Авторадиографско изображение с [ 18F]-натриев флуорид на нефрокалциноза в бъбреците на донора и експлантирани бъбречни алографти

ali.ma@wecistanche.com

Стан Бенджаменс 1,2*, Инес Ф.Антунес2, Ян-Луук Хилебрандс3, Мелани Райринк4, Мариан Л.С.Бултуис3, Стефан П. Бергер5, Сирил Мьорс1, Мартин Х. де Борст5, Ример ХЯ Сларт2,6 и РобъртА. Pol1

Нефрокалцинозаприсъства в до 43 процента отбъбрекалографт биопсии на една година след трансплантацията и е свързано с по-ниска функция на присадката и лоша преживяемост на присадката. Изследвахме [18F]-натриев флуорид ([18F]-NaF) изобразяване на микрокалцификации в донорни бъбреци (n= 7) и експлантиранибъбрекалографти (n= 13). Три µm вградени в парафин серийни срезове бяха използвани за хистологична оценка на калцификация (Alizarin Red; Von Kossa оцветяване) и ex-vivo [18F]-NaF авторадиография. Изображенията бяха обединени, за да се оцени дали областите на микрокалцификация съответстват на областите на поемане на [18F]-NaF. Въз основа на хистологични анализи, тубулоинтерстициални и гломерулни микрокалцификации присъстват съответно в 19/20 и 7/20 проби. С помощта на авторадиография беше установено поглъщане на [18F]-NaF в 19/20 проби, със значително по-голяма активност на маркера вбъбрекалографт в сравнение с бъбречни проби от починал донор (p {{0}}.019). Оцветяването с червено ализарин на активни микрокалцификации показва добра корелация (rho на Spearman от 0.81, p <0.001), а="" оцветяването="" на="" von="" kossa="" на="" консолидирани="" калцификации="" демонстрира="" значителна,="" но="" слаба="" корелация="" (0.62,="" p="0.003)" с="" [18f]-naf="" активност.="" тази="" корелация="" между="" ex-vivo="" усвояването="" на="" [18f]-naf="" и="" хистологично="" доказаните="" микрокалцификации="" е="" първата="" стъпка="" към="" образен="" метод="" за="" идентифициране="" на="" микрокалцификации="" в="">нефрокалциноза. Това може да доведе до по-добро разбиране на етиологията на микрокалцификатите и тяхното въздействие върху функцията на бъбречната трансплантация.

Кликнете, за да получите ползи от екстракта от цистанче при бъбречни заболявания

Нефрокалциноза, дефиниран като паренхимно и тубулно отлагане на калциев оксалат (CaOx) или калциев фосфат (CaPhos), е важен фактор за намаляването на функцията на присадката следбъбректрансплантация1–3. Отлагането на CaOx и CaPhos се дължи на високи нива на серумен оксалат, серумен калций и серумен фосфат при пациенти с хроничнабъбрекзаболяване и/или хиперпаратироидизъм4,5. Честотата нанефрокалциноза, въз основа на биопсии на алографт на бъбрек, е 6 процента на 6 месеца, 25–43 процента на една година и до 79 процента на 10-години след товабъбректрансплантация5–7. Проучвания, фокусирани върху биопсии на алографт на бъбрек в рамките на една година след трансплантацията, демонстрират връзка между ранното наличие на калциеви отлагания и както влошената функция на присадката, така и лошата преживяемост на присадката4,8,9. Въпреки това остава неясно дали тези микрокалцификации играят активна роля в дисфункцията на алографта или са просто индикатори за дерегулиран минерален метаболизъм.

Към днешна дата,бъбрекалографтните биопсии са единственият диагностичен метод за оценка на микрокалцификациите след трансплантация. Неинвазивен и надежден диагностичен подход би позволил повтарящи се измервания, улеснявайки проследяването на калцификациите във времето и интервенционни проучвания с потенциално подобряване на резултатите за функцията на присадката и оцеляването на присадката след бъбречна трансплантация10.

Позитронно-емисионна томография/компютърна томография (PET/CT) изобразяване с [18F]-натриев флуорид ([18F]-NaF) се използва в клиничната практика и експериментални изследвания като модалност за изобразяване на скелета и съдовете11-15. Докато надеждната визуализация на съдовите микрокалцификации е възпрепятствана от CT изображения, резултатите от ex-vivo [18F]-NaF microPET изображения корелират добре с хистологично доказани микрокалцификации в човешки и животински съдови проби16,17. Нещо повече, резултатите от няколко проспективни клинични проучвания показват, че ранната васкуларна [18F]-NaF активност е свързана добре както с микрокалцификатите, открити чрез компютърна томография, така и по-интересното, увеличаването на размера на тези калцификации 18-20.

Тук представяме резултатите от авторадиографско проучване за доказателство на концепцията за ex-vivo използване на [18F]-NaF изображения нанефрокалцинозав донорскибъбреции трансплантирани бъбречни алографти като диагностичен подход за визуализация на микрокалцификации.

Маса 1.Бъбрекхарактеристики на реципиента на трансплантант. Няма случаи на хиперкалцемия в тази кохорта; *класификация на Banf Classification of Allograft Pathology—201828; FSGS=Фокална сегментна гломерулосклероза; IFTA=Интерстициална фброза и тубулна атрофия; съответните авторадиографски и хистологични резултати са представени в Допълнителен S1.

Таблица 2. Починалибъбрекхарактеристики на донора. *Сърдечно-съдово заболяване, дефинирано като мозъчно-съдово събитие, миокарден инфаркт, съдово заболяване, изискващо инвазивна интервенция; **както е отбелязано от екипа по доставките; Съответните авторадиографски и хистологични резултати са представени в Допълнителен S2; няма донори със захарен диабет.

Резултати

Примерна кохорта.

Тринадесетбъбрекпроби са получени след трансплантектомия, средно 33 [IQR 9–66] месеца след трансплантацията, от реципиенти на трансплантант със средна възраст 51 [IQR 30–64] години. Трансплантектомия е извършена за отхвърляне на алографт (Banf IIA и IIB) при седем пациенти, хронична артериопатия на алографт при двама пациенти, инфекция на алографт при двама пациенти, първична нефункция при един пациент и интерстициална фброза и тубулна атрофия степен III при един пациент. Осем от 13 (61,5 процента) пациенти са имали хиперпаратироидизъм, седем (53,8 процента) са имали хиперфосфатемия, пет (38,5 процента) са имали захарен диабет и нито един от тези пациенти е имал признаци нанефрокалцинозана клиничен ултразвук или анамнеза за камъни в бъбреците (Таблица 1). Бяха получени проби от бъбрек на седем починали донори от донори със средна възраст 65 [IQR 64–71] години. Четири от седем (57,1 процента) донори са имали анамнеза за сърдечно-съдово заболяване, нито един не е имал захарен диабет и шест от седем (85,7 процента) са имали атеросклероза на бъбречната васкулатура при визуална проверка, което са потенциални фактори за отказ на тези донорибъбреци(Таблица 2).

Фигура 1. Авторадиографско изображение на поглъщане на [18F]-натриев флуорид ([18F]-NaF) (A), с насложено изображение на поглъщане на [18F]-NaF с оцветяване с червено ализарин на микрокалцификации (B) и оцветяване на калцификации по von Kossa (° С).

Авторадиография и хистология.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 процента в 5 (25 процента) от 20 проби (Фиг. 1 и Фиг. 2A) (Допълнителен S1 и Допълнителен S2, показващи авторадиографията и насложените изображения за всички проби). Броят на [18F]-NaF зоните е значително по-висок вбъбрекалографт проби в сравнение с починал донорбъбрекпроби, с медиана от 7.0 [IQR 4.0–15,5] и 2.0 [IQR 1.0–6.0 ], съответно (p=0.019) (допълнителен S3).

Тубулоинтерстициални микрокалцификации, визуализирани с оцветяване с ализариново червено, присъстваха в 19 от 20 проби, с медиана от 5,5 [IQR 2–10.3] на проба, а гломерулни микрокалцификации бяха наблюдавани в седем от 20 проби, с медиана от 1 [IQR 1–3] на проба (фиг. 2B). Значително по-висок брой микрокалцификации се наблюдава в пробите от алографт на бъбрек в сравнение с пробите от бъбрек на починал донор, с медиана 9.0 [IQR 5.0–20.5] и 4.0 [IQR 1.0–4.0], съответно (p=0.046) (допълнителен S3). При оцветяване по Von Kossa, тубулоинтерстициални калцификации се наблюдават в 18 от 20 проби, с медиана от 2,5 [IQR 1–5] на проба, а гломерулни калцификации се наблюдават в седем от 20 проби, с медиана 1 [IQR 0–3 ] на проба (фиг. 2C). Броят на калцификатите не се различава значително междубъбрекпроби от алографт и бъбречни проби от починал донор, с медиана от 4.0 [IQR 2.0–6.0] и 2.0 [IQR 2.{ {9}}–7.0], съответно (p=0.311) (Допълнително S3). Възпроизводимостта между наблюдателите беше идентифицирана между визуално и полуавтоматично откриване на калцификации, с ICC от 0.94 (95 процента CI 0.85–0.98) за оцветяване с червено ализарин и от 0.77 (95 процента CI 0.42–0.91) за оцветяване по Von Kossa.

Наслагващи се изображения на авторадиография и хистологични резултати показват ко-локализация на поглъщането на [18F]-NaF с червено оцветяване с ализарин за микрокалцификация (фиг. 1B). За сравнение, наслагващите се изображения на поглъщането на [18F]-NaF и оцветяването на калцификациите по Von Kossa показват поглъщане в области без хистологично доказани калцификации (фиг. 1C). Фалшиво отрицателното поглъщане на [18F]-NaF, като процент на хистологично доказани (микро)калцифицирани зони извън наслагването, е средно 0 процента [IQR 0–25 процента] за червените области на ализарин и медиана 100 процента [65–100 процента ] за райони Von Kossa. Оцветяването с червено ализарин на микрокалцификатите демонстрира добра корелация с усвояването на [18F]-NaF (rho на Spearman от 0,81 (95% CI 0,57–0,92), p< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5% усвояване на [18F]-NaF (фиг. 4).

Фигура 2. Наслагващо се изображение на поглъщане на [18F]-натриев флуорид ([18F]-NaF) и (ализарин червено) микрокалцификации (A), с оцветяване с червено ализарин за микрокалцификации (B) и оцветяване на von Kossa за калцификации (C).

Характеристики на реципиента по време на трансплантектомия.

Не се наблюдават разлики междубъбрекалографски проби от пациенти с (n{{0}}) или без хиперфосфатемия (n=6), за броя на зоните [18F]-NaF (медиана 5.0 [IQR 2.0–11.8] срещу 7.0 [7.0–23.0], p=0.170) , ализариново червено (медиана 7,5 [IQR 5.0–14.0] спрямо 12.0 [3.0–34.0], p{{30}}.390) и Von Kossa (медиана 5.0 [IQR 3,5–6,3] спрямо 3.0 [2.{ {59}}–5.0], p=0.247). Сравняването на проби от бъбречен алограф от пациенти с (n=8) или без (n=5) хиперпаратиреоидизъм не показва разлики за броя на [18F]-NaF зоните (медиана 7.0 [IQR 4.0–7,5] срещу 7,5 [4.0–23.0], p=0.459), ализариново червено (медиана 9.{{ 79}} [IQR 6.0–11.0] срещу 1{{103}}.0 [3,5–32,8], p{{76 }}.769) и Von Kossa (медиана 4.0 [IQR 1,5–5.0] спрямо 4,5 [2.0–6,8], p{{9{{ 131}}}}.505). Не са установени значителни разлики между алографски проби на бъбрек от пациенти с (n=5) или без (n=8) захарен диабет за броя на [18F]-NaF зоните (медиана 5,5 [IQR 2,5– 19,3] спрямо 7,0 [6,5–15,5], p=0.524), ализариново червено (медиана 10,0 [IQR 5,5–24,8] спрямо 9,0 [4,0–8,5], p=0.833) и Von Kossa (медиана 3,0 [IQR 2,0–5,8] спрямо 4,0 [3,5–8,5], p=0.284). За времето между трансплантацията и трансплантектомията (месеци) не са наблюдавани значими корелации с броя на [18F]-NaF области (p=0.586), ализариново червено (p=0.667) и Von Коса (p=0.459). За възрастта по време на трансплантацията не са наблюдавани значими корелации с броя на областите [18F]-NaF (p=0.902), ализариново червено (p=0.798) и Von Kossa (p =0.334). По подобен начин не са наблюдавани значими корелации между продължителността на диализата (месеци) следбъбрекнеизправност на алографа и брой на [18F]-NaF области (p=0.481), ализариново червено (p=0.565) и Von Kossa (p=0.174).

Фигура 3. Корелация на броя на зоните с [18F]-натриев флуорид ([18F]-NaF) с оцветени с червено ализарин микрокалцификации (A) и оцветени с von Kossa калцификации (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5 процента повърхностна повърхност на маркера [18F]-натриев флуорид ([18F]-NaF) за броя на оцветените с червено ализарин микрокалцификации (A) и von Kossa, оцветени калцификации (B) (медиана, интерквартилен диапазон).

Дискусия

В това проучване за доказателство на концепцията, ex-vivo усвояването на [18F]-NaF при хорабъбрекпаренхимните проби показват добра корелация с хистологично доказани микрокалцификации. Поглъщането на [18F]-NaF корелира по-силно с оцветяването с червено ализарин за активни микрокалцификации в сравнение с оцветяването на Von Kossa на консолидирани калцификации, което предполага роля за изобразяване на [18F]-NaF при идентифицирането на зони в ранен стадий на нефрокалциноза.

Представените проби представляват комбинация от донорски бъбреци и експлантирани бъбречни алографти. Тези два типа проби се различават по отношение на свързването на маркера, като се наблюдава по-голямо усвояване на [18F]-NaF в проби от експлантиран бъбречен алографт. Това е в съответствие с предишни публикации, съобщаващи за увеличаване на микрокалцификатите след бъбречна трансплантация 5–7. Асоциацията нанефрокалцинозас по-ниска функция на присадката по време на биопсията и една година след трансплантацията се съобщава в две проучвания за биопсия на бъбречен алографт, с 258 и 149бъбрекреципиенти съответно на трансплантант8,9. Нещо повече, в надлъжна кохорта с 97 реципиенти на бъбречна трансплантация е показано значително по-лошо 1-годишно и 12-годишно оцеляване на присадката при пациенти с калциево-оксалатни отлагания (т.е. преживяемост на присадката от 98,6 процента спрямо 72,5 процента и съответно 79,3 процента спрямо 49,7 процента). При мултивариантен логистичен регресионен анализ, наличието на калциево-оксалатни отлагания е независимо свързано със загуба на графт, в модел, включващ между другото креатинин по време на биопсия и тип донор4. Специфичната роля на микрокалцификатите в тази каскада отбъбрекнамаляването на функцията на алографта остава неясна. В клиничните условия преди трансплантацията отлаганията на CaOx се приписват на високи нива на серумен оксалат, молекула, която не се отстранява ефективно по време на диализа4. Докато отлаганията на CaPhos най-често се наблюдават при пациенти с хиперпаратиреоидизъм и високи нива на серумен калций, поради нарушен минерален метаболизъм преди и след трансплантация5. Не открихме разлики в резултатите от хистологията и авторадиографията за хиперфосфатемия, хиперпаратироидизъм, захарен диабет, времето между трансплантацията и трансплантектомията и продължителността на диализата след отказ на бъбречен алографт.

За разработването на нови стратегии за лечение на активни микрокалцификации внефрокалциноза, неговото клинично значение по отношение на (хронична) неуспех на трансплантация трябва да се разбира по-цялостно. С идентифицирането на целева популация с висок рискбъбрекреципиенти с трансплантация, клиничните проучвания могат да бъдат предназначени за изследване на стратегии за лечение21. Възможен фокус може да се намери в регулирането нагоре на ендогенните инхибитори на калцификация, със специфичен акцент върху остеопонтина3.

Предвид високата честота нанефрокалцинозаи връзката му с функцията на бъбречния алографт, по-доброто разбиране на етиологията на микрокалцификациите е оправдано. Неинвазивен и надежден диагностичен подход за идентифициране и количествено определяне на микрокалцификациите при ранна нефрокалциноза може да позволи проучвания за въздействието на нефрокалцинозата върху функцията на бъбречната трансплантация. Изобразяването на [18F]-NaF представлява интерес, тъй като поглъщането на [18F]-NaF в съдови проби от хора и животни се увеличава в биологично активните области на калцификация, преди тези области да могат да бъдат визуализирани чрез микрокомпютърна томография16,17,22. В скорошни клинични PET/CT проучвания беше доказано, че усвояването на [18F]-NaF е свързано с прогресията на съдовата калцификация, предоставяйки клинични доказателства за използването на [18F]-NaF за откриване на зони с биологично активна калцификация18-20. Наблюденията в това проучване са в съответствие с тези предишни открития в областта на васкуларното изобразяване. Беше демонстрирана добра корелация между усвояването на [18F]-NaF и хистологично доказаните микрокалцификации, докато корелацията с консолидираните калцификации беше очевидно по-слаба.

Както беше посочено, беше идентифицирана съвместна локализация между поглъщането на [18F]-NaF и положителни микрокалцификации на ализарин червено, докато областите на поглъщане на [18F]-NaF не се локализират съвместно с оцветяването на Von Kossa на консолидирани калцификации. Тези калцирани зони, с консолидирани калцификации и без съответно поглъщане на [18F]-NaF могат да се считат за области на неактивна калцификация, където няма текущ процес на минерализация, както е описано по-рано от Irkle et al. в ex-vivo изследване на каротидна калцификация16. Въпреки че е валидиран само за съдови калцификации, а не забъбрекпаренхимни калцификации, това се поддържа от свързващите свойства на [18F]-NaF към външната повърхност на калцификациите и ограниченото проникване в твърдите калцификации. Следователно поглъщането на [18F]-NaF ще бъде по-високо при микрокалцификации с голяма повърхностна площ, в сравнение с микрокалцификации с голям обем, но относително малка повърхност13,16.

Това проучване за доказателство на концепцията също има някои ограничения. Първо, присъщо на дизайна на изследването, резултатите представляват една времева точка, без клинично проследяване на прогресията на калцификацията. Второ, това проучване за доказателство на концепцията се състои от сравнително малък брой проби от бъбрек, тъй като трансплантектомия след късна неуспешна трансплантация се извършва само при клинични показания и наличие на отказан донорбъбрециза изследователска употреба е ограничено23. Следователно, цялостен анализ на етиологията на калциевите отлагания трябва да се разглежда извън обхвата на този проект. Трето, клиничният превод на резултатите е възпрепятстван от липсата на познания за in-vivo разпределението на [18F]-NaF в бъбреците и ефекта от клирънса на бъбречния индикатор, т.е. ниската активност от целева към фонова може да ограничи визуализацията на калцификациите. За да се реши този проблем, трябва да се оцени оптималният момент на [18F]-NaF PET изображения, т.е. в който [18F]-NaF наистина се екскретира и останалата активност идва от свързване с калцирани области. Вероятно това може да се постигне със забавено изобразяване над три часа, както се извършва за оценка на коронарни калцификации24. Намалената скорост на гломерулна филтрация, открита при реципиенти на трансплантация, може да доведе до удължена фаза на екскреция, изискваща по-дълъг период между инжектирането на маркер и PET изображения, но настоящите насоки не показват потенциална нефротоксичност на [18F]-NaF маркера11,25. Потенциална стъпка между представеното тук доказателство за концептуално изследване и in-vivo изобразяване може да бъде ex-vivo [18F]-NaF PET изобразяване на нормотермични перфузирани бъбреци или in-vivo [18F]-NaF microPET изследвания върху животни 26,27. Четвърто, клиничното приложение на тази техника може да бъде възпрепятствано от разходите за извършване на [18F]-NaF PET/CT процедура и присъщото излагане на радиация. Но новите системи за цифрови PET камери с по-висока чувствителност могат да намалят и двете, поради по-краткото време за сканиране и по-ниската инжектирана доза активност.

Силата на това проучване за доказателство на концепцията се крие в подробното сравнение едно към едно на микрокалцификациите, идентифицирани чрез [18F]-NaF авторадиография и хистология. Поглъщането на Te [18F]-NaF в различни проби може да се сравни без необходимост от допълнителни корекции, тъй като всички проби бяха инкубирани в един и същ разтвор на [18F]-NaF. Освен това, това проучване предоставя първите данни, показващи визуално и статистическо съвпадение между поемането на [18F]-NaF и хистологично доказани микрокалцификации в бъбречни проби.

Cistanche-бъбречна функция

В заключение, ние предоставяме първите данни за използването на [18F]-NaF в авторадиографско изследване за идентифициране на микрокалцификации в активнинефрокалцинозаследбъбректрансплантация. Това ex-vivo [18F]-NaF доказателство за концептуално изследване е първата стъпка към потенциалното приложение на клинична [18F]-NaF PET/CT при реципиенти на бъбречна трансплантация.

Методи

Човекбъбрекмостри.

Бъбречна тъкан е получена след трансплантектомия (n=13) и от изхвърлени бъбреци от починали донори (n=7) в случай на намаляване на бъбрека на донора от свързани центрове за трансплантация. Клиничните данни от реципиенти и донори на бъбречна трансплантация бяха извлечени от медицинските досиета на пациентите, включително наличието на хиперпаратиреоидизъм, хиперфосфатемия и захарен диабет преди трансплантектомията и оценка на клиничната патология на проби от алографт на бъбрек, докладвани с помощта на Banf Classification of Renal Allograft Pathology28. Изследователските дейности бяха извършени в съответствие с декларацията на Хелзинкските етични принципи за медицински изследвания, включващи хора, и институционалният съвет за преглед даде одобрение за това проучване (Комитет по медицинска етика, Университетски медицински център Гронинген 2015/501). Беше получено информирано съгласие от всички реципиенти на трансплантация и беше дадено одобрение преди донорството за използване на изхвърлени бъбреци от починали донори за изследователски цели. Клиничните и изследователски дейности бяха в съответствие с принципите на Декларацията от Истанбул, както е посочено в „Декларацията от Истанбул относно трафика на органи и трансплантационния туризъм“.

Стандартната оперативна процедура (SOP) за вземане на тъканни проби беше както следва: Пробите бяха получени в хирургичния салон, непосредствено след екстракцията на бъбрека (за трансплантектомия) или при пристигането на изхвърления донорбъбрекв нашия трансплантационен център. Пробите, използвани за този експеримент, са взети в напречната равнина на горния полюс, включително кортикална и медуларна бъбречна тъкан, с размер между 25 mm × 15 mm и 20 mm × 40 mm. Тези проби бяха фиксирани във формалин и вградени в парафин. С помощта на микротомен инструмент за прецизно рязане бяха направени три µm парафинови срезове. Тези секции бяха монтирани върху адхезионно микроскопско стъкло (TOMO, Matsunami Glass, САЩ). Серийни секции, т.е. съседни секции, които разкриват последователни слоеве набъбректъканни проби, бяха използвани за авторадиография и хистологичен анализ. Преди инкубацията на индикатора и хистологичното оцветяване, срезовете бяха депарафинизирани, рехидратирани в деминерализирана вода и временно съхранявани във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS).

[18F]-NaF инкубация и авторадиография.

Ex vivo експериментът се основава на протокола, използван в предишните проучвания от Hop et al. и Reijrink et al.22,29. Първото проучване е авторадиографско изследване на поглъщането на [18F]-NaF в каротидни плаки от пациенти с инсулт, подложени на операция, с индикация за калцификация на базата на КТ като сравнение. Второто проучване е авторадиографско изследване на поемането на [18F]-FDG в проби от мастна тъкан, с имунохистохимия на серийни срезове като сравнение. Един от всеки три серийни среза се измива в разтвор на [18F]-NaF, при концентрация от 618 милибекерел (MBq) в 300 mL PBS, при стайна температура, в продължение на 30 минути. Измиването се извършва чрез трикратно изплакване със студен PBS и два пъти със студена вода. Пробите се изсушават на открито и върху пробите се поставя празен фосфорен екран. Експозицията се извършва през нощта, за период от 24 часа и 30 минути. Определянето на разпределението и интензитета на тъканната активност се извършва на фосфорен екран с помощта на Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Марлборо, САЩ).

Ализариново червено и оцветяване по von Kossa.

Извършено е оцветяване с червено ализарин, за да се визуализира натрупването на калций в ранен стадий на калцификация. Пробите се инкубират в 2 процента w/v разтвор на ализарин червено (разтворен в деминерализирана вода), рН 4,2 за 5 минути30. Промиването се извършва чрез 20 пъти изплакване в 1:1 ацетон/ксилен и 20 пъти изплакване в 100 процента ксилен. Беше извършено оцветяване на Von Kossa, за да се визуализира присъствието на неорганични фосфатни молекули в консолидирани калцификации. Накратко, пробите се инкубират в 1% разтвор на сребърен нитрат (AgNO3) за 1 час, докато се излагат на слънчева светлина30. Редуван с трикратно изплакване в деминерализирана вода, инкубиране се извършва с натриев тиосулфат за 5 минути, последвано от инкубиране в ядрено бързо червено за 3 минути.

Обработка и анализ на изображения.

Оцветените тъканни срезове бяха дигитализирани с Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Хамамацу, Япония) и изображенията бяха инспектирани с помощта на софтуера Aperio ImageScope версия 12.1.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Вецлар, Германия). Авторадиографията и количествените компютъризирани анализи на изображения бяха извършени със софтуер ImageJ, версия 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc).

За всички хистологични изображения беше приложено изваждане на фона, като се вмъкна контур на границата на хистологичната проба. Полуавтоматизирано откриване на калцификации в ализариново червено и оцветяване с Von Kossa беше извършено с ImageJ—BioVoxxel Toolbox31. Праговете бяха приложени за всички проби и откритите области на калцификация бяха разширени с 6 итерации, за да се оптимизира визуализацията. За авторадиографските изображения бяха извършени ротация и преоразмеряване въз основа на оригиналните хистологични проби. Прагове бяха приложени за всички проби, което доведе до области на поглъщане на маркер, следвайки подхода, описан от Irkle et al .: изображенията бяха прагове с помощта на метода Otsu, последвано от замъгляване по Гаус и прагове с метода Li16. Наложените изображения бяха получени чрез съпоставяне на очертанията от съседните хистологични изображения, с последващо съпоставяне на резултатите от хистологията и авторадиографията (фиг. 1). Количественото определяне на базата на пиксели на калцификацията и площта на маркера (като процент от площта на пробата) беше извършено с инструмента ImageJ—Analyze Particles.

Cistanche - симптоми на бъбречно заболяване

Статистически анализи.

Статистическите данни бяха извършени със статистическия пакет за социални науки версия 23 (IBM Corporation, Armonk NY, САЩ), графиките бяха направени с GraphPad Prism 7.02 за Windows (Graph Pad Sofware, Сан Диего, САЩ) и цифрите бяха произведени с помощта на Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, Сан Хосе, САЩ). Резултатите бяха представени като медиана и интерквартилен диапазон (IQR) за изкривени данни и като честота и процент, когато данните бяха категорични. Сравнихме групи, използвайки U тестове на Mann-Whitney (двустранна pvalue<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Наличност на данни

Починал донорски бъбрек ибъбрекавторадиографски изображения на реципиент на трансплантант на поглъщане на [18F]-натриев флуорид ([18F]-NaF), с насложени изображения на поглъщане на [18F]-NaF с оцветяване с червено ализарин на микрокалцификации и оцветяване на калцификации по Von Kossa са достъпни онлайн като допълнителна информация. Всички допълнителни данни ще бъдат предоставени при поискване, в съответствие с разпоредбите на IRB на Университетския медицински център Гронинген.

Препратки

1. Gwinner, W. et al. Ранна калцификация на бъбречни алографти, открити чрез протоколни биопсии: причини и клинични последици. Am. J. Трансплантация. 5, 1934–1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. & Unwin, RJ Какво енефрокалциноза?. Kidney Int. 88, 35–43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM & Giachelli, CM Остеопонтинът предпазва от индуцирани от високи нива на фосфатинефрокалцинозаи съдова калцификация. Kidney Int. 89, 1027–1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR & Pacheco-Silva, A. Ранното присъствие на отлагане на калциев оксалат вбъбрекбиопсията на графта е свързана с лоша дългосрочна преживяемост на графта. Am. J. Трансплантация. 5, 323–329 (2005).

5. Evenepoel, P. et al. Локализация, етиология и въздействие на калциево-фосфатни отлагания в бъбречни алографти. Am. J. Трансплантация. 9, 2470–2478 (2009).

6. Nankivell, BJ et al. Естествена история на хронична алографтна нефропатия. Н. англ. J. Med. 349, 2326–2333 (2003).

7. Schwarz, A. et al. Рискови фактори за хронична алографтна нефропатия след бъбречна трансплантация: протоколно биопсично изследване. Kidney Int.67, 341–348 (2005).

8. Bagnasco, SM et al. Оксалатни отлагания в биопсии от нативни и трансплантирани бъбреци и влияние върху функцията на присадката. Нефрол. Набиране. Трансплантация. 24, 1319–1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI Отлагането на оксалат в биопсии на бъбречен алографт в рамките на 3 месеца след трансплантацията е свързано с дисфункция на алографта. PLoS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA & Pol, RA Забравихме ли образната диагностика преди и след бъбречна трансплантация?. Евро. Радиол. 28, 3263–3267 (2018).

11. Beheshti, M. et al. 18F-NaF PET/CT: Указания за процедурата EANM за изобразяване на кости. Евро. J. Nucl. Med. Mol. Изображения 42, 1767–1777 (2015).

12. Dweck, MR et al. Коронарно артериално поглъщане на 18F-натриев флуорид. J. Am. Coll. Кардиол. 59, 1539–1548 (2012).

13. Dweck, MR et al. Поемането на 18F-натриев флуорид е маркер за активна калцификация и прогресия на заболяването при пациенти с аортна стеноза. Circ. Cardiovasc. Изображения 7, 371–378 (2014).

14. Derlin, T. et al. Осъществимост на 18F-натриев флуорид PET/CT за изобразяване на атеросклеротична плака. J. Nucl. Med. 51, 862–865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM & Schurgers, LJ Целева идентификация за диагностика и интервенция на уязвими атеросклеротични плаки отвъд 18F-флуородезоксиглюкоза позитронно-емисионна томография: обещаващи индикатори на хоризонта. Евро. J. Nucl. Med. Mol. Изображения 46, 251–265 (2019).

16. Irkle, A. et al. Идентифициране на активна съдова микрокалцификация чрез позитронно-емисионна томография с 18F-натриев флуорид. Нац. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD и др. 18 Усилването на F-флуориден сигнал идентифицира микрокалцификати, свързани с нестабилност на атеросклеротичните плаки в позитронно-емисионни томографски/компютърни томографски изображения. Circ. Cardiovasc. Изображения 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM и др. Съдово поглъщане при позитронно-емисионна томография с 18F-натриев флуорид: прекурсор на съдова калцификация? J. Nucl. Кардиол. (2020 г.).

19. Дерлин, Т. и др. Корелация на възпалението, оценено чрез 18F-FDG PET, активно минерално отлагане, оценено чрез 18F-флуорид PET, и съдова калцификация в атеросклеротична плака: PET/CT изследване с двоен индикатор. J. Nucl. Med. 52, 1020–1027 (2011).

20. Китагава, Т. и др. Прогностична стойност на 18F-натриев флуорид позитронно-емисионна томография при откриване на високорискова коронарна артериална болест в комбинация с компютърна томография. J. Am. Сърце ст.н.с. 7, e010224 (2018).

21. Бек, М. и др. Ендогенни инхибитори на калцификация в превенцията на съдова калцификация: консенсусно изявление от действието COST EuroSofCalcNet. Преден. Cardiovasc. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. et al. Позитронно-емисионната томография с 18F-натриев флуорид оценява микрокалцификациите в виновни и невиновни човешки каротидни плаки. J. Nucl. Кардиол. 26, 1064–1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA & Gill, JS Нефректомия след неуспешна трансплантация: текуща практика и резултати. Am. J. Трансплантация. 7, 1961–1967 (2007).

24. Kwiecinski, J. et al. Тричасово забавено изобразяване подобрява оценката на PET на коронарния 18F-натриев флуорид. J. Nucl. Med. 60, 530–535 (2019).

25. Bucerius, J. et al. Документ за позицията на Сърдечно-съдовия комитет на Европейската асоциация по ядрена медицина (EANM) относно PET изображения на атеросклероза. Евро. J. Nucl. Med. Mol. Изображения 43, 780–792 (2016).

26. Buchs, J.-B. et al. DCD бъбреци на прасета, анализирани чрез MRI за оценка ex vivo на тяхната жизнеспособност. Трансплантация 97, 148–153 (2014).

27. Pool, M. et al. Вливане на мезенхимни стромални клетки в свинебъбреципо време на нормотермична машинна перфузия: непокътнати MSC могат да бъдат проследени и локализирани в гломерулите. Вътр. J. Mol. Sci. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. et al. Справочно ръководство от 2018 г. за класификацията на Banf за патология на бъбречния алографт. Трансплантация 102, 1795–1814 (2018).

29. Reijrink, M. et al. Поемането на [18F]FDG в мастната тъкан не е свързано с възпаление при захарен диабет тип 2. Mol. Imaging Biol.23, 117–126 (2020).

30. Шао, Дж.-С. et al. Съдова калцификация и аортна фброза бифункционална роля на остеопонтин при диабетна артериосклероза. Артер. TrombVascBiol 31, 1821–1833 (2011).

31. Brocher, J. Качествена и количествена оценка на два нови алгоритма за бинаризация, ограничаващи хистограмата. Вътр. J. Процес на изображение. 8, 30–48 (2014).

Благодарности

Този изследователски проект е подкрепен от грант от фондация De Cock-Hadders (код на проекта 2018-03).

Авторски принос

SB допринесе за дизайна, придобиването и анализа и състави ръкописа. IFA, MR и MLCB допринесоха за дизайна, придобиването и анализа и съществено преработиха ръкописа. SPB, CM и MHdB допринесоха за концепцията и съществено преработиха ръкописа. JLH, RHJAS и RAP допринесоха за концепцията, дизайна и анализа и съществено преработиха ръкописа.

Конкуриращи се интереси

Авторите декларират липса на конкуриращи се интереси.