Малки, но мощни - екзозоми, нови междуклетъчни посланици в невродегенерацията, част 1

Просто резюме:

Екзозомите са биологични наночастици, наскоро разпознати като междуклетъчни пратеници. Те съдържат товар от липиди, протеини и РНК. Те могат да прехвърлят съдържанието си не само в клетки в близост, но и в клетки на разстояние.

Екзозомите са новооткрит инструмент за междуклетъчна комуникация, който може да освобождава малки и деликатни везикули към околните клетки, доставяйки някои протеини, сигнални вещества и други вещества до околните клетки. Тези вещества могат да помогнат на клетките да променят състоянието си и дори да повлияят на растежа, развитието, метаболизма и други аспекти на други клетки. През последните години проучванията показват, че екзозомите играят важна роля във функционирането на човешкия мозък, особено в поддържането и подобряването на паметта.

Първо, екзозомите могат да насърчат предаването на сигнал между невроните. Предаването на информация между невроните е едно от необходимите условия за нормалната работа на нервната система, а екзозомите играят ролята на пратеници, които могат да направят предаването на информация между невроните по-плавно, като по този начин подобряват мозъчното познание и памет.

Второ, екзозомите също могат да регулират метаболизма на невроните. В процеса на невроните, произвеждащи и освобождаващи екзозоми, участват голям брой метаболитни процеси, което насърчава баланса и регулирането на клетъчния метаболизъм. Тези процеси могат не само да подобрят способността на невроните, но и да помогнат за премахване на метаболитни отпадъци и вредни молекули и да поддържат мозъчните клетки здрави.

И накрая, екзозомите също могат да помогнат на невроните да поправят щетите. Много протеини и нуклеинови киселини, пренасяни от екзозомите, са полезни за растежа, възстановяването и регенерацията на клетките и могат да насърчат възстановяването и регенерацията на невроните, като по този начин подобряват способността за оцеляване на мозъчните клетки и укрепват центровете на паметта и когнитивните способности.

В обобщение, съществува тясна връзка между екзозомите и паметта. Можем да променим паметта на децата, като започнем с диета. Активното насочване на диетичната структура на децата и яденето на повече храни, богати на полезни съставки като мастни киселини, протеини и витамини, може да насърчи производството и освобождаването на екзозоми, като по този начин помага на децата да подобрят своите способности за учене и памет. На децата също могат да бъдат предоставени някои игри и упражнения за трениране на мозъка, за да предизвикат и упражнят мисленето си, да стимулират потенциала на екзозомите и да играят по-добра роля. Може да се види, че трябва да подобрим паметта и Cistanche може значително да подобри паметта, защото Cistanche е традиционен китайски лекарствен материал с много уникални ефекти, един от които е да подобри паметта. Ефикасността на Cistanche идва от различните активни съставки, които съдържа, включително танинова киселина, полизахариди, флавоноидни гликозиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по много начини.

Кликнете върху Know, за да подобрите краткосрочната памет

Тази уникална способност им дава възможност да модулират физиологията на реципиентните клетки. В мозъка екзозомите играят роля при невродегенеративни заболявания като болестта на Алцхаймер, болестта на Паркинсон и амиотрофичната латерална склероза.

Резюме:

Екзозомите с ендозомален произход са един клас извънклетъчни везикули, които са важни в междуклетъчната комуникация. Екзозомите се освобождават от всички клетки в нашето тяло и техният товар, състоящ се от липиди, протеини и нуклеинови киселини, има отпечатък, отразяващ техния родителски произход.

Екзозомният товар има силата да модулира физиологията на реципиентните клетки в близост до освобождаващите клетки или клетките от разстояние. Използването на потенциала на екзозомите зависи от чистотата на подготовката на екзозомите.

Следователно са разработени много методи за изолиране и ние предоставяме кратко резюме на няколко метода. Въпреки изолацията, наложена от кръвно-мозъчната бариера, клетките в ЦНС не са имунизирани срещу екзозомни интрузивни влияния. Както невроните, така и глиарите освобождават екзозоми, често по начин, зависим от активността.

Предоставено е кратко описание на екзозомите, освободени от различни клетки в мозъка, и тяхната роля в поддържането на хомеостазата на ЦНС. Отличителният белег на няколко невродегенеративни заболявания е натрупването на протеинови агрегати. Скорошни проучвания предполагат ролята на междуклетъчния комуникатор на екзозомите в разпространението на неправилно нагънати протеини, казвайки разпространението на патология.

В този преглед обсъждаме потенциалния принос на екзозомите в прогресирането на болестта на Алцхаймер, болестта на Паркинсон и амиотрофичната латерална склероза.

Разбирането на приноса на екзозомите в патогенезата на невродегенерацията отваря полето за използване на екзозоми като терапевтични средства за доставяне на лекарства в мозъка, тъй като екзозомите преминават през кръвно-мозъчната бариера.

Ключови думи: екзозоми; неврони; глиални клетки; централна нервна система (ЦНС); невродегенеративни заболявания;болест на Алцхаймер; Болест на Паркинсон; амиотрофична латерална склероза.

1. Въведение и историческа перспектива

Междуклетъчната комуникация е от голям интерес за ембрионалното развитие, регенерацията/подмяната на епитела, гаметогенезата и поддържането на хомеостазата.

Няколко механизма на клетъчно-клетъчна комуникация като ендоцитоза/екзоцитоза и поглъщане на изпъкнали цитоплазмени мехурчета бяха идентифицирани с помощта на ултраструктурни и биохимични изследвания [1–3]. Друг играч, извънклетъчните везикули, беше идентифициран, но тяхната роля в междуклетъчната комуникация не беше оценена веднага [4].

Екстрацелуларните везикули бяха открити случайно по време на изследване на освобождаването на ензими, свързани с плазмената мембрана, екто-АТФаза и екто-50-нуклеотидаза в среда за клетъчна култура. През 1981 г. колегите на Tramsand култивираха нормални и неопластични клетъчни линии от миши и човешки произход в среда без серум, тъй като беше известно, че серумът има каталитична активност на АТФаза и 50-нуклеотидаза.

След отстраняването на плаващите клетки и остатъците, кондиционираната среда се центрофугира при скорост 310,000× g за 90 минути в ротор Spinco Ti-70 и пелетите се изследват под електронен микроскоп. Бяха открити две популации от обвити с извънклетъчна мембрана везикули, една със среден диаметър между 500 и 1000 nm и втора, по-малка популация с диаметър ~40 nm.

Тези везикули, първоначално описани като „ексфолирани везикули“ от авторите, съдържат както 50-50-нуклеотидазна, така и АТФазна ензимна активност. В допълнение, ексфолираните везикули съдържат РНК и фосфолипиди, които са различни от родителските клетки и съответно родителската плазмена мембрана.

Инкубирането на ексфолирани везикули от C6 глиомни клетки с 32P-предварително маркирани невробластомни клетки стимулира дефосфорилиране на невробластомни протеини със съпътстващо освобождаване на свободен радиомаркиран фосфор (32P).

Тези данни установяват, че ексфолираните везикули не са просто носители на клетъчни отпадъци (ензими), но имат физиологична функция. Трам и колеги измислиха термина екзозоми, за да опишат „ексфолираните везикули“ [5] (вижте преглед на статия от [6] за историята на извънклетъчните везикули преди 1981 г.). Няколко години по-късно две изследователски групи изследват независимо съдбата на трансфериновия рецептор в ретикулоцитите чрез електронна микроскопия [7–9].

Узряващите ретикулоцити не се нуждаят от трансферин, така че те губят трансферинови рецептори. И двете групи наблюдават, че култивираните ретикулоцити освобождават малки везикули с ~50 nm в диаметър в извънклетъчното пространство.

Тези малки везикули съдържат неразградени трансферинови рецептори. През 1987 г. Джонстън и сътрудници използваха термина екзозоми, за да опишат малки везикули, съдържащи трансферинови рецептори [10]. След тези първи години потенциалът на екзозомите беше реализиран като нови междуклетъчни пратеници, които могат да модулират физиологията на целевите клетки.

Интересното е, че генезисът на екзозомите започва с ендоцитоза (процес, идентифициран през 1883 г.; прегледан от [3]) в клетките и освобождаването на екзозоми във вътреклетъчното пространство използва процеса на екзоцитоза. От първоначалното им откритие сега знаем, че екзозомите са подтип на извънклетъчните везикули от ендоцитен произход с размер от 40–160 nm в диаметър [11].

Проучванията с маркери демонстрират, че макромолекулите са ендоцитирани в покрити с четина (т.е. покрити с клатрин) инвагинации или ями на клетъчната повърхност. Тези инвагинации в крайна сметка се отделят от плазмената мембрана и се откриват в цитоплазмата.

След като загубят влакна (т.е. клатрин), ендоцитозните покрити везикули стават гладки и се сливат с ранни ендозоми или за бързо рециклиране обратно към клетъчната повърхност (рециклиране на ендозоми на Фигура 1) [12] или подлежат на узряване, за да образуват късни ендозоми.

Ранните и късните ендозоми действат като "центрове за сортиране" за подходящо насочване на съдържанието им: (i) за ретрограден транспорт към транс-Голджи мрежата (т.е. извличане от ендозома към TGN) [13,14]; (ii) към лизозоми за разграждане на макромолекули до прости продукти за повторна употреба в клетката [15,16]; и/или (iii) за рециклиране към клетъчната повърхност чрез мултивезикуларни тела [17].

По време на узряването на ранните ендозоми в късните ендозоми, вътрешната ендозома мембрана претърпява инвагинация, което води до образуването на интралуминални везикули (сега обозначени като екзозоми). Специфични макромолекули като цитозолни протеини, нуклеинови киселини и липиди се сортират в развиващи се екзозоми.

Късните ендозоми, пълни с екзозоми, се идентифицират като мултивезикуларни тела, които мигрират към плазмената мембрана. При сливане с плазмената мембрана мултивезикуларните тела освобождават екзозоми в извънклетъчното пространство чрез процеса на екзоцитоза (Фигура 1) [18,19]. Голяма подгрупа протеини, които се набират последователно, играят решаваща роля в процеса на ендоцитоза към ранните ендозоми, съзряването на ендозоми до късните ендозоми и тяхната последваща вътреклетъчна съдба (прегледано от [17,18,20]).

Значението на тези протеини се подчертава от тяхната загуба и/или мутация(и), които причиняват различни заболявания. Например, Strumpellin и SWIP протеините са част от комплекса WASH, който участва в полимеризацията на актин, както и в ендозомното делене и сортиране. Мутациите в гена на Strumpellin причиняват наследствена спастична параплегия, характеризираща се с дегенерация на моторни неврони [21].

Една точкова мутация (Pro1019Arg) в протеина SWIP дестабилизира комплекса WASH. Дестабилизираният WASH комплекс инхибира ендолизозомния трафик, причинявайки слепване на ендозоми. Дефектният ендозомален трафик влияе върху когнитивните способности и функцията на моторните неврони, като симптомите са описани като несиндромна умствена изостаналост [22,23].

В цитоплазмата екзозомите произхождат от ендозоми, използвайки ендозомните сортиращи комплекси, необходими за транспорт (ESCRT), известен също като ESCRT-зависим механизъм на екзозомна биогенеза (прегледано от [18,20]).

Две групи независимо съобщават за липидно-медиирана биогенеза на екзозоми, независим от ESCRT механизъм. Два липида, идентифицирани в тези проучвания, са бис(моноацилглицеро)фосфат/лизобифосфатидова киселина (BMP/LBPA) и церамид [29,30].

Rab31 е друг ESCRT-независим механизъм за биогенеза на екзозома в цитоплазмата. Активирането на Rab31 стимулира образуването на интралуминални везикули [31]. Има и друг механизъм, който в момента е недостатъчно обсъждан и проучен.

Този механизъм се основава на ултраструктурни наблюдения, направени в края на 1950-те до 1970-те години, които показват, че клетъчните ядра могат да бъдат място за произход на мултивезикуларни тела, пълни с малки везикули. Малките везикули, описани в тези изследвания, може би са екзозоми, но терминът екзозома не е измислен по това време. Kilarski и Jasinski наблюдават процес, наречен nucleoblebbing или ядрени екструзии в клетките на плавателния мехур на рибата костур, Perca fluviatilis L. (Фигура 2a) [24] със съдържание, подобно на nucleolarkaryoplasm [32].

Тези автори отбелязват, че ядреното образуване на мехурчета може да бъде стимулирано чрез отстраняване на газ от плавателния мехур на рибата костур [24]. Процесът на ядрено бълбукане изглежда има заслуги като място на произход на екзозоми, обогатени с нуклеинови киселини и/или рибонуклеопротеин.

Ядрените мехурчета са пълни с малки везикули, които възникват от единично сгъване на вътрешната мембрана на ядрените мехурчета (Фигура 2b), процес, подобен на образуването на интралуминални везикули в ендозоми. Ядрените мехурчета, пълни с „малки везикули“, в крайна сметка се отделят от ядрата, за да станат част от цитоплазмата (Фигура 2в).

Киларски и Ясински наричат ​​ядрените мехурчета мултивезикуларни тела в своя ръкопис поради липса на по-добра терминология. По невнимание тези автори може да са били прави, тъй като последващи проучвания съобщават за наличието на мултивезикуларни тела в ядрата на клетките [33]. Ядрените мехурчета, пълни с малки везикули, имат морфология, подобна на мултивезикуларните тела, произхождащи от ендозоми в цитоплазмата (фигури 1 и 2).

Поради сходството на ядрените мултивезикуларни тела с вирусния нуклеокапсид, изследователите съсредоточиха вниманието си върху вирусологията и феноменът на ядреното бълбукане и неговата клетъчна функция останаха недостатъчно проучени [34].

Независимо от начина на биогенеза, екзозомите са съставени от алипиден двоен слой и съдържат макромолекулно съдържание, състоящо се от липиди, протеини и нуклеинови киселини.

Някои от макромолекулите са общи за екзозомите, произхождащи от всички клетки и следователно се класифицират като екзозомни маркери и се използват като потвърждаващ инструмент за разграничаване на екзозомите от други извънклетъчни везикули. Уникалните макромолекули, присъстващи в екзозомите, често отразяват техния родителски произход и следователно е вероятно да бъдат определени като биомаркер(и).

Всички клетки освобождават екзозоми в извънклетъчното пространство. От извънклетъчното пространство екзозомите намират своя път в различни биологични течности и достигат до клетките локално и на разстояние. Клетките, култивирани in vitro, освобождават своите екзозоми в хранителна среда. Непрекъснатото освобождаване на екзозоми в извънклетъчното пространство прави хранителната среда и биологичните течности богат източник за изолиране на екзозоми.

Екзозомите съдържат значително количество кодиращи и некодиращи РНК, двойноверижни геномни ДНК фрагменти и митохондриална ДНК. Трамс и колеги бяха първите, които описаха наличието на РНК в "ексфолирани везикули", смес от екзозоми и микровезикули.

Те установиха, че "ексфолираните везикули или екзозоми" съдържат 5% РНК [5]. Валади и колегите му бяха първите, които систематично анализираха РНК, опаковани в екзозоми. Екзозомалните РНК включват транслируеми мРНК и микроРНК (miRs) [35].

МикроРНК са клас некодиращи РНК (ncRNAs). Те са с дължина ~22 нуклеотида и регулират генната експресия на посттранскрипционно ниво чрез свързване към 30-нетранслирани области на техните целеви информационни РНК [36]. Интересното е, че някои miRNAs, обогатени с екзозоми, не се откриват в родителските клетки, което предполага селективна система за сортиране/опаковане на РНК по време на биогенезата на екзозомите [35,37].

За разлика от клетките, екзозомите съдържат малко или никаква рибозомна РНК, но съдържат тРНК фрагменти [38]. Сортирането на РНК в екзозоми зависи от (1) свързан с РНК-индуциран заглушаващ комплекс (RISC) протеин, (2) мотиви на РНК последователност и водещи протеини, (3) нуклеотидни добавки в 30-ия край на miPHK, (4) клетъчна наличност на miPHK и (5) керамид [39,40].

Ние вярваме, че ядреното образуване е друг клетъчен процес, който позволява диференциално сортиране на РНК, РНК-протеинови комплекси и геномна ДНК в екзозоми. Има няколко причини за тази гледна точка: (1) съдържанието на „интралуминалните везикули“ е подобно на нуклеоларната кариоплазма [32]. „везикулите“ в ядрените мултивезикуларни тела (MVB II) са обогатени с РНК, киселинни и основни протеини и следователно авторите смятат, че „ интралуминални везикули“ като място за синтез на РНК в допълнение към тонуклеола [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10 kbin екзозоми [43–47].

Между другото, геномна ДНК е открита само в екзозоми, получени от ракови клетъчни линии, а не от нормални клетки [47]. Раковите клетки имат анормален хроматин поради пренареждане/транслокация на хроматин и вероятно плоидност [48], която може да причини фрагментация на геномна ДНК в ядрата на раковите клетки. Тези ДНК фрагменти могат лесно да бъдат включени в MVB тип II (и екзозоми), развиващи се в ядрата. (3) Режимът на биогенеза на „малки везикули“ в ядрените мехурчета, описан от Kilarski и Jasinski [24], е подобен на образуването на интралуминални везикули в късните ендозоми в цитоплазмата.

Ние силно вярваме, че присъствието на геномна ДНК в екзозомите е патологично и следователно присъствието му в екзозомите може да се използва като диагностичен инструмент за развитието на анормални (или ракови) клетки в тялото. (4) Зависещото от активността увеличение на броя на екзозомите, освободени от клетките [49], е сравнимо с газовите клетки, които показват повишено ядрено образуване при отстраняване на газ от плавателния мехур на риба костур [24].

Съвсем наскоро митохондриални протеини и ДНК бяха открити в плазмените екзозоми на някои пациенти с рак и тяхното присъствие се свързва с агресивността на рака [50,51].

Разпадането на митохондриите често се наблюдава в дегенериращи клетки [52,53]. Митохондриалните кристи, освободени от дегенериращите митохондрии, могат да бъдат интернализирани от мултивезикуларни тела и в крайна сметка са пакетирани в екзозоми.

Това схващане се подкрепя от ултраструктурни изображения на човешки лимфобластоидни клетки и лумена на ацини на простатата на бабуин, които имат „микровезикули“ (или екзозоми), получени от разпадането на кристите на митохондриите [54].

Въз основа на горната дискусия и подкрепящи експериментални доказателства, ние предлагаме, че хетерогенната природа на екзозомите произхожда от биогенезата на мултивезикуларни тела и свързаните екзозоми на различни субклетъчни места, а не изцяло в цитоплазмата според настоящите ни убеждения. Нашето предложение може да обясни хетерогенността на екзозомите както и несъответствие между теоретичните изчисления и експерименталните данни за броя на малките РНК или протеинови молекули, съдържащи се в една екзозома, пречистена от серум [55].

Въз основа на теоретични изчисления, използващи среден размер на екзозома, Ли и колеги прогнозираха, че всяка екзозома ще побере приблизително 70–25,000 малки РНК или протеинови молекули.

Въпреки това, техните експериментални данни показват наличието на една молекула РНК на екзозома, пречистена от серум [55]. Нашата хипотеза налага по-нататъшно изследване на ядрените образувания, ядрените мултивезикуларни тела и биогенезата на РНК/рибонуклеопротеин-съдържащи екзозоми в ядрени мултивезикуларни тела. Липидите са важна част от екзозомните мембрани и се разпределят асиметрично между двете екзозомни мембранни листове. Липидният състав се различава между мембраната на родителската клетка и мембраната на екзозомата.

Като цяло липидите, обогатени с екзозомемембрани, са сфингомиелин, церамид, холестерол и богати на холестерол липидни микродомени, ганглиозид GM3, денаситени липиди и фосфатидилсерин [56–58]. Екзозомалните протеини се състоят от тези, които са общи за повечето екзозоми, както и специфични за уникални протеини към определена родителска клетка.

Съдържанието на протеини на всички екзозоми обикновено е обогатено за насочване и сливане на протеини като тетраспанини, интегрини, шаперонпротеини, напр. протеини на топлинен шок (Hsp60, Hsp70 и Hsp90), малки HSP мембранни трафик протеини, Rab протеини, ARF GTPases, анексини и протеини, участващи в образуването на мултивезикуларни тела като ALIX и TSG101 [59].

По-нови проучвания предполагат наличието на РНК-свързващи протеини, които образуват РНК-протеинови комплекси в екзозомите [38]. Няколко клетъчни процеса, които осигуряват качването на протеини в екзозоми, са (1) ESCRT механизми за протеини с определени пост-транслационни модификации като убиквитиниране, Wnt-стимулирано метилиране на аргинин, окисление, фосфорилиране, гликозилиране и цитрулиниране; (2) аутофагия, медиирана от шаперон (CMA), която разчита на взаимодействието между сроден с топлинен шок 71 kDa протеин (HSC70) и протеини с KFERQ мотив.

След свързване на HSC70 към протеини с KFERQ мотив, протеините се насочват към мултивезикуларни тела. Шаперон-медиираната аутофагия обикновено работи за разграждането на протеини в лизозомите. По-нови данни предполагат, че CMA играе роля в освобождаването на екзозоми и медиираното от екзозоми разпространение на протеинови агрегати при някои невродегенеративни заболявания [60–63].

Има експоненциално увеличение на изследванията на екзозомите от 90-те години на миналия век и са генерирани много данни за екзозомния товар. Създадени са бази данни, за да осигурят компендиум от екзозомален товар, преди да стане твърде трудно да се управляват големи набори от данни.

Повторяемостта на публикуваните данни за екзозомите е друга причина, тъй като повечето лаборатории използват вариации на различни методи, разработени за изолиране на екзозоми. Например, Vesiclepedia е ръчно подготвен компендиум от молекулярен товар (липид, РНК и протеин), идентифициран в различни класове извънклетъчни везикули [64]. Vesiclepedia предоставя ценен ресурс за изследователите.

Базата данни Vesiclepedia е публично достъпна и позволява на потребителите да правят заявки и да изтеглят екзозомни данни за товари въз основа на въведени от потребителя критерии за търсене. EV pedia, Exocarta, ExoRbase и EV miRNA са допълнителни бази данни, които каталогизират екзозомални протеини и РНК [64].

Базите данни се управляват от анотации на общността. Данните, съхранявани в тези бази данни, се получават чрез изолиране на екзозоми, като се използват различни техники за разделяне, които не са включени в базата данни.

Следователно съдържанието на екзозомален товар може да се различава в зависимост от използвания метод на изолиране, което води до известна степен на неяснота в докладваните резултати. За да се подобри експерименталната възпроизводимост и прозрачност, беше разработен набор от инструменти с отворен код EV-TRACK. EV-TRACK включва данни за подготовка на екзозома и характеризиране на екзозома [65].

Ключова характеристика на EV-TRACK е EV-METRIC, която представя отчитането на експерименталните параметри като процент от изпълнените компоненти от списък от девет [66]. Тези компоненти бяха решени от консорциума EVTRACK и бяха счетени за необходими за недвусмислена интерпретация на данни и възпроизвеждане на експериментални данни. По този начин EV-METRIC е проектиран да помага на изследователите и рецензентите при предоставянето на цялостен преглед на данните.

2. Съвременни методи за изолиране на екзозоми

Екзозомите представляват богат ресурс за откриване на биомаркери и за нови терапевтични стратегии, включително регенеративна медицина. От първостепенно значение за успеха на тези цели е изолирането на чисти екзозоми чрез възпроизводим метод.

Изолирането на функционално компетентни екзозоми е особено критично за потенциални терапевтични приложения. Екзозомите са пречистени от различни биологични течности като кръв, плазма, цереброспинална течност, слюнка, урина и мляко. Всяка биологична течност има различни физични и химични характеристики, които трябва да се вземат предвид преди изолирането на екзозома.

В някои случаи може да са необходими специфични предпазни мерки за изолиране на екзозома. Крайното приложение на пречистени екзозоми е друг определящ фактор, който влияе върху метода за изолиране на екзозоми.

Към днешна дата са разработени няколко метода за изолиране на екзозоми и някои от тях се основават на характеристики на екзозоми като техния размер, плътност, повърхностен заряд и протеини, свързани с повърхността на екзозомите (Фигура 3) [67].

Някои от използваните в момента методи за изолиране на екзозоми са изброени в таблица 1. Повечето от тях не са самостоятелни методи и изискват предварителни стъпки за обработка след вземане на проби. По-долу са накратко обсъдени основните методи.

Фигура 3. Често използвани методи за изолиране на екзозоми и техните приложения надолу по веригата. Няколко метода, разработени до момента за изолиране на екзозоми, се основават на тяхната плаваща плътност, схема 1, 13 и 1,19 g/mL, методът на ултрацентрофугиране (UC) беше допълнително усъвършенстван до изолирайте чисти препарати от екзозоми въз основа на тяхната плаваща плътност чрез изопикнично ултрацентрофугиране с градиент на плътност на захароза или йодиксанол (DG).

За да се премахне високото съдържание на протеин в протеинурията, методът на ултрацентрофугиране се комбинира с хроматография с изключване на размера (SEC). Времевите ограничения, свързани с метода на ултрацентрофугиране, доведоха до разработването на метода на филтриране (UF).

Преминаването на разредени проби като хранителна среда и урина през нано- или микромембранен концентратор позволява пречистване на екзозоми. Запушването на мембраната и лошото възстановяване на екзозомален протеин направиха този метод непопулярен за приложения надолу по веригата, като изолиране на РНК и приложения с висока производителност.

Друг метод, разработен за изолиране на екзозоми от много разредена биологична течност, е хидростатична филтрационна диализа (HFD *) в комбинация с центрофугиране. При метода HFD пробата се диализира през диализна мембрана с граница от 1000 kDa молекулно тегло под хидростатично налягане, което позволява нежеланите макромолекули да бъдат отстранени от пробата и екзозомите се възстановяват чрез центрофугиране.

Методът за утаяване на екзозоми, базиран на разтворимост или диспергируемост и агрегиране, е разработен за обработка на няколко проби едновременно. Търговските комплекти за пречистване на екзозоми се основават на тази стратегия.

При този метод орасцитите в урината се смесват с полиетилен гликол (PEG) 6000 или в комбинация с протамин (плюс PEG35 000) и се инкубират или една нощ, или 1 час върху лед.

Получената мътна смес се центрофугира за възстановяване на екзозоми, които се използват за анализи на РНК и протеини надолу по веригата. Други реагенти, използвани за утаяване на екзозоми, са (1) 0.1M натриев ацетат pH 4,75 (метод на изсоляване) (NaAc), (2) 4-кратен обем студен ацетон (–20 ◦C) ( PRotein Organic Solvent Precipitation и съкратено PROSPR), (3) и смес от PEG и разтвор на декстран (до 1,5%) (двуфазен метод, който позволява отделяне на протеини от екзозоми).

Идентифицирането на екзозомни повърхностни протеини доведе до разработването на методи, базирани на имуноафинитетно улавяне, използващи антитела срещу екзозомни повърхностни протеини като Tim4, анексин, EpCAM, общ екзозомен повърхностен протеин, CD63 и протеини на топлинен шок (афинитетно взаимодействие). Афинитетът към лектин (който се свързва с гликопротеини на повърхността на екзозомите) и хепарин (който се свързва с хепаран сулфат протеогликани на повърхността на екзозомата) беше използван за разработване на методи за изолиране на екзозоми.

Няколко платформи като магнитни перли, силно порести монолитни силициеви микро-накрайници, повърхност на пластмасови плочи, целулозни филтри, мембранни афинитетни филтри, агарозен сорбент и микрофлуидни устройства бяха използвани за базирани на афинитет методи за пречистване на екзозоми и те имат различни предимства за използването им в диагностични, прогностични, като системи за доставяне на лекарства и откриване и анализи на форексозомален товар.

Адаптирано с разрешение от Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Изолиране на извънклетъчни везикули: Общи методологии и най-нови тенденции. Biomed Res Int. 2018 30 януари; 2018: 8545347. doi:10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Авторско право © 2022 Мария Ю. Коношенко и др.

Това е статия с отворен достъп, разпространявана под лиценза Creative Commons Attribution, който позволява неограничено използване, разпространение и възпроизвеждане във всеки носител, при условие че оригиналното произведение е правилно цитирано [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com