Проучване за ефекта на актаозид (активна съставка в Cistanche Deserticola) върху NAFLD чрез индуциране на автофагия

Резюме:

 

Цел:Да се ​​изследва функцията за индуциране на автофагия на активна съставка Actaoside (ACT) в Cistanche Deserticola и неговия ефект върху безалкохолното мастно чернодробно заболяване (NAFLD).

МетодиЗа да приемате ехинакозид и да действате като изследователски обекти, 1 0 0 μmol/L ACT и ехинакозид (ECH) се комбинират с инхибитор на автофагия-лизозома Блеомицин А1 за интервенционно лечение. Имуноблотирането на протеин се използва за откриване на относителното ниво на експресия на микротубула на протеина на маркера на автофагия, свързана с протеин 1 на лека верига 3 (LC 3- II). HepG2 клетките се намесват с различни концентрации на ACT in vitro и клетъчната жизнеспособност се открива с помощта на метода на тетразолиевата сол. В рентгенова интервенция на HepG2 клетки с различни концентрации на ACT, комбинирани с балофлоксацин А1, и откриване на LC 3- II протеин нива на експресия на протеин, използвайки нивата на експресия на протеин, използвайки нивата на експресия на протеина, използвайки нивата на протеинова имуноблотиране. Модел на NAFLD, конструиран in vitro с лекарствена интервенция, се използва за оцветяване на липидни капчици, използвайки метод на оцветяване на масло от червено О и откриване на нива на вътреклетъчни триглицериди. Наблюдавайте локализацията на LC3 протеин и липидни капчици чрез имунофлуоресценция. Актът на резултатите може значително да индуцира автофагия в клетките на HepG2, а нивото на експресия на LC 3- II протеин е значително увеличено в сравнение с контролната група (третирана само с ACT) (1.36 ± 0. 11, {{21}. съответно), със статистическа значимост (P0.05). 50 μmol/L действа значително индуцирана автофагия в клетките на HepG2 и нивото на експресия на LC 3- II протеин е значително повишено (1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18, съответно). Нивото на TG на HepG2 клетките в групата на ACT интервенция (19.11 ± 1,68) е значително по -ниско от това в групата на модела на NAFLD in vitro (34,15 ± 1,90), а разликите са статистически значими (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Ключови думи:Безалкохолно мастно чернодробно заболяване;Cistanche Deserticola;Актаозид; Автофагия

 

TCM Herb Cistanche за лечение на безалкохолно мастно чернодробно заболяване (NAFLD)

Щракнете върху снимката, за да получите повече подробности

 

През последните няколко десетилетия, безалкохолни мазниничернодробно заболяване(Nafld) се превърна в най -често срещанияХронично чернодробно заболяване, с глобално разпространение на приблизително 25% от възрастното население и се счита за тясно свързано с метаболитен синдром [1]. Въпреки че вероятността за усложнения, свързани с черния дроб при пациенти с NAFLD, е по-малка от 10%, NAFLD е рисков фактор за заболявания, свързани с черния дроб, като цироза и първичен рак на черния дроб, което налага огромна икономическа тежест на пациентите [2-5]. Въпреки нарастващото внимание, обърнато на NAFLD, NAFLD като важно хронично заболяване не получи достатъчно внимание. Следователно, по-нататъшното задълбочено разбиране на патогенезата на NAFLD и търсенето на ефективни стратегии за лечение станаха спешни проблеми, които трябва да бъдат решени [6-7].

Последните проучвания показват, че клетъчната автофагия играе важна роля в чернодробната физиология и патология [8]. Автофагичната дисфункция или дисрегулация е свързана с различни чернодробни заболявания каточернодробно заболяване, свързано с алкохол[9], NAFLD [10], безалкохолен стеатохепатит [11] и хепатоцелуларен карцином [12]. Патологичните характеристики на NAFLD са прекомерно отлагане на триглицериди (TG) и други неутрални липидни капчици (LD) в хепатоцити при безалкохолна стимулация. За черния дроб двата основни пътя, регулиращи катаболизма на тези LDS, са липолиза и автофагия.
Пътят на липолизата се регулира от цитоплазмени неутрални липази, като хормона-чувствителна липаза и мастна TG липаза. В съответния път на липоаутофагия LDS може да бъде избирателно поет чрез директно набиране на протеини, свързани с автофагия, за да се образуват автофагозоми, а след това LDS, капсулиран от автофагозоми, се доставят допълнително до лизозоми и се разлагат от киселинна липаза в лизозомите. Следователно, активирането на липоавтофагия в хепатоцитите се превърна в ефективна стратегия за превенция и лечение на NAFLD.
Cistanche Deserticola е скъпоценно китайско билково лекарство, което се използва широко в клиничната практика в традиционните формули на китайската медицина. В същото време тя отдавна се използва като добавка за здравословна храна. Cistanche Deserticola съдържа различни биоактивни съставки, най -важните от които са Cistanche Deserticola фенилетанол гликозиди. Съобщава се, че представители на фенилетаноидни гликозиди, ехинакозид (ECH) и вербаскозид (ACT) имат много важни биологични активности, като антиоксидант, невропротективни, имуномодулиращи и чернодробни защита [13]. По отношение на чернодробната защита, проучванията са установили, че ECH може да защити черния дроб, като намали възпалителните медиатори, инхибира трансформиращия растежен фактор и намалява нивото на експресия на гени, свързани с чернодробната фиброза. ACT има значителен защитен ефект върху увреждането на черния дроб, индуцирано от лекарства, като алкохол, въглероден тетрахлорид и липополизахарид. ACT намалява оксидативния стрес, причинен от токсични химикали, премахва реактивния кислород, натрупан в черния дроб, и намалява концентрацията на малодиалдехид. В същото време той значително увеличава активността на супероксид на черния дроб и намалява съдържанието на глутатион и значително подобрява хистопатологичното увреждане на черния дроб и апоптозата. Въпреки това, няма съответния доклад за литературата дали фенилетаноидните гликозиди на Cistanche Deserticola участват в процеса на автофагия при упражняване на чернодробна защита. Въз основа на това това проучване използва конвенционални методи на клетъчна биология и in vitro клетъчен модел, за да изследва предварително ефекта, предизвикващ автофагия на фенилетаноидните гликозиди на Cistanche Deserticola и да изследва възможните си фармакологични функции, като се стреми да предостави научна основа за бъдещо развитие на лекарствата.

 

1 Материали и методи

1.1 Материали

1.1.1 Изследователските субекти ECH и ACT са използвани като изследователски субекти.

1.1.2 Materials HepG2 cells were purchased from Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (batch number: B21209) and ACT (batch number: B20715, HPLC purity Greater than or equal to 98%) were purchased from Shanghai Yuanye Biological Company, DMEM high glucose medium (batch number: SH30243.01), phosphate buffer, and Trypsin бяха закупени от Hyclone Company, САЩ, Fetal Bovine Serum (партиден номер: 04-002-1 A) е закупен от BI Company, Израел, пеницилин/стрептомицин (партиден номер: SV30010.01) е закупен от Hyclone Company, САЩ, MTT (Batch Number: M8180) Powder е закупен от Solebao Company, Beach Number: M8180) Powder е закупен от Solebao Company. TG (партиден номер: BC0625) Комплект за откриване е закупен от Solebao Company, Пекин, Китай, маслено червено O (номер на партида: o 0625-100 g), диметил сулфоксид (номер на партида: BCBZ1685) са закупени от Sigma-Aldrich, САЩ; Автофагичен-лизозомният инхибитор Бафиломицин А1 (Bafa1, номер на партида: TLRL-BAF1) е закупен от Invitrogen, САЩ; Автофагичният активатор рапамицин (номер на партида: S17098) е закупен от Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Китай; Микротубула-асоциирана протеин 1 светлинна верига 3 (LC3, номер на партида: L7543, видове: заек, съотношение на разреждане: 1: 1 000) и -актин (номер на партидата: ZRB1312, видове: заек, съотношение на разреждане: 1: {5 000)) Антибодиите бяха закупени от Sigma-Oldrich, САЩ; HorserAdish Peroxidase, маркирано в вторично антитяло (номер на партида: 4010-05, видове: козе анти-заек, съотношение на разреждане: 1: 1 000) е закупен от южната част на биотехнологията, САЩ, алекса, флуоресцентна флуоресцентна белязана вторично антитяло на антитяло (номер на лот: 43328, дължина на вълната: 546, LOT (LOT BUITEEC Sigma-Aldrich Company, САЩ и Bodipy 493/501 (номер на лот: D3922) е закупена от Invitrogen Company, САЩ.

 

1.2 Методи

1.2.1 Клетъчна култура

Клетките HepG2 се култивират в модифицираната орел с висока глюкозна среда на Dulbecco, съдържаща 10% фетален говежди серум, 100 U/ml пеницилин и 100 ug/ml стрептомицин в 37 градуса, 5% въглероден диоксид. Когато клетъчната сливане достигна 85%, се извършват субкултура, плаване, интервенция и други операции.

 

1.2.2 Откриване на имуноблотиране на протеин

1.2.2.1 ACT и ECH лечение

LC 3- ⅱ Нивото на експресия на протеина в клетките HepG2 Bafa1, като инхибитор на протонната помпа, може да причини LC 3- ⅱ протеинът да се агрегира в големи количества в клетките, като по този начин усилва способността за индукция на автофагията. Следователно, комбинираното използване на BAFA1 може да се използва като система за мониторинг на автофагия за оценка на способността за индукция на автофагия. HepG2 клетките във фазата на растеж на логаритмията се прехвърлят в 3,5 см ястия с клетъчна култура за култура за една нощ. 100 μmol/L ACT, ECH и BAFA1 се използват за интервенция в продължение на 12 h. Клетките се промиват с предварително охладен разтвор на фосфатен буфер (PBS) и веднага се лизират в RIPA протеинов лизисен буфер за 10 минути. Супернатантата се центрофугира и общата концентрация на протеин се определя с помощта на комплект за анализ на концентрация на протеин на бицинхонинова киселина. След количествено определяне с буфер на натриев додецил сулфат, пробата се нагрява на 95 градуса в продължение на 10 минути, за да се денатурира протеина. Тогава 30 μl от пробата се приема с микропипета и се с електрофореза върху полиакриламиден гел.
След електрофорезата протеинът се прехвърля от гела в нитроцелулозна мембрана, блокирана с 1 0% мляко за една нощ, инкубирано със специфично първично антитяло при стайна температура в продължение на 1 час, промива се с фосфатен буфер, съдържащ 0,5% тритон, и инкубиран със специфичен вторичен антитяло при стайна температура в продължение на 1 H. Методът ECL се използва за развитие на цвета. Те бяха зададени като празна контролна група, Rapamycin Group, ECH Group, ACT Group, Rapamycin+Bafa1 Group, ECH+BAFA1 Group и Act+Bafa1 Group.

 

1.2.2.2 Различни концентрации на ACT се намесиха нивото на експресия на LC 3- ⅱ протеин в HepG2 клетки

Логаритмичната фаза на растеж HepG2 клетките се прехвърлят в 3,5 см клетъчни култури за култура за една нощ, а 25, 50 и 100 μmol/L ACT, комбинирани с BAFA1, се използват за интервенционно лечение в продължение на 12 часа, а нивото на експресия на LC {{8} ⅱ ⅱ протеин се открива чрез имуноблотиране на протеин. Контролната група (CON група, празен контрол), гладна група (STA група, гладуване на лечение HepG2 клетки), 25, 50 и 100 μmol/L ACT група и BAFA1 в комбинация с 25, 50 и 100 μmol/L ACT група.

1.2.3 MTT метод за откриване на скоростта на преживяемост на HepG2 клетки, третирани с различни концентрации на ACT в продължение на 24 и 48 h
HepG2 клетките във фазата на растеж на логаритмията се инокулират в 96- ямкова плоча с умерена плътност на инокулация и се култивират в инкубатор в продължение на 12 часа. 2 0, 40, 60, 80 и 100 μmol/L ACT бяха добавени за 24 и 48 h. 0,5 mg/ml MTT разтвор се добавя в тъмна среда и се инкубира в инкубатор. След 4 h, супернатантата се изхвърля, към всяка ямка се добавя 100 μl диметил сулфоксид и клетките се разклащат в шейкър с постоянна температура на 37 градуса в продължение на 10 минути. Стойността на оптичната плътност (OD) при дължина на вълната 490 nm се открива чрез ензимен маркер и се изчислява скоростта на оцеляване на клетките.

 

1.2.4 in vitro изграждане на клетъчен модел NAFLD

Определено тегло на палмитиновата киселина (PA) се претегля и напълно се разтваря в определен обем изопропанол за приготвяне на 100 mmol/L PA разтвор, който след това се разделя и съхранява в -20 градус хладилник за по -късна употреба. Разтворът на PA Stock се разрежда до 100 μmol/L, като се използва пълна културна среда и се добавя 1% мастен киселинен серумен албумин. Клетките се инкубират на 37 градуса в продължение на 3 часа, за да се подготвят индукционния разтвор. Клетките на HepG2 във фазата на растеж на логаритмията се прехвърлят в 3,5 cm клетъчна култура при подходяща плътност за културата за една нощ и след това се използва подготвеният индукционен разтвор за интервенция.

 

1.2.5 ACT интервенция NAFLD in vitro клетъчен модел TG откриване и оцветяване на маслено червено O

 

1.2.5.1 Откриване на TG

HepG2 клетките във фазата на растеж на логаритмията се прехвърлят в 3,5 см клетъчна култура за култура според празната контролна група, моделна група и ACT интервенционна група. Моделната група е индуцирана със 100 μmol/L PA индукционен разтвор и ACT интервенционната група се индуцира със 100 μmol/L PA индукционен разтвор и 50 μmol/L ACT се добавя едновременно. Времето за интервенция беше 24 часа. Gently remove the old culture medium, slowly wash the cell surface with pre-cooled PBS once, add 100 μL/dish of pre-cooled RIPA lysis solution, fully lyse on ice for 15 min, centrifuge at 4 degree and 12 000 r/min for 10 min, collect the supernatant, take 10 μL for enzymatic detection of TG level, take another 10 μL for protein content detection, detect TG according to the Инструкции за комплект TG и накрая коригирайте нивото на TG на mg протеин.

1.2.5.2 маслено червено o оцветяване

HepG2 клетките във фазата на растеж на логаритмията се прехвърлят в 3,5 cm културно ястие, покрито със стерилно покритие за култура за една нощ. 100 μmol/L PA индуцира клетките да образуват липидни капчици. В същото време се добавя 50 μmol/L ACT за интервенция в продължение на 24 h.
The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed with 4% formaldehyde at room temperature for 10 min, washed the cell surface with PBS, added the prepared Oil Red O staining working solution, stained at room temperature in the dark for 15 min, aspirated the Oil Red O staining solution, washed the excess staining solution with double distilled water, rinsed with 60% isopropanol, washed with double distilled water, and Запечатан и сниман под микроскоп.

 

1.2.6 Имунофлуоресцентно наблюдение на автофагозоми и липидни капчици след лечение на ACT

HepG2 клетките във фазата на растеж на логаритмията се прехвърлят в 3,5 cm културно ястие, покрито със стерилно покритие за култура за една нощ. 1 0 0 μmol/L PA се използва за индуциране на образуването на липидни капчици в клетките. В същото време се добавя ACT за интервенционно лечение в продължение на 24 часа. The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed at room temperature for 10 min with 4% formaldehyde, permeabilized at room temperature for 15 min with a permeabilization buffer containing 0.1% saponin, blocked at room temperature for 1 h with goat serum, incubated at room temperature for 1 h with LC3-specific primary antibody, washed 3 times with PBS, and added със специфично флуоресцентно маркирано вторично антитяло, инкубирано при стайна температура и далеч от светлина в продължение на 1 час. След инкубацията на антитялото, слайдовете се промиват 3 пъти с PBS, противодействат на липидната капка специфична за сонда Bodypy 493/503 при стайна температура в продължение на 10 минути, промива се с PBS и се запечатва с уплътняваща среда против избледняване, изсушена на въздух в тъмното, наблюдавано с лазерен конфокален микроскоп и записан. Бяха поставени празната контролна група, групата за лечение на рапамицин и ACT интервенционната група.

 

1.3 Статистически анализ

За анализ на данни е използван SPSS25. 0. Количествените данни бяха изразени като x ± s. Използван е еднопосочен анализ на дисперсия и LSD-T тест. P<0.05 was considered statistically significant.