Уен-Лан Ли, Джинг-Син Динг, Джинг Бай, Янг Ху, Хуей Сонг, Сян-Минг Сун, Ю-Бин Джи

За контакт: joanna.jia@wecistanche.com

Резюме

LC технологията е признат метод, използван в световен мащаб за оценка на качеството на традиционните китайски лекарства (TCM). Качеството на TCM има пряко влияние върху неговата ефикасност. Следователно, за да се разкрие напълно как TCM упражнява своята ефикасност, на първо място е необходимо да се разбере материалната основа за неговата ефикасност и след това да се контролира качеството на активните съединения. Прилагането на метода на връзката спектър-ефект е от решаващо значение за определяне на основата на фармакологичния материал. Целта на тази статия беше да се изследват основните корелации между химичните профили и естрогенната активност наЦистанче, за разкриване на активните съединения. Химическите профили наЦистанчебяха записани с помощта на HPLC/Q-TOF-MS/MS и естрогенната активност беше определена чрез тест за растеж на матката и МТТ анализ. След това чрез комбиниране на резултатите от бивариантния анализ, анализа на главните компоненти и метода на корелационен анализ на сивото бяха идентифицирани петнадесет активни съединения. Те са 8-епилоганова киселина, салидрозид, сирингалид А 3'- -l-рамнопиранозид, цистанозид А,ехинакозид, цистанозид F, цистанозид B, цистанозид C, османтузид B, актеозид, изоактеозид, тубулозид B, 2'-ацетилактеозид и две неизвестни съединения. Това проучване поставя основата за in vivo изследвания наЦистанчеи за развитието на неговото клинично приложение.

Cistanche може да повиши естрогена, щракнете тук, за да научите повече

Ключови думи:Цистанчеdeserticola; LC/Q-TOF-MS; естрогенна активност; анализ на главните компоненти (PCA); Тест за растеж на матката.

Съкращения

TCM: Традиционна китайска медицина

HPLC/Q-TOF-MS: Високоефективна течна хроматография/квадруполна времепролетна масспектрометрия

BA: двумерен анализ

PCA: анализ на главните компоненти

GCAM: метод за корелационен анализ на сивото

MTT: Трипсин, 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5-дифенилтетразолиумбромид

DMSO: диметилсулфоксид

RPMI1640 Мемориален институт Розуел Парк 1640

1. Въведение

Напоследък TCM става все по-популярен в азиатските и западните страни поради своите стабилни терапевтични ефекти и ниска токсичност в клиниката. В резултат на това е необходимо да се разработят нови видове TCM и да се разберат ефективните състави, използвани по време на тяхното клинично приложение [1-6].

Първо, връзката спектър-ефект се изследва, за да се установи връзката между хроматографския отпечатък и фармакодинамичната ефикасност. След това се използва връзката за търсене на ефективни компоненти в TCM и за формулиране на стандарти за контрол, които да отразяват тяхното вътрешно качество. Връзката спектър-ефект е приложена в много области на изследванията на ТКМ, като материалната основа на единична и комбинирана ТКМ, съвместимост на компонентите, механизъм на обработка, прогноза за фармакологичния ефект и оптимизиране на технологията [7-12]. Връзката спектър-ефект се използва за представяне на нови идеи и методи за изследване на активни вещества, оптимизиране на формули, подобряване на процесите на приготвяне, проследяване и разделяне на целевите съставки и за разработването на нови лекарства от TCM [13-17].

Цистанчесе използва широко за лечение на сексуална дисфункция, запек, простатит и бъбречна недостатъчност. Има широк спектър от биоактивности, включително естрогенен ефект, анти-стареене, антиоксидантно и имунно действие [18-19]. Като цяло, фенилетаноидни гликозиди (като цистанозид А, тубулозид А), лигнани и иридоидни гликозиди се считат за фармакологични съставки и химични маркери за контрол на качеството на Cistanche и неговите продукти [20-21]. Химическите спектри наЦистанчеот различни области бяха записани с помощта на високоефективна течна хроматография (HPLC) [22-23]. В това проучване ние избираме тест за растеж на матката и тест за клетъчна пролиферация MCF7, за да оценим техните естрогенни дейности. Анализът на основните компоненти, двумерният анализ и методите за корелационен анализ на сивото бяха използвани за корелиране на естрогенната активност с отделните компоненти. Това проучване имаше за цел да идентифицира биоактивни съединения на Cistanche, отговорни за in vivo естрогенните ефекти. Проучването поставя основата за задълбочени изследвания наЦистанче.

Всички експериментални процедури бяха прегледани и одобрени от Комитета по етика на животните към Харбинския търговски университет.

Цистанчеdeserticola(cd-20120227-005) е закупен от пазара на наркотици и идентифициран от проф. Zhang Delian (Harbin University of Commerce). Диетилстилбестрол е закупен от HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 и RPMI1640 без фенолно червено бяха закупени от HyClone Company (САЩ). Всички MTT и DMSO бяха закупени от Sigma-Aldrich Co. LLC (Сейнт Луис, САЩ). Клетъчната линия MCF7 на човешкия рак на гърдата е предоставена от Изследователския център на науките за живота и околната среда (Harbin University of Commerce). Използваните стандарти са както следва: актеозид (111530- 200505), ехинакозид (111670-200503) и салидрозид (110736-200628) са получени от Националния институт за контрол на фармацевтични и биологични продукти (Пекин). , Китай). Ацетонитрилът, метанолът и мравчената киселина са MS клас, докато водата е свръхчиста. Други реактиви са с аналитичен клас и са налични в търговската мрежа.

ЕхинакозидвЦистанчеtubulosa има много ефекти

2 Експериментална процедура

2.1 Материали

Agilent 1290 HPLC система, Agilent 6530 Series Quadrupole Time-of-Flight LC/MS (Q-TOF) система и работни станции Chemical HPLC-3D бяха използвани за аналитични химически експерименти и обработка на данни. За приготвянето на проби и стандарти е използвана свръхчиста вода Milli-Q. Допълнителните инструменти включват електронната аналитична везна AR1140 (Ohaus International Ltd), 680 Microplate Reader (Bio-Rad Corporation) и 64R високоскоростна центрофуга (Beckman Coulter Allegra).

Незрели женски мишки Кунминг (около 21 дни от раждането, отбити) с тегло (12 ± 2) g бяха закупени от Центъра за лабораторни животни на базата на националната биологична индустрия на Чанчун (Чанчун, Китай). Мишките бяха настанени в стая с регулирана температура (22 ± 2 градуса) с неограничен достъп до храна и вода. Експериментите с животни бяха започнати след пет дни аклиматизация. Мишките бяха гладни цяла нощ със свободен достъп до вода преди прилагане на тестовите разтвори. Това проучване е проведено в строго съответствие с препоръките в Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни на Националните здравни институти.

2.2 Приготвяне на разтвора на пробата

Проби от Cistanche бяха събрани от десет различни местообитания, а именно Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan и провинция Hubei.

Разтворът (1.0 g/mL) на пробата Cistanche се приготвя в дестилирана вода за орално приложение. Концентрацията на диетилстилбоестрол е 20ug/mL и се използва като положителен контролен разтвор. Разтворът (10 g/mL) на пробата Cistanche се приготвя в 50 процента ацетонитрил. Актеозид, ехинакозид и салидрозид (2.0 mg всеки) се разтварят в 10 mL 50% разтвор на ацетонитрил. Както пробата, така и стандартните разтвори бяха филтрирани с помощта на 0.45-μm филтър преди анализа.

2.3 LC-MS условия

Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm × 150 mm, 5 μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA) беше използван за анализ на пробите. Подвижната фаза се състои от ацетонитрил (A) и 0.2 процента (v/v) воден разтвор на мравчена киселина (B) и се изпомпва при скорост на потока от 0,5 mL/min. Инжекционният обем на всяка проба беше 10 μL. Програмата за градиентно елуиране беше както следва: Подвижната фаза А беше инициирана при 5 процента и увеличена линейно до 23 процента на 35 min. Разтвор А впоследствие се увеличава до 25 процента (35 до 65 минути). След това подвижната фаза А беше намалена до 5 процента за последните 5 минути от цикъла (65 до 70 минути). Температурата на колоната се поддържа при 30 градуса. Хроматограмите се наблюдават при 254 nm. Налягането на атомизиращия газ е 30 psi, а капилярното напрежение е 3,5 kV. Дебитът на сухия газ беше настроен на 8 L/min с температура 30 градуса. Масспектрите бяха записани в обхвата на сканиране от 100- 3,000 Da и бяха в режим на сканиране с отрицателни йони.

2.4 Оценка на пръстови отпечатъци

LC пръстови отпечатъци на пробите, събрани от 10 различни партиди, бяха установени и съпоставени автоматично с помощта на Системата за оценка на сходството за хроматографски пръстови отпечатъци на TCM (версия 2012; Китайски фармакопеен комитет, Пекин, Китай). Освен това референтната карта на хроматограмата беше генерирана с помощта на медианния метод. Освен това беше приложен клъстерен анализ за оценка на качеството на пробите от десет различни местообитания.

2.5 Анализ на главните компоненти (PCA)

PCA е многовариантен статистически метод. Той може да запази достатъчно информация от събирането на данни. В настоящото изследване, характерни пикове от LC хроматограми бяха скринирани допълнително чрез PCA и имаха за цел да идентифицират активни съединения въз основа на връзката спектър-ефект.

2.6 Тест за растеж на матката

Мишките бяха разделени на 12 групи (10 на група). Разтворите на пробите, приготвени от Cistanche, бяха събрани от десет различни местообитания и бяха прилагани два пъти дневно (сутрин и вечер) чрез сонда в доза от 30 g/kg телесно тегло в продължение на четири дни. Празните и положителните контролни групи съдържат равни обеми дестилирана вода и разтвор на диетилстилбоестрол и се прилагат два пъти дневно в продължение на четири дни. На петия ден кръвните проби, съдържащи лекарство, бяха изтеглени от анестезираните мишки. Пробите се центрофугират (5,000 rpm, 10 минути) и супернатантите (серумни проби, съдържащи лекарство) се отделят. Серумните проби, съдържащи лекарство, се инактивират чрез нагряване при 56 градуса във водна баня в продължение на 30 минути и се филтруват през 0.22-μm филтър преди МТТ анализа. Едновременно с това, матките на мишките бяха незабавно изрязани и претеглени, за да се изчислят индексите на теглото на матката. Експериментите с животни започнаха след пет дни аклиматизация. Мишките са гладували цяла нощ със свободен достъп до вода преди прилагането на тестовите разтвори. Настоящото изследване е проведено в строго съответствие с препоръките на Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни на Националните здравни институти. Всички експериментални процедури бяха прегледани и одобрени от Комитета по етика на животните към Харбинския търговски университет. Всички потенциално стресови процедури бяха извършени под анестезия с натриев пентобарбитал.

2.7 МТТ анализ

MCF7 клетките се култивират съвместно с RPMI 1640 без фенолно червено (съдържащо 5 процента CDT-FBS) в продължение на четири дни. Клетките се посяват в 96-плаки с ямки при плътност от 2,000 клетки/ямка. Беше постигната прилепнала култура и след 72 часа култура клетките бяха съвместно култивирани в среда RPMI 1640, съдържаща серумни проби от мишки, третирани с Cistanche. Експериментите бяха проведени в шест повторения. Впоследствие към всяка ямка се добавят 20 μL разтвор на МТТ (5 mg/mL в PBS) и клетките се инкубират в продължение на 4 часа. След отстраняване на средата се добавят 150 uL DMSO, за да се получи формазановият продукт, и плочите се разклащат на тъмно, за да се разтворят напълно. Абсорбцията се измерва при 570 nm с помощта на четец на микроплаки. Скоростта на пролиферация се изчислява като средната стойност на абсорбция на групата със серум, съдържащ лекарство, разделена на средната стойност на абсорбция на празната контролна група (клетки, култивирани съвместно в RPMI 1640 без серум).

2.8 Статистически анализ

T-тестът за сдвоени проби (двустранен) беше използван за идентифициране на статистически значими разлики между стойностите в празната контролна и експерименталната групи. Разликите се считат за значителни при 95% ниво на сигурност (p <>

PCA беше използван за оценка на характерните пикови площи в хроматограмите на пробите от десет различни местообитания. Двувариантният анализ и корелационният анализ на Грей бяха използвани за оценка на корелацията на пиковите области и тяхната естрогенна активност. Корелацията беше изчислена чрез статистика на софтуера за статистика на SPSS (SPSS за Windows 21.0, SPSS Inc., САЩ). Разликите се считат за значителни при ниво на достоверност от 95 процента (двустранно).

Етично одобрение: Проведеното изследване не е свързано с употреба от хора или животни.

Cistanche acteoside имат много функции

3 Резултати и обсъждане

3.1 Клъстерен анализ и оценка на сходството

Относителното стандартно отклонение на времето на задържане и площта на пика на характерните пикове бяха {{0}}.58 и 0.34 процента за точност, 0.52 и {{8} }.31 процента за възпроизводимост и съответно {{10}}.19 и 0.13 процента за стабилност. Тези констатации показват, че нашият LC метод за установяване на пръстови отпечатъци е разумен и надежден. Приликите на хроматограмите на десет проби са по-големи от 0,9. Общите пикове за всички проби не могат да представят напълно характерните съставки на Cistanche, тъй като пикът може да е бил загубен. Следователно броят на съвпадението на пробата беше коригиран от 26 на 20, за да се получи по-точна карта на хроматограмата. Бяха получени общо 26 пика и сумата от техните площи беше по-голяма от 0,8 в сравнение с тези на общата пикова площ в пробата. Следователно заключихме, че тези хроматографски пикове могат ефективно да отразяват основните химични съставки на Cistanche. Резултатите от клъстерния анализ са показани на Фигура 1. Общо десет разнообразни местообитания бяха разделени в три категории, както следва: (A) 2, Guizhou; 3, Цинхай; 4, Чайдаму; 10, Нейменг; 7, Синдзян и 6, Съчуан. (B) 1, Xizang; 8, Нинся и 5, Алашан. (C) 9, Хубей. Тенденцията на клъстерния анализ показа, че местообитанията на лечебните билки са сходни, когато са в долната част на прага. Но с увеличаването на прага климатът и условията на растеж на местообитанията са близки. Това показва, че клъстерният анализ може не само да разграничи добре различните местообитания, но и да отрази афинитетите между тях.

3.2 Идентификация на химичните съставки

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Колкото по-висока е абсолютната стойност на Eigen load, толкова по-голямо е влиянието на съединенията върху естрогенните индекси.

Хроматограмите на Cistanche и стандартните проби бяха сравнени, за да се идентифицират отделните компоненти при същите LC-MS условия. Както е показано в таблица 1, общо 26 съставки бяха идентифицирани въз основа на времето на задържане и MS данните [24-26]. Активните съставки се приемат перорално под формата на смеси, а не на мономери, тъй като традиционната китайска медицина е под формата на смес, за да играе терапевтична роля. Установено е, че едно съединение, след като е индивидуално отделено, не играе роля. Нашата цел е да разкрием съединения, които имат естрогенна активност в известните компоненти на Cistanche [23-30], и следователно не сме избрали ЯМР и други технически средства за валидиране на тяхната идентичност. Пик 1 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 373 (C16H22O10), което е идентично с елементния състав на генипозидова киселина. Това беше подкрепено от загубата на глюкозна част, която даде фрагментен йон с m/z съотношение 211. Пик 2 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 461 (C20H30O12), което беше идентично с елементарния състав на декафеоиллактеозид и се поддържа от загубата на рамнозилова част, образуваща фрагментация с m/z съотношение 315. Пик 4 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 375 (C16H24O10), което е идентично с елементен състав на 8-епилоганова киселина. Загубата на глюкозна част, образуваща фрагментация с m/z съотношение 213, допълнително подкрепя извода. Пик 6 показва преобладаващ депротониран йон със съотношение m/z 607 (C29H36O14), което е идентично с елементния състав на сирингалид A3'- - l-рамнопиранозид.

Загубата на caff част, образувала фрагментен йон с m/z съотношение 445, допълнително подкрепя извода. Пик 8 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 799 (C36H48O20), което е идентично с елементарния състав на цистанозид А. Загубата на Caff част образува фрагментен йон с m/z съотношение 637, допълнително подкрепи заключението. Пик 11 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 487 (C21H28O13), което е идентично с елементния състав на цистанозид F. Това се подкрепя от загубата на рамнозилова част, която дава фрагментен йон с m/z съотношение 341 и загубата на друга caff част образува фрагментен йон с m/z съотношение 179, допълнително подкрепя извода. Пик 12 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 813 (C37H50O20), което е идентично с елементния състав на цистанозид В. Загубата на глюкозна част образува фрагментен йон с m/z съотношение 651, допълнително подкрепи заключението. Пик 13 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 827 (C37H48O21), което е идентично с елементарния състав на тубулозид А. Загубата на рамнозилова част образува фрагментация с m/z съотношение 681, допълнително подкрепи извода. Пик 14 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 637 (C30H38O15), което е идентично с елементния състав на цистанозид С. Загубата на рамнозилова част образува фрагментен йон с m/z съотношение 491, допълнително подкрепи заключението.

Пик 15 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 591 (C29H36O13), което е идентично с елементарния състав на османтузид В. Загубата на рамнозилова част образува фрагментен йон с m/z съотношение 445, допълнително подкрепи извода. Пик 16 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 623 (C29H36O15), което е идентично с елементния състав на актеозид. Загубата на caff част образува фрагментен йон с m/z съотношение 461,допълнително подкрепи заключението. Пик 18 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 623 (C29H36O15), което е идентично с елементния състав на изоактеозид. Загубата на caff част, форпик15 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 591 (C29H36O13), което е идентично с елементарния състав на османтузид В. Загубата на рамнозилова част образува фрагментен йон с m/z съотношение 445, допълнително подкрепи извода. Пик 16 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 623 (C29H36O15), което е идентично с елементния състав на актеозид. Загубата на caff част, образувала фрагментен йон с m/z съотношение 461, допълнително подкрепя извода. Пик 17 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 623 (C29H36O15), което е идентично с елементния състав на цис-актеозид. Загубата на caff част, формира фрагмент ioda фрагментен йон със съотношение m/z 461, допълнително подкрепя извода. Пик 21 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 653 (C30H38O16), което е идентично с елементарния състав на кампнеозид Ⅰ.

Загубата на caff част образува фрагментен йон със съотношение m/z 491, а загубата на друга рамнозилова част образува фрагментен йон с m/z съотношение 345, което допълнително подкрепя извода. Пик 22 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 665 (C31H38O16), което е идентично с елементния състав на тубулозид В. Загубата на CH3CO част образува фрагментен йон с m/z съотношение 623, и загубата на друга caff част образува фрагментен йон с m/z съотношение 461, което допълнително подкрепя извода. Пик 23 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 639 (C29H36O16), което е идентично с елементния състав на кампнеозида. Загубата на рамнозилова част, образуваща фрагментен йон с m/z съотношение 493, допълнително подкрепя извода. Пик 24 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 665 (C31H38O16), което е идентично с елементния състав на 2'-ацетилактеозид. Загубата на Ac част образува фрагментен йон със съотношение m/z 623, а загубата на друга caff част образува фрагментен йон с m/z съотношение 461, което допълнително подкрепя извода. Пик 25 показва преобладаващ депротониран йон с m/z съотношение 445 (C20H30O11), което е идентично с елементния състав на цистанозид G. Загубата на рамнозилова част образува фрагментен йон с m/z съотношение 299, допълнително подкрепи заключението. Структурите на съединенията са изброени на фигура 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Тези пикове са следните: 9, 12, 14 и 15. Следователно, ехинакозид, цистанозид В, османтузид В и актеозид, съответстващи на общо 4 пика, са избрани като представителни променливи за естрогенна активност (Фигура 3).

.

3.4 Определяне на естрогенна активност

Беше изчислено съотношението на мокрото тегло на матката към телесното тегло на всяка мишка (Фигура 4). Животните, изложени на Cistanche от девет местообитания, показват значителна естрогенна активност чрез увеличаване на теглото на матката си в сравнение с мишките в празната контролна група. Фигура 4 допълнително показва скоростта на пролиферация на MCF7 клетки, третирани със серум на мишки, третирани с Cistanche. Клетките, третирани със серуми от мишки, на които е приложен Cistanche от десет местообитания, показват значително по-висок растеж в сравнение с клетките, лишени от третиране.

3.5 Двумерен анализ

В настоящото проучване наблюдавахме, че теглото на матката на незрели женски мишки Kunming се увеличава и пролиферацията на човешки ракови клетки на гърдата MCF7 се насърчава. Тези открития потвърждават естрогенната активност на Cistanche. Фигура 5 показва маточните индекси и скоростите на клетъчна пролиферация на MCF7 на тези съставки. Корелационният коефициент на Pearson се използва за изчисляване на относителните пикови площи, които съответстват на естрогенната активност на пробите. Коефициентите на корелация, по-високи от 0.3, се считат за значими (p < 0.05),="" докато="" коефициентите="" на="" корелация,="" по-високи="" от="" 0.5,="" се="" считат="" за="" силно="" значими="" (p="">< 0,01).="" въз="" основа="" на="" резултатите="" е="" доказано,="" че="" cistanche="" притежава="" естрогенна="">

Общо девет съединения значително корелират с увеличаването на теглото на матката (p < {{0}}.05),="" докато="" десет="" съединения="" значително="" корелират="" с="" клетъчната="" пролиферация="" на="" mcf7="" (p="">< 0,05).="" съединения,="" които="" значително="" корелират="" с="" теглото="" на="" матката="" и="" клетъчната="" пролиферация,="" са="" 8-епилоганова="" киселина,="" салидрозид,="" сирингалид="" а3'-="" -="" l-рамнопиранозид,="" цистанозид="" а,="" цистанозид="" в,="" цистанозид="" с,="" османтузид="" в,="" актеозид,="" изоактеозид,="" тубулозид="" в,="" 2'-ацетилактеозид="" и="" две="" неизвестни="" съединения="" (фигура="" 5).="" тези="" тринадесет="" съединения="" проявяват="" естрогенна="">

3.6 Метод на корелационен анализ на Грей

Фигура 6 показва относителната корелация на характеристичните пикове на 26 съединения с маточните индекси, а Фигура 7 показва относителната корелация на характеристичните пикове на 26 съединения с техните скорости на клетъчна пролиферация. Общо три съединения показват най-висока корелация с индексите на матката, а именно 8-епилоганова киселина, цистанозид F и актеозид (Фигура 6, в низходящ ред); като има предвид, че шестте съединения, които показват най-висока корелация с клетъчната пролиферация на MCF7, са ехинакозид, цистанозид F, цистанозид В, османтузид В, изоактеозид и тубулозид В (Фигура 7, в низходящ ред). Относителните корелации на ехинакозид, османтузид B, актеозид и изоактеозид са по-високи от 0.5.

3.7 Оптимизиране на условията на LC-MS

За да се получи по-добра хроматограма, се сравняват метанол и ацетонитрил. Накрая, комбинацията от воден разтвор на мравчена киселина (0.2 процента, v/v) - ацетонитрил беше най-добрата подвижна фаза за разделяне. В обхвата на 200-400nm сканиране с пълна дължина на вълната, 254nm беше избрано като оптимално. В допълнение параметрите на MS също бяха подобрени. Режимът на сканиране с отрицателни йони е избран, защото подобрява стойностите на реакцията на повечето съставки в Cistanche.

4. Заключение

Технологията LC-Q-TOF-MS е използвана за идентифициране на естрогенни активни съставки на Cistanche. Настоящото проучване илюстрира, че 8-епилоганова киселина, салидрозид, сирингалид A3'- -l-рамнопиранозид, цистанозид A, ехинакозид, цистанозид F, цистанозид B, цистанозид C, османтузид B, актеозид, изоактеозид, тубулозид B, 2'-ацетилактеозид и две неизвестни съединения са основните активни съставки на Cistanche. Тези констатации обаче изискват допълнителни проучвания за изследване на in vivo ефектите и механизма на действие на съставките.

цистанчеактеозидът има много функции, като например стимулиране на имунната система

Благодарности:

Този проект беше подкрепен от Националната природонаучна фондация на Китай (№ 81073015), Научната фондация за природата на провинция Хейлундзян (ZD2017014) и плана за обучение на млади иновативни таланти на колежа в провинция Хейлундзян (UNPYSCT-2017209) . Авторите декларират, че няма конфликт на интереси по отношение на публикуването на тази статия.

Препратки

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Фитохимия, фармакология , контрол на качеството и бъдещи изследвания на Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: Преглед, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Приложена интегрирана и глобална псевдонасочена метаболомична стратегия за скрининг за маркери за контрол на качеството на цитрусови TCMs, Anal. Биоанал. Chem., 2017, 409 (20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM " Стратегия, приложена към анализ на качеството на инжекции с традиционна китайска медицина: Използване на инжекция KuDieZi като казус, Молекули., 2017, 22(7). PII: E1237.

[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Скрининг на биоактивни маркери за контрол на качеството на капещи хапчета QiShenYiQi въз основа на връзката между свръхвисоката ефективност пръстови отпечатъци с течна хроматография и съдова защитна активност, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Приложение на многовариантен статистически анализ и мислене в контрола на качеството на китайската медицина, Zhongguo. Zhong. Яо. За. Zhi., 2014, 39 (21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Dai J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, данни за HPLC/qTOF-MS ориентирани характеристични компоненти комплект и хемометричен анализ за холистичен контрол на качеството на сложни TCM препарати: Niuhuang Shangqing хапче като пример, J. Pharm. Biomed. анал., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, Висока отрицателна прогнозна стойност, ниско разпространение и спектърен ефект: Внимание при тълкуването, Clin. Гастроентерол. Hepatol., 2017, 15 (9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Скрининг на хепатотоксични компоненти в Euodia rutaecarpa от UHPLC-QTOF/MS въз основа на връзката спектър-токсичност, Молекули., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Скрининг и идентифициране на хепатотоксичен компонент в Evodia rutaecarpa въз основа на връзката спектър-ефект и UPLC-Q-TOFMS, Biomed . Chromatogr., 2016, 30 (12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Screening Test Performance for Амнестично леко когнитивно увреждане: Какви са клиничните последици?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48 (2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Взаимоотношенията спектър-ефект като систематичен подход към изследванията на традиционната китайска медицина: текущо състояние и бъдещи перспективи, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Връзки спектър-ефект между UPLC пръстови отпечатъци и биоактивности на сурови вторични корени на Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) и неговите три преработени продукта върху митохондриалния растеж, съчетан с каноничен корелационен анализ, J. Ethnopharmacol., 2014, 153 (3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Връзки спектър-ефект между химически пръстови отпечатъци и антибактериални ефекти на Lonicerae Japonicae Flos и Lonicerae Flos Base върху UPLC и микрокалориметрия, отпред. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Ефектът на спектъра при тестове за прогнозиране на риска, скрининг и диагностика, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Проследяване на нови хемостатични съединения от продукти на нагряване на общи флавоноиди във Flos Sophorae по спектър -ефектни връзки и колонна хроматография, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Изследване на връзките спектър-ефект на Da-Huang-Fu- Zi-Tang при плъхове чрез UHPLC-ESI-Q-TOF-MS метод, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Проучване на връзката на ефекта на спектъра на rhizoma Rhei, cortex Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus и тяхната формула, J. ​​Chromatogr. Sci., 2013, 51 (6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Антиостеопоротична активност на ехинакозид при овариектомирани плъхове, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Антихипергликемични и хиполипидемични ефекти на Cistanche tubulosa при DB/DB мишки с диабет тип 2, J. Ethnopharmacol., 2013, 150 (3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., Ацилирани фенилетаноидни гликозиди , ехинакозид и актеозид от Cistanche tubulosa, подобряват глюкозния толеранс при мишки, J. Nat. Med., 2014, 68 (3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Фенилетаноидни гликозиди с противовъзпалителни действия от стъблата на Cistanche deserticola, култивирани в пустинята Тарим, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Количествен анализ на Cistanches Herba с помощта на високоефективна течна хроматография, съчетана с откриване на диодна матрица и високо- масспектрометрия с резолюция, комбинирана с хемометрични методи, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Структурна характеристика и идентификация на фенилетаноидни гликозиди от Cistanches deserticola YC Ma от UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Антипролиферативна активност на фенилпропаноиди, изолирани от Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31 (10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Едновременно определяне на компоненти с широка полярност и диапазони на съдържание в Cistanche tubulosa, използвайки серийно свързана хроматография с хидрофилно взаимодействие с обратна фаза-тандемна масспектрометрия, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Приложение на метаболомика, базирана на 1H NMR, за разграничаване на различни части и разработване на нов работен процес за обработка на Cistanche deserticola, Acta. Pharm. грях. Б., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Проучвания върху съставките и биоактивността на пресни Cistanche tubulosa, Ph.D. дисертация, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Китай, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Метаболитният профил на актеозид, произведен от човешки или плъхове чревни бактерии или чревен ензим in vitro, използван UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Систематично характеризиране на метаболитите на ехинакозид и актеозид от Cistanche tubulosa в плазма, жлъчка, урина и изпражнения на плъхове въз основа на UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016 (9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Метаболитен начин за изследване на свързани препятствия, причиняващи лоша бионаличност при перорално доставяне на изоактеозид при плъхове, използвайки ултрависоко ефективна течна хроматография/ квадруполна времепролетна тандемна масспектрометрия, Rapid. Общ. Mass. Spectrom., 2017 (4), 371-380.