Едноклетъчна транскриптомика разкрива нарушения на бъбречния филтър клетъчно-клетъчни взаимодействия след ранно и селективно увреждане на подоцитите
Jul 01, 2024
Хронични бъбречни заболявания (ХБЗ)все още засягат 700 милиона души по светаспецфиc терапиилипсват.1 многобъбречните заболявания произхождат от in theгломерул, нафиединица за филтрация на бъбрека. Гломерулът се състои от (i) подоцити, специализирани постмитотични клетки със сложни израстъци на краката, които се впръскват между пръстите, образувайки диафрагми с прорези и се увиват около гломерулни капиляри; (ii) ендотелни клетки, които лежат срещу подоцити върху споделена гломерулна базална мембрана (GBM); (iii) мезангиални клетки, които образуват матрица, която осигурява структурна опора за гломерула; и (iv) париетални епителни клетки (PECs), които покриват капсулата Bowman.2 Увреждането на подоцитите, по-специално, води до много силно разпространени, прогресивни бъбречни заболявания, включително диабетно бъбречно заболяване (DKD), фокална сегментна гломерулосклероза (FSGS) и нефротичен синдром (както идиопатичен, така и генетичен). Каноничният модел на нараняване води до загуба на интердигитиращи подоцитни израстъци на стъпалото, известно като изтриване на израстъка на стъпалото, причинено от пренареждане на актиновия цитоскелет. Това заличаване води до разрушаване на цепната диафрагма, физическата бариера, която функционира катофиlter, последвано от отделяне на подоцитите или смърт.3,4 От друга страна, в допълнение към непокътнатите подоцити, образуването и поддържането нагломерулнафифилтрационна бариераизискватинтрагломерулна комуникация, строго контролирана от серия автокринни и паракринни сигнални механизми. Например, васкуларен ендотелен растежен фактор А (VEGFA) е сигнал за просървивалност за ендотелни клетки, секретирани от подоцити, а произхождащ от тромбоцитите растежен фактор В (PDGFB) е сигнал за просървивалност за мезангиални клетки, секретирани от ендотелни клетки.5 Нарушаването на тези клетъчно-клетъчни взаимодействия често се наблюдава при множество гломерулни заболявания, включително FSGS и DKD.6 Следователно идентифицирането на най-ранните разрушителни промени в гломерула може да предложи нови цели и възможност за оптимизиране на терапевтичния успех залечение на бъбречни заболявания.
НОВИ БИЛКИ ЗАЛЕЧЕНИЕ НА БЪБРЕЧНИ БОЛЕСТИ
Подкрепен от Националния институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания на NIH, грантове DK103658, DK099465 и DK095045 (AG).интрагломерулна комуникация, строго контролирана от серия автокринни и паракринни сигнални механизми. Например, васкуларен ендотелен растежен фактор А (VEGFA) е сигнал за преживяемост за ендотелни клетки, секретирани от подоцити, а произхождащ от тромбоцитите растежен фактор B (PDGFB) е сигнал за просървивалност за мезангиални клетки, секретирани от ендотелни клетки.5 Разрушаването на тези клетки- клетъчните взаимодействия често се наблюдават при множество гломерулни заболявания, включително FSGS и DKD.6 Следователно идентифицирането на най-ранните разрушителни промени в гломерула може да предложи нови цели и възможност за оптимизиране на терапевтичния успех при лечението на бъбречни заболявания
Едноклетъчното РНК секвениране (scRNAseq) революционизира способността за изследване на отделни клетъчни типове на сложни тъкани и клетъчни състояния след специфични смущения.7,8 Последните проучвания на scRNAseq в бъбреците дадоха представа за транскрипционните профили на видовете бъбречни клетки при здрави мишки и човешки проби, както и при някои болестни състояния, включително DKD и лупусен нефрит.9e12 Въпреки това, подробните изследвания на състоянията на гломерулните клетки са ограничени от малкия брой клетки, налични за анализ. Освен това, най-ранните специфични за клетъчния тип промени, които настъпват във всички гломерулни клетки при увреждане на подоцитите, не са наблюдавани и тепърва ще бъдат дефинирани.
Подоцитна аблация чрез подоцит-специфична индуцируема делеция на есенциален ендогенен протеин, CTCF, води до прогресивно протеинурично бъбречно заболяване и ХБН.13 В исторически план миши модели с ХБН са генерирани чрез индуциране на бъбречно увреждане от екзогенни токсини или хирургични интервенции, неоптимални системи, които не отговарят на рекапитулиране на последователни механистични промени. Делецията на CTCF, съществена ендогенна молекула, води до бърза загуба на подоцити, тежка прогресивна албуминурия, промени в костния минерален метаболизъм, бъбречна недостатъчност и преждевременна смърт.13 Моделът на индуцируема подоцит-специфична делеция на CTCF (iCTCFpod / ) предоставя уникалната възможност за изследване промени в интрагломерулните клетъчно-клетъчни взаимодействия като следствие от индуцирано увреждане на подоцитите. Подоцитната CTCF експресия е неоткриваема в най-ранния момент, на 1 седмица от доксициклин-медиирана индукция на Cre в iCTCFpod/мишки.13 Значимата и прогресивна загуба на подоцити, измерена чрез хистологичен анализ, започва на 2 седмици след индукцията на Cre. В настоящото проучване беше извършен подробен анализ на 1-седмичната времева точка, за да се идентифицират най-ранните промени в интрагломерулните клетъчно-клетъчни взаимодействия, предизвикани от увреждане на подоцитите, което в крайна сметка води до ХБН.
Материали и методи
Грижа за животните
Това проучване е одобрено от Комитета за грижа и използване на животните в Бригам и женската болница, Харвардско медицинско училище. Всички проучвания върху животни са извършени в съответствие с насоките, установени и одобрени от Комитета за грижа и използване на животните в Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School. iCrepod-Ctcfwt/fl мишки бяха генерирани, както е описано по-горе13 и инбредирани за генериране на iCrepod-Ctcffl/fl (iCTCFfl/fL) и iCrepod-Ctcfwt/wt [див тип (WT)] мишки. В това изследване са използвани както мъжки, така и женски мишки. Доксициклин (4 g/L) (Sigma D9891) се прилага непрекъснато в питейна вода, която съдържа захароза (50 g/L) (VWR BDH0308) както на iCTCFfl/fL (генерира iCTCFpod / мишки), така и на WT контролни мишки от котило (6 до 8 седмица на възраст в началото на употребата на доксициклин), за да стимулира експресията на Cre специално в подоцитите.
Гломерулно обогатяване от цял бъбрек
iCTCFpod/ и WT мишки бяха умъртвени след 1 седмица лечение с доксициклин и бъбреците бяха бързо дисектирани и промити с ледено студен балансиран солев разтвор на Hanks (каталожен номер 14170112, Thermo Scientific, Waltham, MA). След отстраняване на бъбречните капсули, гломерулите се обогатяват при 4 °C, като се използва техниката на пресяване14 с 180- mm, 75- mm и 53- mm сита. Обогатените с гломерули фракции, събрани от 53- mm сито, се изплакват с ледено студен 1 балансиран солев разтвор на Ханкс и се поставят върху лед.
Приготвяне на едноклетъчни суспензии
Подготовка на библиотеката и секвениране на една клетка
Единичните клетки бяха обработени чрез 10 Chromium 30Single Cell Platform, използвайки Chromium Single Cell 30Library, Gel Bead и Chip Kits (10 Genomics, Pleas anton, CA), следвайки протокола на производителя. Накратко, 10 000 клетки бяха добавени към всеки канал на чип, за да бъдат разделени на гелни перли в емулсия в инструмента Chromium, последвано от клетъчен лизис и баркодирана обратна транскрипция на РНК в капчиците. Разрушаването на емулсията беше последвано от усилване, фрагментиране и добавяне на адаптер и индекс на пробата. Библиотеките бяха обединени и секвенирани на Illumina HiSeq.
Верижна реакция на хибридизация
Всички реагенти на хибридизационна верижна реакция (HCR) v3 (сонди, фиби и буфери) са закупени от Molecular Technologies (Пасадена, Калифорния). Тънки срезове от тъкан (10 m) бяха монтирани в 24-плаки със стъклено дъно на гнезда (каталожен номер 82050-898, VWR, Radnor, PA), покрити с 1:5{{38} } разреждане на (3-аминопропил)триетоксисилан (каталожен номер 440140, Sigma-Aldrich). Следните разтвори бяха добавени към тъканта: 10% формалин (каталожен номер 100503- 120, VWR) за 15 минути, две промивания с 1 PBS (каталожен номер AM9625, Thermo Fisher Scientific), ледено студен 70% EtOH при 20°С C за 2 часа (до цяла нощ), три промивания с 5 физиологичен разтвор на натриев цитрат с 0,2% Tween-20 (SSCT) (каталожен номер 15557044, Thermo Fisher Scientific), хибридизационен буфер (Molecular Technologies) за 10 минути, сонди в хибридизиращ буфер за една нощ, четири промивания на промивен буфер (Molecular Technologies) за 15 минути, три промивания на 5 SSCT, буфер за амплификация (Molecular Technologies) за 10 минути и три промивания на 15 минути с 5 SSCT (1:10,{{31 }} DAPI, каталожен номер TCA2412-5MG, VWR) при второто пране. Фибите се денатурират топлинно в буфер за усилване за една нощ. Пробите се съхраняват и изобразяват в 5 SSCT. Изобразяването беше извършено на конфокален въртящ се диск (Yokogawa W1 на Nikon Eclipse Ti), работещ с NIS-elements AR софтуер. Анализът и обработката на изображението бяха извършени на софтуер ImageJ Fiji версия 2.1.0/1.53c (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij).
Обработка на данни и контрол на качеството
A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >75% от клетките, класифицирани като дублети с висока степен на сигурност, бяха премахнати от по-нататъшен анализ. Останалите клетки, класифицирани като дублети с висока степен на сигурност, също бяха премахнати от по-нататъшен анализ. Анализът включва намаляване на броя на клетките, за да се отчете тази разлика. Например, ако имаше по-малко WT клетки в даден клетъчен тип, произволна проба от iCTCF клетки, равна на броя на WT клетките, беше използвана за анализ на диференциалната експресия.
Неконтролирано клъстериране и намаляване на размерността
Настройките по подразбиране в Seurat R package16 версия 3.0 бяха използвани за нормализиране (NormalizeData) на броя на генните експресии, идентифициране на променливи гени (FindVariableGenes), намиране на интеграционни котви (FindIntegrationAnchors) и интегриране на пробите (IntegrateData) . Възникна нежелана вариация поради броя на UMI и съотношението на четенията, картографирани към митохондриални гени (ScaleData). Намаляването на размерността беше извършено с помощта на анализи на главните компоненти (RunPCA) върху силно променливите гени. Функцията PCELbowPlot() беше използвана за разграничаване на основните компоненти за по-нататъшен анализ. За клъстериране на всички клетки, първите 40 основни компонента обхващат достатъчно цялата дисперсия. Молекулярно различни клъстери бяха идентифицирани с помощта на параметрите по подразбиране (FindClusters) и резолюция 0.4 (FindNeighbors). Данните бяха обработени и мащабирани, както е описано по-горе, след подгрупа на гломерулни клетки. Общо 30 основни компонента бяха използвани за групиране надолу по веригата при разделителна способност 0,3 (FindNeighbors).
Класификация на типа клетка
Обогатените с клъстери или маркерни гени бяха изчислени с помощта на теста за сума на ранга на Wilcoxon (FindAllMarkers) за диференциална експресия на гени в клетките на клъстера спрямо всички други клетки и избиране на тези гени, които преминават границата на коригираната P стойност (честота на фалшиво откриване) на {{1 }}.05 като представител на клъстера. Идентичността на клъстера беше определена чрез сравняване на управлявани от данни гени със списък от подбрани в литературата гени за типове зрели бъбречни клетки.
Диференциален анализ на генната експресия
Анализът на диференциалната експресия по двойки в Seurat (FindMarkers) беше използван с прага за промяна на логаритмичното сгъване, зададен на {{0}}.01 и параметри по подразбиране за анализиране на диференциалната експресия между iCTCFpod / и WT клетки в конкретен клъстер. В рамките на FindMarkers ident.1 беше зададен на специфични за клъстер iCTCFpod / клетки, а ident.2 беше зададен на съответните специфични за клъстер WT клетки. Гени с коригирано P <0.05 се считат за значими.
Анализ на свръхпредставяне
Анализът на свръхпредставяне беше използван, за да се определи дали някои известни биологични функции или процеси са били свръхпредставени или обогатени в списъка(ите) на диференциално експресирани гени.17 R пакетът clusterProfiler,18 по-специално функцията enrichGO, беше използван за анализа на свръхпредставянето. Използвани са параметри по подразбиране, с изключение на ont Z BP, pvaluecutoff Z 0.25 и qvaluecutoff Z 0.25. След това беше използван пакетът R enrichplot (GitHub, https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot, последно достъпен на 30 август 2021 г.), по-специално функцията emaplot, за визуализиране на резултатите от обогатяването чрез начертаване на най-добрите термини на обогатяване.
Анализ на лиганден рецептор
iTALK19 беше използван за картографиране на рецептори към лиганди, които бяха различно експресирани в iCTCFpod / подоцити. По-конкретно, rawParse се използва за изчисляване на средната експресия на всеки ген, като се използват мащабирани данни от Seurat. FindLR, използващ тип данни Z meancount, беше използван за идентифициране на двойки лиганд и рецептор. Двойките лиганд и рецептор, представляващи интерес, бяха начертани с помощта на параметрите по подразбиране на LRPlot. Дебелината на линиите показва относителната средна експресия на лиганда, а размерът на върха на стрелката показва относителната средна експресия на рецептора.
Анализ на NicheNet
R пакетът NicheNet20 беше използван за предсказване на лигандрецепторни взаимодействия, които биха могли да предизвикат промени в генната експресия в интересуващия ни тип клетка. Всички подоцитни клъстери и всички ендотелни клъстери бяха комбинирани за този анализ. Всички параметри по подразбиране бяха използвани с изключение на задаването на по-нисък граничен праг от 0.11 за подготовка_лиганд_мишена_визуализация. HCR обработка на изображения и количествено определяне Изображенията бяха обработени с помощта на софтуер ImageJ2 (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij). За ImageJ файлове е използвана версия 2.1.0/1.53c (http://imagej.net/ Сътрудници (последен достъп на 2 август 2020 г.). Необработените ND2 файлове са извадени от фона с помощта на метода Rolling Ball (търкалящ се Z 50 плъзгащ стек) След това се проектират средни интензитети на Z-stack изображения и каналите на изображенията се разделят и записват отделно CellProfiler версия 3.1.5 (Broad Institute of MIT и Harvard, Cambridge, MA)21 се използва за клетъчна сегментация въз основа на интензитета на флуоресценцията. на DAPI канал и за измерване на интегрирания интензитет на флуоресценция в останалите канали бяха оценени за статистически анализ всички гломерули от 40 изображения.
Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/телефон:+86 15292862950
Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
НАТИСНЕТЕ ТУК, ЗА ДА ВЗЕМЕТЕ НАТУРАЛЕН ОРГАНИЧЕН ЕКСТРАКТ ОТ ЦИСТАНША С 25% ЕХИНАКОЗИД И 9% АКТЕОЗИД ЗА БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ
