Проучване върху невроендокринно-имунната функция на Cistanche Deserticola и неговите продукти за варене на оризово вино в модел на плъх, индуциран от глюкокортикоиди-Ⅰ

1. Въведение

Cistanche deserticola, който се нарича „пустинен женшен“, е традиционна китайска медицина, която се използва от векове като ян-тонизираща билка заободряване на бъбреците и укрепване на Ян[1]. Осем вида и един вариант наCistanche Herba са записани само в КитайCistanche deserticolaYC Ma иCistanche tubulosa(Schenk) Wight са записани в Китайската фармакопея [2]. Фармакологичните изследвания доказаха товаCistanches Herbaпроявява невропротективно [3], имуномодулиращо [4], кардиопротективно [5], против умора [6], противовъзпалително [7], хепатопротективно [8], антиоксидантно [9], антибактериално [10], слабително [11] и противотуморно действие ефекти [12]. Широкият спектър от докладвани биологични активности на този род се дължи на неговия сложен и разнообразен фитохимичен състав.Cistanche deserticolaсъдържа фенилетанол гликозиди, иридоиди, полизахариди [13] и др. Съдържанието на фенилетаноидни гликозиди е най-високо в оригиналните лекарствени материали [14].

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ОСНОВЯВАНЕ НА БЪБРЕЦИТЕ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Обработката на китайската Materia Medica (CMM) е традиционна фармацевтична техника за изпълнение на различните изисквания за лечение, дозиране и производство на препарати според теорията на традиционната китайска медицина. Тези преработени продукти се наричат ​​парчета отвара, които се използват в клиниките. Обработката има за цел да подобри ефикасността за намаляване на токсичността на суровите лекарства. Китайската фармакопея от 2015 г. записва, че дебели филийки Cistanche (CD) и задушени с оризово вино Cistanche (WCD) могат да се използват като парчета отвара в клиниката. Нашата изследователска група показа, че слабителният ефект е облекчен, а ефектът против стареене и ободряващият ефект върху бъбреците-ян са засилени, след като Cistanche беше задушен с оризово вино [15].

Функцията на оста хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза-тимусна жлеза (HPAT) е нарушена при синдрома на бъбречно-ян дефицит [16]. Пациентите с бъбречно-ян дефицит също имат обширна имунна дисфункция. Дисфункцията на оста HPA е тясно свързана с имунодефицита. Теорията за невроендокринно-имунната мрежа (NEI) показва, че имунната и невроендокринната система споделят много лиганди и рецептори [17], а хипоталамусът се счита за опора за свързване на невроендокринната с имунната система.

В това проучване ние репликирахме бъбречно-ян дефицит при моделни плъхове с екзогенна кортикостероидна инжекция и изследвахме механизма на бъбречно-ян дефицит в отговор на различни преработени продукти на Cistanche deserticola от гледна точка на ендокринно-имунната функция.

2. Материали и методи

2.1. Материали и реактиви

Cistanche deserticola е събран от Alashan Neimenggu през 2019.5 г. и е идентифициран като изсушени месести стъбла на Cistanche deserticola YC Ma от проф. Yanjun Zhai (Училище по фармация, Университет по традиционна китайска медицина в Ляонин, Китай). Екземплярите на ваучерите бяха запазени в технологичния център за обработка на машини в Ляонин.

Стандартни съединения на ajugol бяха закупени от Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Китай); цистанозид F,ехинакозид, цистанозид А и изоактеозидса закупени от Must Company (Сичуан Китай); актеозидът е закупен от Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Далиан, Китай). Ацетонитрил и метанол от клас MS са закупени от Merck KGaA (Дармщат, Германия). Мравчена киселина с клас HPLC беше закупена от Merck KGaA (Дармщат, Германия). Оризовото вино е закупено от Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Китай).

Кортикостерон (CAS: 50-22-6, чистота > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), хапчета chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), плъх ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 и IL-10 ELISA комплекти за откриване са закупени от Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Комплектът ELISA за кортизол при плъхове е предоставен от BOSK Co., CD4 антитяло на плъх, CD8a антитяло (№ 561833 и 559976), RBC лизат (Solarbio, R1010), PBS буферен разтвор (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM и праймери -актин нагоре и надолу по веригата бяха предоставени от Guangzhou Invitrogen Co. Комплект за обратна транскрипция (№ RR037A) и комплект за синтез на cDNA (№ 10000068167) бяха предоставени от Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Хлороформ, изопропанол, 75% етанол и уретан Всички разтвори бяха аналитично чисти и произведени от Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Свръхчистата вода беше произведена от системата Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, САЩ).

2.2. Експериментални инструменти

Ензимен маркер (Thermo, модел 3530911931), автоматична машина за миене на плочи (модел HBS- 4009), дигитален дисплей за измерване на силата на издърпване (модел VICTOR- 50N), високоскоростна центрофуга за замразяване (модел Sigma 3k15 ), ултрамикро спектрофотометър (модел B-50Q), генен усилвател (модел L96G), флуоресцентна количествена PCR в реално време (модел StepOne), поточен цитометър (модел AC66051710132), парафинов микротом (модел Laika), микроскоп (Olympus , модел BS-53), и са използвани инструмент за чиста вода (модел F7JA36507).

2.3. Подготовка на проби за UPLC-Q-TOF-MS и фармакологични експерименти

WCD е обработен от същата партидаCistanche deserticolaв нашата лаборатория. За приготвянето на WCD, сухи парчета CD (дебелина 5 mm) (100 g) се вливат в оризово вино (30 mL), запарват се при високо налягане (1, 25 kPa) в продължение на 4 часа и след това се сушат при 55 градуса.

Грубите прахове от CD и WCD се накисват 10 пъти в 95% етанол за 0,5 часа, екстрахират се под обратен хладник 3 пъти всеки път за 1 час и се филтруват, а филтратите 3 пъти се комбинират. Етанолът се възстановява при понижено налягане и екстрактът се получава за приложение. Екстрактът (1 mL) се добавя към 50% метанол, довеждайки общия обем до 20 mL, и се съхранява при 4 градуса за анализ на съдържанието.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS Условия за анализ на CD и WCD екстракти

2.4.1. LCThMS Аналитични условия

Системата UPLC-MSThMS със софтуер MassLynx 4.1 Analyst беше използвана за извършване на събирането и обработката на данни. Аналитичната колона беше Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) при температура 40 градуса C. Подвижната фаза беше 0.1% воден разтвор на мравчена киселина (А) и ацетонитрил, съдържащ 0,1% мравчена киселина (В). Градиентът на елуиране беше 0.00–1.00 min с 3% B, 1,01–2.00 min с 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} min с 12% B, 3,01–4.00 min с 15% B, 4,01–5.00 min с 20% B, 5,01–6.00 min с 22 % B, 6,01–8.00 min с 25% B и 8,01–9.00 min с 10% B. Скоростта на потока е 0,3 mLTh min, а обемът на инжектиране е 1,0 μL.

Тройният четворен масспектрометър на Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA), оборудван с източник на електроспрей йонизация (ESI), беше използван в режим на отрицателни йони. Газът за десолватация беше азот със скорост на потока 500 LThh при температура 250 градуса. Всички открити съединения бяха измерени в режим на наблюдение на множество реакции (MRM); Таблица 1 показва енергийните параметри, а таблица 2 показва калибровъчните криви за анализираните компоненти.

2.4.2. Приготвяне на референтни вещества

Тубулозид А (3.02 mg), ехинакозид (3.00 mg), 2'-ацетилактеозид (2,34 mg), актеозид (2,45 mg), изоактеозид (0,61 mg), цистанозид F ( 2,14 mg), салидрозид (3,39 mg), генипозидова киселина (2,84 mg), аджугол (1,58 mg) и каталпол (2,39 mg) се разтварят в метанол за приготвяне на основен разтвор. Изходният разтвор се разрежда с метанол, за да се получат подходящите концентрации за работните стандартни разтвори. Всички приготвени разтвори се съхраняват при 4 градуса преди употреба.

2.5. Подготовка и групиране на животински модели

Мъжки плъхове SD (180–220 g) са закупени от Liaoning Changsheng Biotechnological Co., номер на разрешителното за животни: SCXK (Liao) 2015–0001. Всички плъхове се поддържат със свободен достъп до храна и вода при 25 градуса и относителна влажност 30–50%. Животните бяха настанени в продължение на 7 дни преди експериментите.

Сто плъха бяха разделени на случаен принцип в 10 групи: празна контролна (BC) група, моделна контролна (MC) група, положителна контролна (PC) група, оризово вино контролна (WC) група, CD с висока доза (CD -HD), група със средна доза (CD-MD), група с ниска доза (CD-LD), група с висока доза (WCD-HD), група със средна доза (WCD-MD) и WCD група с ниски дози (WCD-LD). Дозите на CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD и CD-LDThWCD-LD бяха съответно 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) и 1,37 gTh (kg ∙ d). Дозата за PC групата беше 1,646 gTh (kg ∙ d), а за WC групата 1 mLTh100 g за 40 дни. На 6-ия ден след приложението, плъховете се инжектират подкожно с кортикостеронова водна суспензия (кортикостерон + 0.1% диметилсулфоксид + 0.1% Tween-80 + 0.9% натриев хлорид), с изключение на за групата BC [18]. Концентрацията на кортикостерон е 5 gThL, а дозата е 0,1 mLTh100 g. На плъховете в групата с BC е даден нормален физиологичен разтвор + 0.1% диметилсулфоксид + 0.1% Tween- 80 + 0.9% натриев хлорид чрез инжектиране в същата доза.

2.6. Определяне на функциите на оста HPA

2.6.1. Тест за тегло, температура и сила на задържане

На всеки 3 дни се прави тест за тегло, а на всеки 6 дни се измерва температурата. по време на експеримента. На 39-ия ден максималната сила на задния крайник беше измерена с уред за захващане. Плъховете бяха поставени на гладки платформи, карайки задните им крайници да хващат стълба. Плъховете инстинктивно хващат всеки предмет, за да предотвратят движението назад, когато опашката бъде издърпана, докато силата на издърпване надхвърли хватката. Когато плъхът загуби хватката си, предусилвателят може автоматично да запише максималната сила на захващане.

2.6.2. Определяне на нивото на T, CRH, ACTH, CORT и Cortisol в серума

Един час след последното приложение, плъховете се анестезират чрез интраперитонеално инжектиране на уретанов разтвор (20 gTh100 mL). След това кръвните проби се събират, центрофугират се при 3500 r за 15 минути, за да се получи серум, и се съхраняват при -20 градуса. Концентрациите на Т, CRH, ACTH, CORT и кортизол се измерват с комплекти ELISA на плъх съгласно инструкциите на производителя.

2.6.3. Микроскопски наблюдения

Морфологичната структура на тъканта на надбъбречната жлеза се наблюдава чрез HE оцветяване. Надбъбречната тъкан се фиксира в 10% параформалдехид, дехидратира се в етанол, прави се прозрачна чрез разтвор на ксилен, вгражда се по конвенционални методи, нарязва се на резени с дебелина 4 μm, депарафинизира се с разтвор на ксилен, хидратира се с градиент на етанол и след това се оцветява с хематоксилин и еозин разтвор за оцветяване. След като стана прозрачна с ксилен, плаката беше запечатана с неутрална смола и наблюдавана под микроскоп.

2.6.4. Имунохистохимично оцветяване на Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas и FasL протеинова експресия в надбъбречната жлеза

Фиксирани с формалин, вградени в парафин надбъбречни срезове на плъх се депарафинизират и рехидратират след нарязване на дебелина 4 μm. За блокиране на ендогенната пероксидазна активност, срезовете се инкубират предварително в блок с водороден пероксид за 10 min. Срезовете се потапят в 0.01 М цитрат (рН 6,0) и се нагряват до кипене. Процедурата се повтаря след 5-10 минути. След охлаждане срезовете се промиват с PBS (рН 7.2–7.6) 1–2 пъти, оставят се на стайна температура за приблизително 5 минути и се промиват с PBS (рН 7.2–7.6) 2–3 пъти. 5% BSA блокиращ разтвор се добавя при стайна температура и излишната течност върху среза се отърсва 20 минути по-късно. Добавят се разредени първични антитела, специфични за FasTh FasL, Bcl-2ThBax и каспаза-3 (1:100, разредени с PBS) и се инкубират при 37 градуса за 1 час или 4 градуса за една нощ. Срезовете се промиват 2-3 пъти с PBS (рН 7.2-7.6). След това се добавя биотинилиран кози анти-миши IgG и срезовете се сушат при 20-37 градуса за 20 минути и се промиват с PBS (рН 7.2-7.6) 4 пъти за 5 минути. След щателно промиване в PBS, срезовете се инкубират със смес от реагенти А и В за 30 минути, инкубират се с PBS за 45 минути и накрая се проявяват с DAB субстрат (DAKO) за 30 минути, преди да бъдат леко контраоцветени с хематоксилин, дехидратирани, и монтиран.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНОТО УСЕЩАНЕ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Определяне на имунните функции

2.7.1. Изчисляване на индекса на имунните органи

Един час след последното приложение, плъховете се анестезират чрез интраперитонеално инжектиране на уретанов разтвор (20 gTh100 mL), след което далакът и тимусната жлеза се отстраняват и се претеглят веднага в стерилен капак. Тегловните коефициенти на далака или тимуса (%) � тегло на далака или тимуса (mg) Телесно тегло (g).

2.7.2. Откриване на Т-лимфоцитни субгрупи в периферна кръв

Спленоцитите и хемоцитите се инкубират с моноклоналните антитела анти-CD4 (РЕ) и анти-CD8 (FITC) в продължение на 30 минути на тъмно. Добавят се 2 mL еритроцитен лизат и разтворът се смесва чрез завихряне. Разтворът се оставя на тъмно за 10 минути и се центрофугира за 5 минути. Супернатантата се изхвърля и след това разтворът се промива 3 пъти с ледено студен PBS и се ресуспендира в PBS пермеабилизиращ разтвор. Най-малко 10 000 клетки бяха анализирани чрез поточна цитометрия в рамките на 1 час след всяко оцветяване с Mab.

2.7.3. Определяне на нивото на IL-10, IL-6, IL-2, TNF- и IFN-c в серума

Един час след последното приложение, плъховете се анестезират чрез интраперитонеално инжектиране на уретанов разтвор (20 gTh100 mL) и се взема кръв от коремната аорта. Кръвта се центрофугира при 3500 r за 15 минути, за да се получи серум и се съхранява при -20 градуса. Концентрациите на IL-10, IL-6, IL-2, TNF- и IFN-c бяха открити с комплекти ELISA на плъх съгласно инструкциите на производителя.

2.8. Експресия на CaM в тъканите на хипоталамуса и хипофизата

Общата РНК се екстрахира от тъканите на хипоталамуса и хипофизата чрез TRIzol. Обратната транскрипция се извършва върху 10 μL обща РНК съгласно инструкциите на производителя. Равни количества cDNA бяха анализирани чрез qPCR в присъствието на dsDNA-свързващо багрило (Promega, САЩ) и CFX 96 PCR система в реално време (Bio-Rad, САЩ), за да се разгледат различните гени при условията на първоначално активиране при 95 градуса за 10 минути, 40 цикъла на денатурация при 95 градуса за 15 секунди и удължаване на отгряване при 60 градуса за 1 минута.

Праймерите за CaM и -актин са дадени в таблица 1, а -актинът се използва като вътрешна контрола. Всяка проба се нормализира чрез използване на разликата в критичните прагове (Ct) между целевия ген и -актин. Следното уравнение беше използвано за описание на резултата: ΔΔCt � (Ct целеви ген − Ct -актин ген) експериментална група − (Ct целеви ген − Ct -актин ген) контролна група. След това нивата на тРНК на всяка проба бяха сравнени, като се използва изразът 2- ΔΔCt целеви ген. Резултатите от всяка група бяха осреднени (Таблица 3).

2.9. Статистически анализ

Всички данни бяха анализирани с помощта на софтуер SPSS (версия 19.0, SPSS Institute Inc., Чикаго, Илинойс). Разликите между групите бяха анализирани с еднопосочен анализ на дисперсията с повтарящи се измервания (ANOVA). Резултатите бяха изразени като средно ± стандартно отклонение (SD) с помощта на софтуер GraphPad Prism (версия 6.0, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Разлики с P стойност по-малка от 0.05 се считат за статистически значими.

3. Експериментални резултати

3.1. UPLC-QqQ-MSAнализ

За да се постигне най-добро разделяне, пикова форма и кратко време за анализ, хроматографските условия, включително колона, подвижна фаза и градиентна програма, бяха изследвани в нашия предварителен експеримент. Типичните хроматограми с MRM режим са представени на фигура 1.

От таблица 4 можем да видим, че съдържанието на фенилетаноидни гликозиди в WCD се увеличава в сравнение с това на CD, особено за ехинакозид и актеозид, докато съдържанието на иридоиди е намалено в WCD.

3.2. Регламент за функцията на оста HPA

3.2.1. Тест за тегло, температура и сила на задържане

Плъховете от групата MC и експерименталните групи показват симптоми на бъбречно-ян дефицит постепенно след прилагане на кортикостерон. Симптомите, като загуба на тегло, хипотермия, загуба на блясък на косата, увисване, изоставане в реакцията и значително намаляване на консумацията на вода и активността, се подобриха значително в групите CD и WCD. Фигура 2(a) показва промените в теглото. Теглото на всяка от групите лекарства се увеличава, особено в групите CDHD и WCD-HD. Наддаването на тегло в групата MC е най-ниско. Фигура 2 (b) показва температурните промени, които са най-ниски в групата MC, и температурата се повишава в групите WCD-HD, WCD-MD и WCD-LD.

Фигура 2(c) показва, че силата на задържане се е увеличила за групата BC и всяка от експерименталните групи, а групата WCD-MD е най-висока, което демонстрира, че признаците на слабост, предизвикани от бъбречно-ян дефицит, се подобряват след прилагане.

3.2.2. Нива на Т, CRH, ACTH, CORT и кортизол

Фигура 3 показва, че в сравнение с тези от групата на BC, нивото на T, CRH, ACTH и CORT в серума на плъхове намалява (P < 0.01) и нивото на кортизол намалява (P < 0.05) в групата MC. В сравнение с тези на групата MC, нивото на T в групите WCD-HD и WCD-MD се повишава (P < 0.01), нивото на CRH в WCD-LD, Групите WCD-MD и WC се подобряват (P < 0.01), съдържанието на ACTH се повишава в групите CD-HD, WCD-MD и WCD-HD (P <0,01), нивото на CORT е повишено в CD-MD, WCD-MD и WCD-HD групите (P <0.01) и повишени в CDHD и WCD-LD групите (P <0.05), а нивото на кортизол се повишава във всяка от лекарствените групи.

3.2.3. Резултати от наблюдение с микроскоп

Тъканта на надбъбречната жлеза може да бъде разделена на кортикален слой и медулен слой. Кортикалните слоеве включват глобуларни, пакетни и ретикуларни слоеве. Клетките съдържат повече липиди, а медуларният слой се състои предимно от феохромоцитомни клетки и малко количество фиброзна тъкан. Както е показано на Фигура 4, открихме, че всичко е нормално в групата с BC, докато в групата с MC надбъбречната кора има очевидна хиперплазия, клетъчна атрофия и нарастваща плътност. Луковичната ивица се удебели, а полупрозрачната фасцикуларна зона, тясната зона reticularis и по-малките клетки показаха неравномерно оцветяване и капилярна конгестия. В PC групата кортикалните и медуларните граници бяха видими. Клетките на глобуларните и снопчетата са подредени равномерно и морфологичната структура е възстановена. Същото по-добро възстановяване се наблюдава в групите с WCD и ефектите в групата с WCD-MD са по-добри от тези на групите с WCD-HD и WCD-LD. Морфологията на надбъбречната жлеза в CD групите не е толкова добра, колкото тази в WCD групите.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%