Селективна цитотоксичност на растителното вещество актеозид срещу туморни клетки и неговите механични прозрения
Mar 14, 2022
Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com
Кристина Хеймониди и др
АБСТРАКТ
Естествените продукти се характеризират с изключително структурно разнообразие и по този начин те предлагат уникален източник за идентифициране на нови противотуморни агенти. Тук съобщаваме, че растителното веществоактеозидизолирането чрез усъвършенствани фитохимични методи от листата на Lippia citriodora показва повишена цитотоксичност срещу метастатични туморни клетки; действа в синергия с различни цитотоксични агенти и сенсибилизира химиорезистентните ракови клетки.Актеозидне е токсичен във физиологичния клетъчен контекст, докато повишава окислителното натоварване, повлиява активността на протеостатичните модули и потиска матричните металопротеинази в туморните клетъчни линии. Интраперитонеално или орално (чрез питейна вода) приложение на актеозид в миши модел на меланома повишава антиоксидантните реакции в туморите; все пак само интраперитонеалното доставяне потиска растежа на тумора и индуцира противотуморно-реактивни имунни отговори. Мас-спектрометричните идентификационни/количествени анализи разкриха, че интраперитонеалното доставяне наактеозидводи до значително по-висока концентрация на съединението в плазмата и туморите на третираните мишки в сравнение с оралното приложение, което предполага, че неговият in vivo антитуморен ефект зависи от начина на приложение и постигнатата концентрация в тумора. И накрая, изследванията на молекулярното моделиране и анализите на ензимната активност показват товаактеозидинхибира протеин киназа С. В заключение актеозидът е обещаващ като химическо скеле за разработването на нови антитуморни средства.
Ключови думи:Актеозид, Рак, Естествено съединение, Оксидативен стрес, Протеостаза, Имуномодулация
1. Въведение
Карциногенезата се характеризира с дерегулация на няколко клетъчни сигнални пътища и е свързана с повишен клетъчен окислителен, репликативен, метаболитен, генотоксичен и протеотоксичен стрес [1]. За да се адаптират и преодолеят тези фенотипове на стрес, злокачествените клетки регулират нагоре (освен онкогените) няколко неонкогенни пътя, целящи или да потиснат, или (поне) да облекчат продължаващия стрес. Сред различните неонкогенни пътища, за които е установено, че често се регулират нагоре по време на туморогенезата, са модулите на протеостазната мрежа (PN) заедно с клетъчните антиоксидантни отговори [2,3].
Ключови компоненти на PN са двете основни машини за разграждане, а именно пътят на автофагия-лизозома (ALP) и пътят на убиквитин-протеазома (UPP), заедно с мрежата от клетъчни молекулярни шаперони. ALP участва главно в разграждането на протеинови агрегати и увредени органели [4], докато UPP разгражда нормалните краткотрайни протеини и непоправимите неправилно нагънати или разгънати протеини [5–8]. 26 сеукариотната протеазома се състои от 19S регулаторни частици (RP) и 20 Score частици (CP); последният се състои от четири подредени хептамерни пръстена (два от -тип, заобикалящи два от -тип), които образуват структура, подобна на варел. Химотрипсин-подобната (CT-L), трипсин-подобната (TL) и каспазо-подобната (CL) протеазомна пептидазна активност се намират съответно в 5, 2 и 1 протеазомни субединици [6]. Демонстрираната клинична ефикасност на протеазомните инхибитори Bortezomib (Velcade®; наричан още PS-341) и Carfifilzomib срещу различни хематологични злокачествени заболявания [9] предостави „доказателство за концепцията“ за насочване към UPP като обещаваща стратегия за лечение на рак. Сложната мрежа от клетъчни антиоксидантни защитни пътища, които често се регулират нагоре по време на карциногенезата [3,10], включва антиоксидантни ензими, както и няколко транскрипционни фактора, които мобилизират цитопротективни геномни отговори; те включват forkhead box O (Foxo) и еритроидния 2-свързан фактор (Nrf-2). Nrf-2 е централен в защитата на клетките срещу оксидативно и/или ксенобиотично увреждане, тъй като стимулира експресията на антиоксиданти и фаза II гени [11-13].
Ние и други наскоро предложихме, че насочването към тези туморни зависимости (т.е. протеостатични модули и/или пътища на антиоксидантен отговор) или повишаване на клетъчните нива на ROS в контекста на трансформиран генотип предлага потенциален терапевтичен прозорец за селективно убиване на туморни клетки [3]. ,14]; в подкрепа на това се съобщава за селективно убиване на ракови клетки от малка молекула, която повишава клетъчните нива на ROS [2]. Очаква се, че комбинаторните подходи, включително и активирането на анти-туморно-реактивни имунни отговори [15] вероятно ще увеличат максимално терапевтичния прозорец, предлаган чрез инхибиране на PN и антиоксидантни отговори и/или чрез повишаване на клетъчните нива на ROS.
Естествените продукти (екстракти или чисти съединения) (NPs) от различни източници (растения, морски организми, микроорганизми и т.н.) се изследват за тяхната способност да действат като противотуморни агенти поради тяхното изключително структурно разнообразие и химическа сложност, както и защото те действат плейотропно, модулирайки няколко клетъчни сигнални пътища [16]. Съобщава се, че NP активират противовъзпалителни, антитуморни и/или антиметастатични отговори [16,17] и също така избягват резистентността към множество лекарства [18,19]. Сред тях фенолните съединения (включително фенилетаноидни гликозиди) са привлекли значителен интерес поради докладваната им роля в превенцията и/или лечението на различни човешки заболявания.
Актеозидът, наричан също употреба или вербаскозид [20], е фенилетаноиден гликозид, изолиран от много двусемеделни растения. Съобщава се, че актеозидът проявява някои интересни биологични дейности, включително антиоксидантни, противовъзпалителни и регулиращи клетъчната апоптоза свойства [21,22]. Независимо от това, неговата потенциална антитуморна активност не е разгледана. Тук съобщаваме, че актеозидът показва повишена цитотоксичност срещу ракови клетки на бозайници без видими токсични ефекти във физиологичния клетъчен контекст. Освен това, актеозидът потиска растежа на меланомния тумор в модела на мишка Vivo чрез (наред с други) активиране на антитуморно-реактивни имунни отговори.
2. Материали и методи
2.1. Растителен материал и извличане
изсушени листа на Lippia citriodora (Lamiaceae) (4,5 kg) са закупени от местния пазар в Атина, Гърция. Листата се пулверизират и се екстрахират чрез механично разбъркване в продължение на 12 часа с метанол (2 × 20 L). Метаноловият екстракт се изпарява до сухо и се промива със смес от CH2CI2/MeOH 98/2 (15 L). Неразтворимият остатък се отделя и изсушава, като се получава зелено-жълт прах (450 g).
2.2. Пречистване на актеозид и UPLC-HRMS анализ
Част (10 g) от гореспоменатия остатък се подлага на противотокова хроматография, използвайки апарат за бърза центробежна разделителна хроматография (FCPC) (Kromaton, Франция); смес от EtOAc/EtOH/H2O в съотношение 5/0.5/4.5 се използва като двуфазна система от разтворители. Събраните фракции се подлагат на тънкослойна хроматография; след това хроматограмите се наблюдават под UV лампа (254 и 365 nm) и се визуализират чрез пръскане с метанол ванилин сулфат, последвано от нагряване за две минути. Общо 2,1 g актеозид (чистота по-голяма или равна на 90 процента) се изолира чрез гореспоменатия процес. Идентифицирането на актеозид се извършва чрез спектри на ядрено-магнитен резонанс (NMR) и масспектрометрия (MS), докато неговата чистота се установява чрез UPLC-MS и NMR анализ; за подробности вижте Suppl. Материали и методи.
2.3. Клетъчни линии
Човешки белодробни ембрионални фибробласти (IMR90 клетки) заедно с миши клетъчни линии B16.F1, B16.F10, YAC-1 и WEHI-164 бяха получени от Американската колекция от тъканни култури (ATCC). U2 OS и Sa OS човешки остеосаркомни клетъчни линии бяха любезно дарени от проф. V. Gorgoulis (Училище по медицина, Национален и Каподистриански университет в Атина, Гърция), докато KH OS остеосаркомните клетки и химиорезистентните остеосаркомни клетъчни линии [23] бяха дарение на д-р Е. Гонос (Национална гръцка изследователска фондация, Гърция). Раковите клетъчни линии на мишка C5N и A5 принадлежат към многоетапен модел на карциногенеза на кожата на мишка [24,25] и са дарени от проф. A. Balmain (Comprehensive Cancer Center, University of California, USA). Условията на култивиране на използваните клетъчни линии са докладвани в Suppl. Материали и методи.
полза отцистанче актеозид
2.4. Мъжки модел на мишка с меланом
Мишки C57BL/6 (25–30 g тегло, на възраст 6–8 седмици) бяха получени от Hellenic Pasteur Institute и настанени при контролирана температура (22 градуса) и фотопериод (12 часа светлина:12 часа тъмно ) със свободен достъп до вода и храна. Мишките бяха подкожно инокулирани с 105 B16.F1 меланомни клетки (в 100 μL PBS) и бяха разпределени на случаен принцип в 3 групи (n=5/група). Когато туморите станат осезаеми (ден 11), мишките получиха актеозид по два начина; или интраперитонеално (IP) (1 mg/мишка, разредена в 200 μL PBS; общо 6 дози, приложени през ден) или перорално чрез питейна вода (OR) (2,5 mg/мишка; общо 13 дози за 13 последователни дни). На контролните мишки се прилага PBS. Растежът на тумора се записва на всеки 2 дни чрез измерване на голямата и малката ос на образуваните тумори с дигитален дебеломер. Измерванията се трансформират в обем на тумора, като се използва формулата: обем на тумора (cm3)=голяма ос × второстепенна ос2 × 0,5. На 28-ия ден животните бяха евтаназирани чрез цервикална дислокация и далаците бяха асептично отстранени. Експериментът се повтаря три пъти с подобни констатации.
Спленоцитите бяха изолирани от индивидуално хомогенизирани далаци и незабавно тествани за тяхната цитотоксичност спрямо B16.F1, YAC-1 и WEHI-164 клетъчни мишени. Цитотоксичността беше оценена въз основа на откриването на експозиция на CD107 върху клетъчната повърхност в резултат на дегранулация на ефекторни клетки. Спленоцити (105 клетки/ямка) се култивират съвместно с мишени в 96-ямкови микроплаки с U дъно при съотношение ефектор към мишена (E:T) 100:1, при 37 градуса в 5 процента CO2. FITC-конюгирани анти-CD107a и анти-CD107b моноклонални антитела (25 μL/mL) и монензин (6 μL/mL; всички от BD Biosciences) бяха добавени във всяка ямка. Клетките се събират 6 часа по-късно и се анализират с помощта на FACSCanto II поточен цитометър. Успоредно с това, туморите бяха изрязани и обработени за анализи надолу по веригата, както е описано в Suppl. Материали и методи.
цистанче актеозид
