Stx2 индуцира диференциална експресия на ген и нарушава гените на циркадния ритъм в проксималния тубул

Резюме: Ешерихия коли, произвеждаща шига токсин(STEC) причинява проксимални тубулни дефекти в бъбрека. Въпреки това, факторите, променени от Shiga токсин (Stx) в проксималните тубули, все още не са показани. Ние определихме Stx рецептор Gb3 в миши и човешки бъбреци и потвърдихме рецепторната експресия в проксималните тубули. Stx2-инжектира тъкани от бъбрек на мишка иStx2-третирани човешки първични бъбречни проксимални тубулни епителни клетки(RPTEC) бяха събрани и беше извършен анализ на микрочипове. Сравнихме миши бъбрек и RPTEC масиви и избрахме общи 58 гена, които са диференциално експресирани спрямо контрола (0 h, без третиране с токсини). Установихме, че най-силно експресираният ген е GDF15, който може да участва в Stx2-индуцираната загуба на тегло. Гени, свързани с докладвани по-рано Stx2 дейности, като src киназа Да, активиране на пътя на фосфорилиране, разгънат протеинов отговор (UPR) и риботоксичен отговор на стрес (RSR), показват диференциални експресии. Освен това, гените на циркадния часовник са диференциално експресирани, което предполага Stx2-индуцирано нарушение на бъбречния циркаден ритъм. Регулираният от циркадния ритъм проксимален тубуларен Na+ -глюкозен транспортер SGLT1 (SLC5A1) беше регулиран надолу, което показва функционално влошаване на проксималните тубули, и мишките развиха глюкозурия, потвърждаваща дисфункция на проксималните тубули. Stx2 променя генната експресия в миши и човешки проксимални тубули чрез известни дейности и новоизследвани нарушения на циркадния ритъм, което може да доведе до дисфункции на проксималните тубули.

Ключови думи:Шига токсин тип 2 (Stx2);бъбречен проксимален тубул; мишка; човешки бъбречни проксимални тубулни епителни клетки (RPTEC); микрочипове; циркаден ритъм

Ключов принос:Бяха анализирани диференциално експресирани гени от Stx2-третирани миши бъбреци и човешки първични проксимални тубулни клетки. В допълнение към известните преди това гени, засегнати от Stx2-, е показано, че свързаните с циркадния ритъм гени променят своята експресия и оказват влияние върху проксималната тубулна функция.

1. Въведение

Ешерихия коли, произвеждаща шига токсин(STEC) инфекцията причинява тежки симптоми на хемолитичен уремичен синдром (HUS), който се определя от триадата на остра бъбречна недостатъчност, тромбоцитопения и хемолитична анемия [1]. Смята се, че шига токсините (Stxs) играят основна роля при увреждането на клетките при това инфекциозно заболяване. Характерната бъбречна хистопатология на HUS включва гломерулни и тубулни увреждания като отлагане на капилярен фибрин в гломерулите и съответно тубулна некроза [1,2]. По-ранна поява на дисфункция в проксималните тубули на STEC-инфектирани пациенти е докладвана чрез анализ на урина. Проксималните тубулни функционални маркери на уринатаN-ацетил глюкозаминидаза(NAG) и 2 микроглобулин (2MG) от урината в остър стадий на STEC O157- или O111-свързани пациенти с HUS бяха измерени като силно повишени, което предполага ранна проксимална тубулна дисфункция [3].

Stxs, включително Stx2, се състоят от една А субединица и пет В субединици (A1B5 токсин), в които А субединицата притежава ензимна активност, депуринираща аденин 4324 от 28S rRNA на 60S рибозомната субединица, докато В субединиците са необходими за свързване на клетките гостоприемници чрез глоботриаозилцерамид (Gb3). Има няколко известни влияния, които Stxs оказват върху клетките. (I) Чрез свързване към неговия рецептор Gb3, токсинът предизвиква сигнална трансдукция чрез Src-семейство киназа Да [4,5]. След свързване с рецептора, Stxs се интернализират в клетката чрез ендоцитоза и се транспортират ретроградно до ER. Stx преминават през ендозомата и апарата на Голджи, където А субединицата се разцепва между каталитични А1 и С-крайни А2 фрагменти от фурин [6], въпреки че А1 и А2 фрагментите все още са свързани с дисулфидна връзка. Токсинът достига ER и дисулфидната връзка може да бъде намалена; след това се освобождава A1 фрагмент от холотоксин [7,8]. Това е, когато влиянието от (II) ER-стрес се случва с разгънати имитиращи протеини токсинови фрагменти, които предизвикват разгънат протеинов отговор (UPR). И двете субединици А и В са способни да свързват Bip, което е показателно за предизвикване на ER стрес [9,10]. Разцепеният A1 фрагмент се премества в цитоплазмата и пречиства аденин от 28S rRNA до (III) инхибиране на протеиновия синтез. Модификацията Stxs, причинена от 28S rRNA, индуцира (IV) риботоксичен стрес отговор (RSR), който активира низходяща сигнална каскада [11]. Известно е, че влияния (II) и/или (IV) индуцират (V) специфична генна транскрипция, водеща до секреция на цитокини [12]. Също така, (II) и (IV) участват в (VI) Stxs-индуцирана апоптоза [13–15].

In vitro експерименти, използващи човешки проксимални тубули и in vivo миши модели, силно свързват проксималните тубулни увреждания със Stxs. Както първичните култури, така и клетъчните линии на човешките проксимални тубули са силно податливи на Stxs и показват освобождаване на цитокини и клетъчна смърт, включително апоптоза [16–20]. Човешки първични бъбречни проксимални тубулни епителни клетки (RPTECs) експресират рецептора Gb3, силно са податливи на Shiga токсини и са използвани в много статии за анализ на биологични реакции като инхибиране на протеиновия синтез, производство на цитокини и индуциране на апоптоза [17,20] . Мишки, инжектирани с шига токсин тип 1 (Stx1), показват глюкозурия, което показва понижена реабсорбция на глюкоза от проксималните тубули [21]. Те предполагат токсичност на Stxs за проксималните тубули както in vitro, така и in vivo. При STEC-инфектирани модели на мишки, честите находки в хистопатологията са некроза на тубулни епителни клетки и отлепени клетки в лумена на проксималните тубули [22–24]. Инжектираните пречистени Stx (или Stx1, или Stx2) мишки също показват лющене на проксималните тубули с относително непокътнати ядра [25–27].

Въпреки че уврежданията на проксималните тубули, свързани със Stx инжекция или STEC инфекция, са описани функционално и хистологично, генните мишени, участващи в увреждане на проксималните тубули, все още не са показани.

Тук анализирахме генни експресии в Stx2-инжектирани миши бъбреци и Stx2-третирана човешка първична бъбречна проксимална тубулна епителна клетъчна култура (RPTEC), за да покажем генни изменения, свързани с проксималните тубули, индуцирани от Stx2.

2. Резултати

2.1. Stx2-Инжектирана бъбречна патология на мишка

За идентифициране на миша бъбречна патология, свързана със Stx{{0}}, срезове от бъбречна тъкан от мишки, инжектирани със Stx2-, бяха оцветени с периодична киселина-Шиф (PAS). Ясно силно розово петно ​​от луминалната страна на тубулните епителни клетки показва гликокаликс на четковидната граница, което е характерно за проксималните тубулни клетки. Ние определихме клетките/ядрата извън гликокаликса (в луминалното пространство) като отделени от съседните клетки и базалните мембрани (т.е. отлепени клетки). На Фигура 1B (8 часа след Stx2), C и D (48 часа след Stx2), отрязаните клетки с относително непокътнати ядра са показани със стрелки. Също така наблюдавахме клетъчни остатъци в проксималния тубуларен лумен (стрелки на Фигура 1). След прилагане на Stx2 тези лезии се появяват доста ясно, докато при 0 h (Фигура 1А, без Stx2) те са незначителни.

Фигура 1. Stx2 индуцира отделянето на проксималните тубулни клетки в миши бъбрек. Показани са петна с периодична киселина на Шиф (PAS) на инжектирани Stx2- срезове от миши бъбрек. (A) 0 h (наивен), (B) 8 h и (C) 48 h след инжектиране на Stx2. Стрелките показват отделящи се проксимални тубулни клетки. Стрелките показват клетъчни остатъци. Увеличено поле в рамките на (C) е показано в (D) с отлепени клетки, насочени със стрелки. Площадките в (A–C) показват 50 µm. Скалата в (D) показва 10 µ

2.2. Експресия на Gb3 в миши и човешки бъбреци

2.2.1. Експресия Gb3 на бъбречната кора на мишка

Тъй като проксималните тубулни клетки показват хистологични увреждания от инсулт на Stx2, тествахме експресията на глоботриаозилцерамид (Gb3) на Stx2 рецептор в миши бъбречен кортекс заедно с проксимален тубуларен маркер аквапорин -1 (AQP1). Както е показано на Фигура 2, AQP1-позитивните клетки показват Gb3 положителност най-вече от луминалната страна на клетките (клетките са маркирани със затворени върхове на стрелки, докато лумините са маркирани със звездички). Ние също така наблюдавахме, че AQP1 отрицателните тубулни Gb3 петна вероятно събират канални клетки (Фигура 2 отворена стрелка), както се съобщава [28]. Интензитетът на Gb3 оцветяване е по-силен в AQP1 (-) клетките, но броят на този тип тубули е по-малък в сравнение с Gb3/AQP1 двойно положителни проксимални тубули в кората. CD31-позитивните ендотелни клетки са Gb3 отрицателни в миши бъбрек. Изотип-съвпадаща контрола на антитяло за Gb3 (плъши IgM) се използва като отрицателна контрола. IgM на плъх не реагира с бъбречна тъкан на мишка (Фигура S1)

2.2.2. Експресия Gb3 на човешки бъбречен кортекс

В човешката бъбречна тъкан Gb3 също е положителен в AQP1-позитивните проксимални тубули (Фигура 3, затворени върхове на стрелки). Локализацията на Gb3 в проксималните тубулни клетки е по-силна от луминалната страна. Ние също така наблюдавахме AQP1 (-) Gb3 (+) клетки (Фигура 3, отворени върхове на стрелки), както направихме в миша тъкан. Човешки ендотелни клетки експресират Gb3 (CD31/Gb3 двойно положителен, Фигура 3, звездичка). Изотипни контролни срезове с плъши IgM не показват положителна реакция в човешка бъбречна тъкан (Фигура S2).

2.3. Анализ на микрочипове

Тъй като както миши, така и човешки проксимални тубулни епителни клетки са Gb3 положителни, това предполага, че този тип клетки е повлиян директно от Stx2. За да определим засегнатите от Stx2-гени както в миши, така и в човешки проксимални тубулни клетки, ние извлякохме обща РНК от бъбреците на Stx2-инжектирани мишки и Stx2-третирани човешки първични RPTECs и анализирахме генна експресия чрез микрочипове

2.3.1. Диференциално експресирани гени както в миши бъбрек, така и в RPTEC

Избрани са диференциално експресирани гени (DEGs), които са общи както за миши бъбреци, така и за RPTEC. Основата за избор на общи DEG е, че (1) гени с log2-кратна промяна (срещу 0 h) повече от 1 или по-малко от -1 както в миши бъбрек, така и в RPTEC микрочип поне в един- времева точка и (2) разпределение на log2-кратна промяна на ген пасва на кубични криви, а не на квадратни криви, за да се приспособят по-добре пиковете на генната експресия в средата на времевия курс в бъбречния микрочип. С двата критерия по-горе, ние избрахме 58 общи гена между Stx2-третирани миши бъбреци и човешки RPTEC (Фигура 4А). Моделите на експресия на тези 58 гена в бъбрека на мишката са показани в топлинна карта (Фигура 4B). Повечето гени бяха регулирани нагоре в по-късните часове след инжектирането на Stx2; въпреки това, някои гени имат по-ранни модели на експресия. Гени, които имат повече от 1 промяна в log2-кратно, бяха изброени за всяка времева точка (Таблица 1).

Фигура 4. Анализ на микрочипове. (A) Сред гените, анализирани чрез микрочипове, 147 гена (оградени в зелено) и 4013 гена (оградени в червен кръг) от Stx2-третиран бъбрек на мишка и RPTEC, съответно, бяха открити като притежаващи log{ {4}}кратна промяна по-малка от -1 или повече от 1. Гените, които са били променени чрез третиране със Stx2 срещу 0 h в двата микрочипа (често срещани диференциално експресирани гени/DEG), са общо 58 (червена и зелена припокриваща се област). (B) Топлинната карта на общите 58 гена е показана във времевата линия за вземане на проби от бъбрек на мишка. Z е равно на 0 обозначава средна стойност от log2-кратна промяна на ген и отразява тенденция на генна експресия. По този начин зеленикавият цвят представлява по-ниска стойност от средната за определен ген в ред, докато червеникавият цвят представлява промяна над средната. Log2-кратните данни на 58-те гена от PBS-инжектирания набор от данни за 72 часа в сравнение с 0 часа са представени като таблица S3 за справка. (C) Показана е лентовата графика за обогатяване на Metascape GO. Оста X показва -log10 p стойности на обогатени GO термини в 58 общи DEG, че по-голям брой от обогатения GO термин е по-вероятно подходящ за системата. Показани са първите 20 обогатени GO термина. (D) STRING анализ на 58 общи DEG е показан в шестте най-свързани/свързани клъстера. Сферичните цветове обозначават гени, принадлежащи към един и същи клъстер. Връзките на действията между гените са показани в кодиран по цвят и край форма начин. ENSG00000279576 вече е кодиран като ENSP00000485396, което обозначава човешкия идентификатор на ген MALAT1.

За да анализираме функционалността на обичайните DEG, използвахме платформата Metascape. Той присвоява термини на генната онтология (GO), които се състоят от молекулярна функция, клетъчен компонент и биологичен процес, на избрани гени. Ние депозирахме общите 58 DEG в Metascape и получихме топ 20 термина GO, в които принадлежат тези DEG (Фигура 4C). GO термините са изброени със съответните гени в таблица S1. За да видите списък с гени във всеки GO термин, показан на Фигура 4C, моля, вижте Таблица S2 Обогатяване на Metascape. GO термините, свързани с клетъчна смърт, възпаление и сигнални каскади, бяха класирани в топ 20, както се очакваше; обаче, циркадният ритъм привлече вниманието като нов GO термин. Известни връзки на общи гени бяха показани с STRING анализ (Фигура 4D). В този анализ гените бяха групирани в шест различни групи, които бяха отчетени със силна връзка на свързване, влияния (катализа, активиране или инхибиране), както и ко-експресия на гени.

2.3.2. Тенденция на генната експресия

Следи от няколко генни експресии са показани в графики с ос x за времето (h) след инжектирането на Stx2 и оста y за log2-кратна промяна спрямо 0 h (Фигура 5). По този начин стойността на оста y, равна на 1, означава 2-кратна промяна спрямо 0 h израз.

Фигура 5. Диференциално експресирани гени с времева линия за вземане на проби от мишка. (A) Показани са модели на експресия на PDK4 и CEBPB иРНК. (B) незабавни-ранни гени. (C) Експресии на матрицелуларни протеини CYR61 (CCN1) и CTGF (CCN2). (D) Показани са UPR-свързани гени DDIT3 (CHOP, GADD153), DDIT3 свързващ партньор CEBPB и фактор на отрицателна обратна връзка PPP1R15A (GADD34). (E) Показани са транскрипционни фактори DDIT3 (CHOP, GADD153) и ATF3 и GDF15, които се регулират транскрипционно от тези фактори. (F) Показани са UPR- и RSR-свързани гени. (G) EDN1 във връзка с UPR гени са начертани. (H) Ранните пикове на EDN1 и EGR1 и следващият пик на PER1 са показани с по-късно постепенно увеличение и на трите гена. (I) Гените от Фигура 4D лилав клъстер са гени, свързани с циркадния ритъм. (J) Показани са циркадните основни гени PER1, Arntl (BMAL1), Cry1 и Clock. (K) Показани са PER1 и бъбречни гени, регулирани от циркадния часовник. (L) Показани са възпалителни гени с гени, свързани с пътя на NF-kB. За да видите отделни точки от данни за log2, моля, вижте допълнителна фигура S4. Фигура S5, показваща среден log2 със стандартни отклонения, е представена като референция.

Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон:+86 15292862950

Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ВЗЕМЕТЕ НАТУРАЛЕН ОРГАНИЧЕН ЕКСТРАКТ ОТ ЦИСТАНША С 25% ЕХИНАКОЗИД И 9% АКТЕОЗИД ПРИ БЪБРЕЧНИ ИНФЕКЦИИ