представихме конгеничен модел на ларви на рибка зебра с хомозиготна безсмислена мутация в екзон 8 на гена ctns−/−, което води до функционална загуба на цистиноза [10], което води до натрупване на цистин в цялото тяло, увеличено деформация на ларвите, забавено развитие ибъбрекщета. Въпреки това дългосрочните последици от заболяването при възрастни рибки зебра не са проучени досега. В настоящото изследване ние имахме за цел да характеризирамебъбречнаи екстраренални прояви в модела на възрастни рибки зебрацистиноза.

Щракнете върху ОрганичноCistanche за бъбречно заболяване

2. Резултати

2.1. Цистинът се натрупва в Ctns−/− рибка зебра

цистинозасе счита за мултисистемно разстройство, водещо до натрупване на цистин във всички клетки на тялото. В предишната ни работа открихме, че рибките зебра с цистиноза (ctns−/−) показват натрупване на цистин, започвайки от ларвния стадий на развитие и в няколко органа до възраст от 8 месеца [9]. За да оценим дали нашият модел поддържа натрупването на цистин в по-късните етапи на заболяването, ние измерихме нивата на цистин в цялото тяло,бъбрек, тестиси, очи, мускули и мозък при 18-месечни ctns−/− рибки зебра в сравнение със съвпадащи по възраст мъжки рибки зебра от див тип. Установихме 54-кратно увеличение на съдържанието на цистин в цялото тяло (Фигура 1A) и 146-кратно увеличение в бъбрека (Фигура 1B) на ctns−/− риба зебра в сравнение с дивия тип рибка зебра. Нещо повече, наблюдавахме обширно натрупване на цистин в тестисите, очите, мускулите и мозъка (Фигура 1C–F) при ctns−/− рибка зебра.

2.2. Бъбречна проява

2.2.1. Ctns−/− Риба зебра има PTEC повреда

Тъй катобъбреке най-силно засегнатият орган, ние изследвахме хистологичните характеристики на бъбрека, използвайки оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) и периодично киселинно изместване (PAS). Отбелязахме наличието на мътно подуване, хиалиноподобни еозинофилни капчици и цитоплазмени вакуоли в PTEC на ctns−/− рибка зебра (Фигура 2B, D), но не и при рибка зебра от див тип (Фигура 2A, C). Трябва да се отбележи, че не е открито дистално тубулно увреждане. Цистиновите кристали са били наблюдавани преди това в PTEC като цитоплазмени вакуоли с правоъгълни или полиморфни форми [11]. Следователно, ние изследвахме дали тези структури присъстват и в тубулите на рибка зебра. Открихме многобройни цитоплазмени вакуоли в PTEC на ctns−/− риба зебра чрез оцветяване с толуидиново синьо (Фигура 3B, D, обозначена със звездички). В допълнение, открихме вакуоларно пространство с правоъгълни или полиморфни форми (Фигура 3B, D, обозначена с върхове на стрелки). Ние потвърдихме тази констатация чрез трансмисионна електронна микроскопия (TEM) (Фигура 3F). Тези структури не присъстваха в PTEC на рибка зебра от див тип (Фигура 3A, C, E). Интересното е, че в допълнение към наличието на вакуоли с полиморфна форма, ние наблюдавахме частична загуба на границата на четката в ултраструктурата на PTEC (Фигура 3F).

Фигура 1. Съдържание на цистин в хомогенати от див тип и ctns−/− риба зебра. (A–F) Съдържание на цистин в цялото тяло (A),бъбрек(B), тестис (C), очи (D), мускул (E) и мозък (F) при див тип и ctns−/− 18-месечна мъжка риба зебра. Концентрацията на цистин се изразява като nmol/mg протеин. Всяка точка представлява една рибка зебра за общо n=3 див тип и n=3 цента−/− 18-месечни мъжки рибки зебра; несдвоен t-тест с корекция на Welch, двустранен: * p < 0.05;="" **=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Фигура 2.Бъбрекхистология при див тип и ctns−/− риба зебра. (A, B) Представителни изображения набъбречнатубули на див тип (A) и ctns−/− (B) 18-месечна рибка зебра. Подробности за проксималните тубули с хиалиноподобни еозинофилни капчици (черни върхове на стрелки) и цитоплазмени вакуоли (*). H&E оцветяване. Скалата представлява 50 µm. (C, D) Представителни изображения на PAS оцветяване на бъбречни тубули на див тип (C) и ctns−/− (D) 18-месечна рибка зебра. Подробности за проксималните тубули с подобни на хиалин капчици (черни стрелки) и цитоплазмени вакуоли (*). PAS оцветяване. Скалата представлява 50 µm. PT: проксимален тубул; DT: дистален тубул.

Фигура 3.Бъбрекцистинови кристали в PTEC от див тип и ctns−/− риба зебра. (A, B) Представителни оцветени в синьо толуидин изображения набъбречнапроксимални тубули при див тип (A) и ctns−/− (B) 18-месечна рибка зебра. Скалата представлява 50 µm. (C,D) Фигури 3C, D показват по-голямо увеличение от Фигура 3A,B. Подробности за бъбречни проксимални тубули с цитоплазмени вакуоли ((D); *), правоъгълни и полиморфни вакуолни пространства ((D); черни върхове на стрелки). (E, F) Представителни ТЕМ изображения на бъбречната проксимална тубула на див тип (E) и ctns−/− 18-месечна рибка зебра (F). (F) Частична загуба на четкови граници на проксималните тубули (PB) и натрупване на правоъгълни и полиморфни вакуоли (*) се наблюдават в проксималните бъбречни тубули на ctns-/- риба зебра. Изгледът с голямо увеличение на правоъгълника в долния десен ъгъл показва полиморфните вакуоли и голяма вакуола с прави мембранни гранични сегменти (права линия). Скалата представлява 5 µm.

2.2.2. Ctns−/− рибка зебра показва гломерулна хипертрофия

Тъй като гломерулните увреждания обикновено следват PTEC лезии, ние оценихме гломерулната хистология на рибките данио ns−/− и наблюдавахме, че ctns−/− рибките зебра показват значително разширяване на капсулата на Bowman (Фигура 4B, E) и гломерулния сноп (Фигура 4B, F), но не и пространството на Bowman (Фигура 4B). , G) в сравнение с див тип мъжка риба зебра (Фигура 4A, E–G). Същото беше потвърдено за гломерулната туфта в женската риба зебра, носеща мутацията ctns−/− (Фигура 4F), и подобна тенденция беше наблюдавана при измервания на пространството на Бауман и капсулата на Боуман (Фигура 4E, G). Не се наблюдава пролиферация на мезангиални клетки или гломерулосклероза. На ТЕМ изображенията не наблюдавахме промени в гломерулната базална мембрана, изтриване на израстъка на крака на подоцитите или необичайно фенестрирани ендотелни клетки в гломерулите на ctns−/− рибка зебра (Фигура 4D) в сравнение с див тип рибка зебра (Фигура 4C).

Фигура 4. Гломерулна морфология при див тип и при ctns−/− риба зебра. (A, B) Представителни изображения на гломерула на див тип (A) и ctns−/− (B) 18-месечна рибка зебра. PAS оцветяване. Скалата представлява 50 µm. (C, D) Представителни TEM изображения на гломерула на див тип ( ctns−/− (D) риба зебра. Скалата представляват 1 µm. (E–G) Количественото определяне на повърхностните площи на капсулата на Bowman (E), гломерулен сноп (F) и пространство на Боуман (G) на див тип и риба зебра при двата пола.

2.2.3. Ctns−/− Дисплей на рибка зебра Повишена апоптоза на ниво PTEC

След това проучихме далицистинозапредизвика клетъчна смърт в нашия модел на риба зебра [10,12]. Извършихме имунооцветяване с разцепена каспаза-3 вбъбречнатъкани на див тип и ctns-/- рибка зебра и ние наблюдавахме значително повишаване на нивата на разцепен протеин каспаза3 в PTEC на ctns-/- рибка зебра (Фигура 5B, D, G) в сравнение с див тип рибка зебра (Фигура 5A, C, Ж) и при двата пола. Експресията на разцепена каспаза -3 присъства главно в клетки, показващи полиморфните цитоплазмени вакуоли (Фигура 5B, D). Не е налице експресия на разцепена каспаза -3 в гломерулите, както при див тип, така и при ctns−/− рибка зебра (Фигура 5E, F).

Фигура 5. Повишена апоптоза в PTECs с вакуоли в ctns−/− риба зебра. (A, B) Представителни изображения на имунооцветяване с разцепена каспаза-3 на тубули от див тип (A) и ctns− стара рибка зебра. Скалата представлява 50 µm. (C, D) Долните панели показват по-голямо увеличение на зоните в кутии в горните панели. Подробности за PTEC с цитоплазмени вакуоли (*). Скалата представлява 50 µm. (E, F) Представителни изображения на имунооцветяване с разцепена каспаза-3 на гломерул на див тип (E) и ctns−/− (F) 18-месечна рибка зебра. Скалата представлява 50 µm. (G) Количественото определяне на положителната зона на оцветяване на тубулната каспаза-3 при див тип и риба зебра при двата пола. Всяка точка представлява една рибка зебра за общо n=3 див тип и ctns−/− 18-месечна рибка зебра. Двупосочен ANOVA с тест за най-малко значима разлика на Fisher (PLSD): ** p < 0,01;="" ***="" р=""><>

2.3. Допълнителни бъбречни прояви

2.3.1. Ctns−/− Рибката зебра показва характерен хипопигментиран петнист модел на кожата

цистинозапациентите често показват преждевременно стареене на кожата, хипопигментация и руса коса [1,13]. Интересното е, че наблюдавахме хипопигментиран петнист модел на кожата на ctns−/− риба зебра, докато рибите от див тип представиха типичния модел на черни ивици. Фенотипът присъства и при двата пола през целия им живот (Фигура 6A, B). За да изследваме разликата в пигментацията, извършихме PAS оцветяване върху кожата на рибката зебра и открихме, че ctns-/- рибката зебра показва променено разпределение на меланиновия слой в епидермиса, което причинява светло петнистия модел (Фигура 6C, D).

Фигура 6. Хипопигментиран петнист модел на кожата при ctns−/− риба зебра. (A, B) Представителни снимки на див тип (A) и ctns−/− (B) 18-месечна рибка зебра. Мащабните ленти представляват 0.5 cm. Черните върхове на стрелките показват различните шарки на кожата. (C, D) PAS-оцветени снимки на епидермиса на див тип (C) и ctns−/− (D) 18-месечна рибка зебра. Черните върхове на стрелките подчертават меланиновия слой. Прекъсването в меланиновия слой присъства в ctns−/− (D), докато отсъства при дивия тип зебра (C). Скалите представляват 50 µ

2.3.2. Ctns−/− Риба зебра показва сперматогенни кисти, обогатени със сперматозоиди

цистинозае известно, че засяга функциите на тестисите, което води до азооспермия и безплодие при пациенти от мъжки пол [14–16]. Произходът на азооспермията все още е неясен, въпреки че е доказано, че сперматогенезата е непокътната на ниво тестиси. За разлика от мъжете, жените с цистиноза са фертилни [17]. В нашия модел на рибка зебра и женските, и мъжките ctns−/− рибки зебра са плодовити. За да проучим дали мутацията на ctns−/− засяга анатомията на тестисите, извършихме PAS оцветяване и открихме повишено натрупване на сперматозоиди в сперматогенните кисти в ctns−/− риба зебра

Фигура 7. Сперматогенни кисти, обогатени със сперматозоиди в ctns−/− риба зебра. (A, B) Представителни H&E оцветени снимки на тестиси на див тип (A) и ctns−/− (B) 18-месечна рибка зебра. Тъмносиньо и закръглено оцветяване представлява сперматозоидите, натрупани в сперматогенните кисти (обозначени със звездички). Скалите представляват 200 µm.

2.3.3. Ctns−/− Женските рибки данио показват намалено производство на яйца

За да изследваме функционалността на репродуктивната система, ние измерихме производството на яйца и процента на оплодените яйца както при дивия тип, така и при ctns−/− рибката зебра. Ние открихме, че ctns−/−женските показват намалено производство на яйца (Фигура 8A) и намален процент на оплодени яйца (Фигура 8B) в сравнение с женските от див тип.

Фигура 8. Производство на яйца и процент на оплодени яйца при див тип и ctns−/− риба зебра. (A) Производството на яйца се измерва като общ брой яйца в див тип и ctns−/− риба зебра 18-месечна риба зебра. Степента на производство на яйца е 1,941 висока при див тип риба зебра в сравнение с ctns−/− 18-месечна риба зебра (коефициент на скорост=1.941); 95 процента CI (долна граница=1.165, горна граница=3.234); Поасонов регресионен анализ; p=0.011. (B) Процентът на оплодените яйца се измерва спрямо общия брой яйца. Шансовете за оплодени яйца са 3,504 високи при дивия тип риба зебра в сравнение с ctns−/− 18-месечна рибка зебра (коефициент на шансове=3.504); 95 процента CI (долна граница=2.005, горна граница=6.124); Логистичен регресионен анализ; p < 0.001;="" n/a:="">

2.3.4. Ctns−/− Дисплей на рибка зебра Намалена локомоторна активност

Тъй като са диагностицирани мускулна загуба и слабост вцистинозапациенти, обикновено от второто десетилетие от живота [1,18], ние оценихме локомоторната активност в нашия модел на риба зебра. Открихме, че ctns−/− риба зебра и от двата пола показват намалена локомоторна активност в сравнение с дивия тип риба зебра, което предполага нарушена мускулна функция (Фигура 9). Въпреки това, хистологичният анализ на скелетната мускулна тъкан не разкрива очевидни аномалии в ctns−/− риба зебра.