Потискане на свързаните с възпаление бъбречни увреждания след трансплантация с помощта на новия PrC-210 чистач на свободни радикали при плъхове
Mar 18, 2022
Торстен Р. Гьош 1, Нанси А. Уилсън2, Weifeng Zeng2, Брет М. Верховен2, Weixiong Zhong2,Мая М. Кумбе Гитър3и Уилям Е. Фал1,3,*
Резюме:
Алографтбъбректрансплантация, която задейства клетъчно- и антитяло-медиирано отхвърляне на гостоприемникабъбрек, е основен фактор за увреждане на бъбреците по време на трансплантация. Тук попитахме дали PRC-210 ще потисне увреждането, наблюдавано при алографтни бъбречни трансплантации. Бъбреците на кафяв норвежки (BN) плъх се перфузират in situ (UW разтвор) със или без добавени 30 mM PrC-210 и след това веднага се трансплантират в плъхове Lewis (LEW). 20 часа по-късно бяха анализирани трансплантираните BN бъбреци и LEWrat плазма.Бъбрекхистология и бъбречни/серумни нива на няколко цитокини, свързани с възпалението, бяха измерени, за да се оцени свързаната с несъответствие бъбречна патология и защитната ефикасност на PrC-210. Двадесет часа след алографтните трансплантации: (i) значително хистологично увреждане на бъбречните тубули и мононуклеарна възпалителна клетъчна инфилтрация се наблюдават в алографтни бъбреци; (ii)бъбрекфункционалните показатели (креатинин и BUN) са значително повишени; (iii) бяха наблюдавани значителни промени в ключовите цитокини, т.е. TIMP-1, TNF-алфа и MIP-3A/CCL20, и нивата на активирана от бъбреците каспаза. В PRC-210-третирани бъбреци и реципиентни плъхове, (i) хистологичното увреждане на бъбреците (Banff Scores) и мононуклеарната инфилтрация бяха намалени до нетретирани фонови нива; (ii) креатининът и BUN са значително намалени; и (iii) промените в активираната каспаза и цитокини бяха значително намалени, някои на заден план. В заключение, резултатите предполагат, че PrC-210 може да осигури широко приложима органна защита при много състояния на алографтна трансплантация; може да защити трансплантираните бъбреци по време и след всички етапи от процеса на трансплантация – от донорство на органи, през транспортиране, повторно имплантиране и следоперативно възпаление – за да минимизира острото и хроничното отхвърляне.
Kейwords: бъбрекалографт; отхвърляне на бъбреците; исхемия
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com
мака женшен цистанче
1. Въведение
Крайният стадий на бъбречна недостатъчност причинява повече от 1,2 милиона смъртни случая годишно по света [1].Бъбректрансплантацията е предпочитаното лечение за пациенти с краен стадий на бъбречно заболяване. Всяка година по света се извършват над 90000 бъбречни трансплантации.
Процесът на трансплантация, сам по себе си, предизвиква значително клетъчно и органно увреждане набъбрек, което намалява дълготрайното оцеляване на органа. Трите основни увреждания на бъбрека по време на алографтна трансплантация са (i) увреждане, предизвикано от реактивни кислородни и азотни видове (ROS и RNS) по време на студена исхемия („хладилно съхранение) [2], (ii) увреждане, предизвикано от ROS при имплантиране („повторно перфузионно увреждане“) [3], и (iii) възпаление след алотрансплантация, което задейства вродения имунен отговор и антитяло-медиирано отхвърляне (ABMR) [4].
Неутрофилите и макрофагите мигрират в увредения трансплантант в рамките на 6 часа от реперфузията и стимулират синтеза на хемокин в резидентни дендритни клетки, които след това активират Т лимфоцити и набират адаптивни имунни клетки. След като тези имунни клетки инфилтрират епителните клетки на проксималните тубули, те произвеждат миелопероксидаза в неутрофилите и никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидаза в макрофагите, като и двете допринасят за локалното производство на свободни радикали. Тези възпалителни процеси водят до активиране на пътя на комплемента и по-нататъшно клетъчно ремоделиране и лизис вбъбрекалографт [5]. ABMR може да възникне в резултат на едното, или и на двете, предварително формирано алоантитело срещу присадката или чрез de novo развитие на донор-специфично антитяло (dnDSA) [5–7]. Острата (мин/дни), преминаваща в хронична (дни/седмици), възпалителна реакция в алографтния бъбрек, с непрекъснато производство на ROS и възпалителни цитокини, може да създаде тежък, самопродължаващ отговор, който причинявабъбрекорганна недостатъчност.
За по-добро разбиране на клетъчните и молекулярните пътища, включени в патогенезата набъбреквъзпаление и отхвърляне на алографта, ние разработихме и характеризирахме модел на плъх, който възпроизвежда повечето от клиничните критерии на вродения имунен отговор, ABMR и загуба на бъбречен орган [8]. Този модел е използван за оценка на редица нови стратегии за трансплантация след алографт.
Двата понастоящем признати подхода за намаляване на острия и дългосрочен имунен отговор срещубъбрекалографта са: (i) за увеличаване на шанса за намиране на кръстосано съвпадащ донор и (ii) за премахване на съществуващи антитела срещубъбрекалографт с помощта на протоколи за десенсибилизация [9,10].
В работата, описана в този ръкопис, ние попитахме дали трети подход за потискане на тежестта на острото и дълготрайно възпаление би бил от полза. Приложихме незабавно действащия ловец на свободни радикали, PRC-210, и двата към имплантирания алографтбъбреки на реципиентния плъх, за да се определи дали свързаното с възпаление ROS увреждане може да бъде потиснато. Въпреки че концепцията за потискане на ROSin, свързана с възпалениетобъбректрансплантацията не е нова, използването тук на новия PRC-210 ROSscavenger с незабавно действие е. Както незабавно, така и хронично почистване и инактивиране на генериращи възпаление и генерирани свободни радикали в рамките на новотрансплантирания алографтбъбрекwould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95 процента увреждане на ДНК при незащитени контроли [16]. В две предишни проучвания за трансплантация на бъбрек при гризачи [16,17], PRC-210 показа, че потиска ROS-индуцираното увреждане на бъбреците, предизвикано по време на (i) 30 часа съхранение в студено [17] и (ii) реперфузионно увреждане при имплантиране [16 ] до фонови нива, като по този начин се премахват два съществени източника на увреждане на трансплантираните бъбреци. Доказано е също, че молекулата PRC-210 потиска увреждането, предизвикано от свободните радикали, в няколко други органи [15,18]. По този начин ние предположихме, че PrC-210 също трябва да може да защити алографт срещу оксидативен стрес, който се генерира и от (i) клетъчно-и (ii) медиирани от антитяло процеси на отхвърляне, които произвеждат свободни радикали като страничен продукт.
За да изследваме тази хипотеза, ние разработихме нов модел на плъх, който избягва индуцирането на големи исхемични и реперфузионни събития и прилага PrC-210 както преди, така и след имплантацията. Бъбреците на кафяв плъх бяха промити с UW разтвор, съдържащ PrC-210 и незабавно трансплантирани в реципиенти на сингенни плъхове Lewis. Студеното исхемично време беше практически елиминирано. Веднага след имплантирането и за 8 часа след товабъбрекимплант, реципиентните плъхове са получили системни инжекции PrC-210 в дози, които биха позволили непрекъснато отстраняване на свободните радикали в трансплантираниябъбрек. Трансплантираните бъбреци и кръвна плазма след това се събират 20 часа след трансплантацията, за да се даде възможност за измерване както на PrC-210-придадено (i) потискане на страничните продукти на възпалението, така и (ii)бъбрекзащита.
мака женшен цистанче
2. Материали и методи
2.1. Животни
Възрастни (200–250 g) мъжки Lewis и BN плъхове са закупени от Envigo (Индиан-Наполис, IN, САЩ) и са настанени в съоръжението за грижи за животни в Университета на Уисконсин в Медисън, Уисконсин, САЩ. Всички процедури бяха извършени в съответствие с правилата за грижа и използване на животните в Университета на Уисконсин. Поддържането на здравето на животните, включително смърт на животните, стайна температура, 12-часови цикли светлина/тъмнина и почистване на клетки, наред с други санитарни задължения, се извършват ежедневно от персонала, който се грижи за животните. Храната и водата бяха достъпни ad libitum. Това изследване е проспективно одобрено от Училището по медицина и Комитета за институционална грижа и използване на животните за обществено здраве към Университета на Уисконсин (Протокол за животните #M005204). Всички групи съдържат 4-6 животни.
2.2. Материали
Синтезът на PrC-210 HCl аминотиол, предклинична молекула, е описан отделно [19,20]. PrC-210 HCl кристали (3-(метиламино)-2-(метил монометил)пропан-1- тиол) се съхраняват в азотна атмосфера при -20 ◦C и дори с рутинна размразяване, използване и повторно съхранение, кристалният PrC-210 е напълно стабилен за повече от 4 години чрез масспектрометричен анализ. Други химически реагенти са получени от Sigma Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). UW Organ Preservation Solution е закупен от Bridge to Life, Columbia, SC, САЩ.
2.3. Хирургична и експериментална процедура
Процедурата по трансплантация, използвана в тези експерименти, е показана на фигура 1. При плъх донор BN, след двойно лигиране на аортата, лигиране на дясната бъбречна артерия и вена и хирургическа секция на лявата бъбречна вена, левият плъхбъбрексе перфузира in situ с помощта на 5 mL UW разтвор на стайна температура (за период от 15 s). Перфузатът беше или само UW разтвор (за групите „0 h“ и „20 h без лечение“), или UW разтвор, към който кристален PrC-210, за постигане на 30 mM [17], беше добавен, разтворен незабавно и след това рН коригирано до pH на началния UW разтвор от 7,4 чрез добавяне на 0,0619 µL 5N NaOH на µmol PrC-210 HCL сол (FW: 220). Полуживотът на PrC-210 тиол (активна форма) е приблизително 3,5 часа във физиологични рН разтвори като UW разтвор и човешка кръв [14]. След перфузия in situ, лявата BNбъбрекбеше хирургически отстранен и след това зашит чрез тъпа анастомоза на съдове и уретер в освободеното място на левия бъбрек на плъха реципиент на LEW. Правилният LEWбъбрекбеше лигиран и отстранен непосредствено преди това. Пет минути след хирургичното затваряне на LEW плъха, плъхът получи системна доза PrC{{0}} (121 ug PrC-210 HCl на грам телесно тегло, което се равнява на 0).24 X Максимално поносима доза) чрез интраперитонеална инжекция. Както е показано на схемата на Фигура 1, плъхът също получава интраперитонеални инжекционни дози от PrC-210 (0,24 MTD) на плюс 4 часа и плюс 8 часа след трансплантацията. Плъховете бяха евтаназирани на плюс 20 часа след трансплантацията ибъбреции плазмени проби бяха събрани за анализ. Във всяка група за лечение имаше минимум пет плъха.
2.4. Измервания на серумен BUN и креатинин
BUN и креатинин бяха измерени в серумни проби с помощта на Catalyst One AnalyzerTechnology (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA).
2.5. Ензимно-свързани имуносорбентни анализи
Анализите бяха извършени, както е описано в протоколите на комплекта ELISA (Rat TIMP-1, Cat# RTM- 100; Rat MIP3-A, Cat# DY540; Rat TNF-alpha, Cat# RTA{ {5}}; R&D Systems, Минеаполис, Минесота, САЩ). Накратко, разреждания на плазма от плъх се добавят към предварително покрити плаки, инкубирани за 2 часа при 37 О С. След това се добавя биотин-конюгирано антитяло, специфично за анализирания протеин, и се инкубира за 1 час при 37 О С, промито, авидин-конюгирано беше добавена пероксидаза от хрян, последвано от промиване и добавяне на TMB субстрат. Реакцията се инкубира в продължение на 10-30 минути, спира се със сярна киселина и се отчита при 450 nm.
2.6. Proteome Profiler Плъх Цитокинов масив
Анализите се извършват по същество, както е описано в протокола на продукта. Накратко, плазмата се инкубира с нитроцелулозни мембрани, петна с улавящи и контролни антитела. След инкубиране, мембраните се промиват и инкубират със стрептавидин HRP. В отклонение от протокола ние използвахме SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, USA; Cat # 34094) за хемилуминесцентно откриване, тъй като даде по-силен сигнал. Петна се визуализират на FotoDyne gel doc система.
2.7. Хистология
Фиксирана с формалин (10 процента формалин), вградена в парафин,бъбрецибяха нарязани на 5 um секции. Предметните стъкла се депарафинизират, рехидратират се от ксилол през градуирана етанолна серия до вода и впоследствие се третират, както е описано по-долу. Слайдовете бяха сканирани с помощта на 20- обектив в Aperio Digital Pathology Slide Scanner. Всички H&E слайдове бяха прегледани от д-р Weixiong Zhong, MD, PhD, патолог по трансплантация, и оценени за PTC, гломерулит (g), васкулит (v)/интимен артериит, интерстициално възпаление (I) и оцветяване с C4d, според Banff 2009 [21].
Отделно, на слайдовете беше присвоен заслепен номер и бяха взети неприпокриващи се цифрови изображения на бъбречни тубули на интерфейса между медулата и кортекса от всеки H/E слайд. Внимава се да не се включват лумени на големи съдове и гломерули. Автоматизирано количествено определяне на червени и сини пиксели във всеки 10-бъбрекизображението е извършено с помощта на персонализиран макрос, написан в софтуера ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
достъпен на 13 април 2021 г.). Червените пиксели отразяват проксималната тубулна дебелина, включително границата на четката. Ядрата бяха количествено определени в синия канал. Съотношението на сините ядрени пиксели към червените тубули осигурява резултат за възпалителна инфилтрация за инфилтрация на бели кръвни клетки след трансплантациятабъбреци. Резултатите бяха осреднени и начертани с помощта на Graphpad Prism.
2.8. Активирана ензимна активност на каспаза
Активирана активност на каспаза 3 и 7 вбъбрекхомогенните супернатати се определят с помощта на флуоресцентен субстрат Apo-ONE (Promega, Madison, WI, USA) [16]. За кратко, размразенибъбрецисе смесват с 8-кратен излишък на лизисен буфер, съдържащ 50 mM Na HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 процента глицерол и се хомогенизират при 4 О C за 30 s с тъканен хомогенизатор Omni . Бъбречният хомогенат се центрофугира при 4ОC (16,000- g) в микроцентрофуга Eppendorf за 20 min. Супернатантите веднага се анализират за активност на каспаза и протеиново съдържание по метода на Брадфорд, като се използва говежди серумен албумин като стандарт. Анализът на активираната каспаза се извършва, както следва: 5 uL супернатант (~40 ug супернататен протеин) се разрежда до общ обем от 50 uL с горния лизисен буфер, смесва се с 50 uL от неразредения Apo-ONE субстрат в ямката от черна, непрозрачна, 96-ямкова плака за иницииране на 60 min реакция. Плаките се разклащат при 200 RPM при 37 О С в продължение на 60 минути. Разцепването на пептидния субстрат на DEVD каспаза се измерва с помощта на четец на флуоресцентни плаки BMG Clariostar при дължина на вълната на възбуждане от 499 nm и дължина на вълната на излъчване от 521 nm. Във всеки експеримент беше включен каспазен стандарт.
2.9. Митохондрии на бъбрека на плъх
Пречистената митохондриална фракция се приготвя от хомогенизиран плъхбъбрецичрез стандартна техника на центрофугиране [22]. Пречистените митохондрии се суспендират в 0.15 М Tris HCI буфер, рН 7,4.
За да определим дали добавянето на екзогенен PrC{{0}} потиска ROS-индуцираната фрагментация на митохондриална ДНК [22], в 25 uL реакционен обем (в PCR епруветка), добавихме: 1{{29} } uL пречистени митохондрии, 5 uL разреждане на PrC-210 или вода (PrC-210 беше добавен 10 минути преди Fe плюс плюс плюс ADP плюс H2O2 ●OH генератор) и 10 uL, съдържащ FeCl2 (2,5 mM; FW: 127), натриева сол на аденозин 5'-дифосфат (10 mM; FW: 427) и H2O2 (0,003 процента крайна концентрация). След 20 минути при 37 О C, 10 uL от реакцията се смесват с 5 uL 6- багрило за зареждане на гел, съдържащо 0,3 процента SDS; епруветките се оставят във вода при 60 О C за 1 минута, след това 10 ul се зареждат в ямка от 1% агарозен TAE гел и след 60 минути при 60 волта геловете се оцветяват и фотографират. Бяха направени минимум три реплики за всяка точка на анализ, за да се даде възможност за статистическо сравнение.
2.10. Статистически анализ
Данните са изразени като средни стойности плюс /一 STD. Използвани са t-тестовете на Стюдънт за определяне на статистическа разлика и стойности на p с помощта на софтуера GraphPad Prism 7.03. p-стойности под 0,05 се считат за значими.
3. Резултати
3.1. PrC-210 Потискане на патология на бъбречен алографт
На 20 часа след трансплантацията, хистологията на трансплантирания BNбъбреци(Фигура 2A–D), лекувани само с UW разтвор, ясно показват повишени резултати на Banff за тубулит и перитубуларен капилярит (червени и жълти стрелки); сумираните патологични резултати са показани в панел E. BNбъбрециперфузиран с PrC{{0}}съдържащ UW разтвор и получаващ пост-имплант интраперитонеални системни дози от PrC-210 (Фигура 2D) показва ясно потисната възпалителна патология на бъбрека и потиснати резултати на Banff за тубулит и перитубуларни капилярит, равен на резултатите на Banff от контролната BN група "0 h" (Фигура 2E). Приложението на PrC-210 доведе до значително намаляване както на маркерите за бъбречно увреждане на креатина (p=0.032), така и на BUN (p=0.046).
3.2. Активирани нива на каспаза в бъбреци след трансплантация
Нива на активирана каспаза в BNбъбрекхомогенати са значително намалени в BN алографтбъбрецикоито не са били изложени на лечение с PrC{{0}} през 20 часа след трансплантацията (Фигура 5). Перфузия на BN бъбреци с PrC-210-съдържащ UW разтвор и трансплантация в плъхове Lewis, които са получили системни дози PrC-210, води до същата активирана каспазна активност като тази, наблюдавана в контролните бъбреци "0 h".
3.3. Нива на възпалителни цитокини след BN бъбречен алографт
При скринингови експерименти,бъбрекхомогенизирайте супернатанти от 0 h контроли и 20 h без третиранебъбрецибяха скринирани с Proteome Profiler 29 цитокинов масив за откриване на променени, свързани с възпалението нива на експресия на цитокини и хемокини 20 часа след трансплантацията. Както е показано на двете вложки на микрочипове на Фигура 6, се наблюдават промени в TIMP-1, TNF-алфа и MIP-3a/CCL20. След това бяха използвани индивидуални ELISA плаки за количествено определяне на тези промени в бъбречните хомогенати и серуми, сега включващи и плъхове, третирани с PrC-210. Нивата както на TIMP-1, така и на TNF-алфа бяха повишени 20 часа след трансплантацията и в двата случая нивата им бяха намалени в присъствието на PrC-210 (Фигура 6A–C). Нивата на MIP-3a/CCL20 бяха повишени на 20-ия час, но те се увеличиха значително по-високо при плъхове, третирани с PrC-210- (Фигура 6D).
3.4. PrC-210 Защита на митохондриите на бъбрека на плъх
Поддържана митохондриална функция по време и след товабъбректрансплантацията е необходима за оцеляването на трансплантирания орган. ROS, генерирани по време на исхемия, свързана с трансплантация, исхемия-реперфузия и възпаление след имплантиране, могат да повлияят на митохондриалната ефективност и оцеляване на бъбрека. Поради важната митохондриална роля, ние изолирахме митохондриите от бъбреците на плъхове и определихме дали PrC-210 при постижими фармакологични концентрации може да защити тези органели от инсулт на ROS.
На фигура 7, пречистен плъхбъбрекмитохондриите бяха инкубирани с ●OH генератор [23]. След кратката реакция видяхме значителна ROS фрагментация на митохондриална ДНК на бъбрек на плъх. След увреждането на ROS, аликвотна част от митохондриите беше разтворена в SDS-съдържащ гел-зареждащ буфер и митохондриалната ДНК беше отделена и "оразмерена" с помощта на агарозна гел хроматография (Фигура 7). Инсултът на ROS ясно намалява средния размер на митохондриалната ДНК на бъбрека на плъх (линия b), а добавянето на PrC-210 към митохондриите предотвратява разрушаването на ДНК (ленти c–g) в PrC-210 зависим от концентрацията начин.
мака женшен цистанче
4. Обсъждане
Алографтбъбректрансплантацията, която предизвиква вродено клетъчно- и антитяло-медиирано отхвърляне на бъбрека на гостоприемника, е основен фактор за краткосрочни и дългосрочнибъбрекувреждане по време на трансплантация и свързаната с това забавена функция на присадката се наблюдава при до 50 процента от трансплантираните бъбреци. Ние предприехме това проучване, за да определим дали PrC-210 ще бъде ефективен при потискане на тежестта на увреждането, предизвикано след трансплантация на алографт на бъбрек в модел на плъх, който до голяма степен елиминира исхемичното време на трансплантация и свързания с него оксидативен стрес. Нашето предположение беше, че този подход трябва да ни позволи да видим въздействието на PrC-210 върху инсулта на възпалението след трансплантация с минимална исхемична интерференция.
Увеличаването на TNF-алфа и значителната мононуклеарна инфилтрация показват, че алографтната бъбречна трансплантация предизвиква изразено остро възпаление в рамките на 20 часа след трансплантацията и това е свързано с увреждането на бъбречните тубулни клетки, наблюдавани вбъбрекхистология (Banff Scores). TNF-алфа се произвежда главно от активирани макрофаги и е клетъчно сигнализиращ протеин, участващ в остро възпаление. Тя е тясно свързана с патогенезата на острото и хронично отхвърляне на алографта [24].
За разлика от горните констатации при нелекувани BNбъбреци, PrC-210, даден като част от разтвора UW и администриран системно при плъхове след трансплантация, намалява както нивото на TNF-алфа, така и бъбречната инфилтрация от мононуклеарни клетки, които са признаци на намалено остро възпаление. PrC-210 намалява увреждането на бъбреците, както се вижда в резултатите от хистологичните бъбречни увреждания (резултати на Banff) до нелекувани фонови нива и понижава нивата на функционалните резултати на бъбречната патология, креатинина и BUN.
Възпалението при нелекувани BN бъбреци се свързва с повишаване както на TIMP-1, така и на MIP-3A/CCL20. За сравнение видяхме, че лечението с PrC-210 значително намалява нивото на TIMP-1 и значително повишава нивото на MIP-3A/CCL20.
Тъканният инхибитор на металопротеиназа-1 (TIMP-1) е важен регулатор на синтеза и разграждането на извънклетъчния матрикс (ECM). Излишното натрупване на ECM е основният патологичен механизъм за развитие на фиброза по време и след остро бъбречно увреждане. По същество няма израз на TIMP-1 в нормабъбректъкан [25], наблюдение, което е потвърдено в нашата фигура 6A, B, но е известно, че TIMP-1 се експресира в увредени бъбреци, главно в бъбречни тубулни епителни клетки, бъбречна тубулна базална мембрана и цитоплазмата на интерстициалния клетки. Повишената експресия на TIMP-1 корелира положително с едновременното влошаване на бъбречната функция [26]. Плъхове, третирани с PrC-210, показват дълбоко намаляване на нивата на TIMP-1 (p=0.001), както в бъбречния хомогенат, така и в плазмата; това означава, че PrC-210 упражнява силен защитен ефект срещу индуцирана от трансплантация реорганизация на извънклетъчния матрикс на бъбрека.
Хемокинът MIP-3a/CCL20 активира рецептора CCR6, който се експресира особено върху регулаторните Т-клетки (Tregs). CCL20 се експресира от тубулни ендотелни и интерстициални клетки и също се регулира нагоре в бъбреците с остро бъбречно увреждане. Пътят на CCL20–CCR6 играе жизненоважна роля в медиираното от Treg набиране на Т-клетки към бъбрека и е описано, че Tregs имат положителна роля вбъбреквъзстановяване, толерантност към трансплантация и оцеляване на бъбреците. Както блокирането на антитела на пътя CCL20–CCR6, така и използването на мишки с дефицит на CCR6-при острабъбрекексперименти с наранявания показват, че увеличават тежестта на бъбречната недостатъчност и смъртността [27]. Това предполага, че клинично усилването на пътя на CCL20–CCR6 и активирането на Treg може да бъде възможен терапевтичен път за ограничаване на остри и хроничнибъбрекнараняване [28]. В нашето проучване (Фигура 6D), нивото на MIP-3a/CCL20 беше значително по-високо при плъхове, третирани с PrC-210-, отколкото при нетретирани плъхове. Спекулираме, че това е една от причините за (i) значително по-ниското набиране на мононуклеарни клетки в бъбреците (Фигура 3C) и (ii) значително намаленото увреждане на бъбреците (Фигура 2) при плъхове, третирани с PrC-210- .
Нормалната бъбречна митохондриална функция и, което е важно, нейните нарушения по време на етапите на съхранение на бъбрека, имплантиране и възпаление след имплантиране са значими детерминанти на ROS увреждане и бъбречна недостатъчност по време на трансплантация. Поради това е важно, че е доказано, че PrC-210 осигурява пълно потискане на фрагментацията на митохондриална ДНК (Фигура 7) при концентрации (2-4 mM), които са били постигнати в плазмата както на мишки, така и на плъхове, на които е дадено или интраперитонеално, или орални системни 0.5 MTD дози от PrC-210, които са били толерирани без откриваема токсичност [29].
В нашите по-ранни проучвания, свързани с бъбречна трансплантация [16,17], видяхме значително увеличение на активираната каспаза в бъбреците, изложени на "студова исхемия" и "исхемично-реперфузионно" увреждане. Тези инсулти на бъбреците, предизвикани от исхемия, бяха намалени на заден план чрез лечение с PrC-210 (Фигура 8). В проучванията на този ръкопис (Фигура 5), при които студената исхемия и исхемичната реперфузия са по същество елиминирани чрез незабавна трансплантация, не е имало увеличение на активираната каспаза в трансплантираните бъбреци. По-скоро активираната каспаза беше значително намалена при плюс 20 h при контролите „Без медикаментозно лечение“ и лечението с PrC-210 напълно елиминира това намаляване на каспазата при плюс 20 h плъхове и поддържаше нивото на каспазата стабилно. Нашата интерпретация на тези интересни резултати е, че липсва каквото и да е значимо инсулт от свободни радикали, предизвикан от исхемия чрез ROS и RNS към посттрансплантациятабъбреци, няма свързани маркери за клетъчна смърт и апоптоза като активирани каспази. По-скоро при тези алографтни бъбречни трансплантации, възпалителни сигнали от новоекспресирани цито- и хемокини сега регулират клетъчния метаболизъм, което включва повлияване на пътя на апоптозата. В литературата се описва, че свръхекспресията на TIMP-1 води до потискане на апоптозата [26]. Нашите резултати за каспаза (Фигура 5) подкрепят този описан TIMP-1 ефект и те предполагат, че TIMP-1 е важен за регулиране на патофизиологията на клетъчното увреждане след трансплантация на бъбречен алографт. В потвърждение на по-ранното потискане на PrC-210 на експресията на TIMP-1 (Фигура 6A, B), лечението с PrC-210 напълно премахва промяната на каспазата, запазвайки нивата на каспазата на същото ниво, наблюдавано в контролните "0 h" бъбреци. Тъй като намалените нива на PrC-210 в серума TIMP-1 при плюс 20 часа (Фигура 6B) точно отразяват значителното потискане на алографта: (i) апоптоза (Фигура 5), (ii) хистологична патология (Фигури 2 и 3) и (iii) възпалителна клетъчна инфилтрация (Фигура 3), очакваме, че проследяването на серумните нива на TIMP-1 при реципиенти на алографт на човешки бъбрек ще бъде логичен начин за наблюдение на клиничната ефикасност на PrC-210 в бъдещи клинични изпитвания .
В нашата работа до момента [16,17] ние показахме, че PrC-210 е в състояние да защити трансплантираните бъбреци срещу инсулти както от студова исхемия, така и от исхемия-реперфузия. В това проучване сега виждаме, че PrC-210 също предпазва алографтираните бъбреци от неисхемични възпалителни инсулти, които възникват след бъбречен имплант. PrC-210 значително намалява нивата на остри възпалителни цитокини, като TNF-алфа, и потиска експресията на TIMP-1 хемокина. И двете от тези събития, и потенциално допълнително подкрепени от допълнителна експресия на CCL20, се очаква да: (i) намалят увреждането на алографтния бъбрек, (ii) да потиснат набирането на Т-клетки в бъбрека и (iii) да потиснат активирането на вродените и адаптивна имунна система. На Фигура 8 ние обобщаваме тези констатации, за да подкрепим ролята, която смятаме, че PrC- 210 може да играе при трансплантацията на човешки бъбрек; той потиска: (i) увреждане на фона от реактивни кислородни видове (ROS) и реактивни азотни видове (RNS) при студена исхемия [17],
(ii) исхемично-реперфузионно увреждане на ROS на заден план [16] и (iii) увреждане от възпаление на алографта значително, в някои случаи, на заден план. Тъй като основният механизъм на действие на PrC-210 за PrC-210 е улавянето на свободните кислородни и азотни радикали, това означава, че тези свободни радикали са важен фактор за увреждането на бъбреците, наблюдавано при неисхемични състояния, т.е. възпалението, свързано с алографт, изследвано в този ръкопис.
В обобщение, това предполага, че PrC-210 може да осигури широко приложима защита на органи за много състояния на алографтна трансплантация; може да защити трансплантираните бъбреци по време и след всички етапи от процеса на трансплантация – от донорство на органи, през транспортиране, повторно имплантиране и следоперативно възпаление – за да минимизира острото и хроничното отхвърляне.
Cistanche tubulosa предотвратява бъбречни заболявания, щракнете тук, за да получите пробата
Авторски принос:NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV и MMCG участваха в извършването на изследването и анализа на данните; TRG и NAW участваха в дизайна на изследването и анализа на данните; WEF и TRG участваха в дизайна на изследването, изпълнението на изследването, анализа на данните и писането на статията. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.
Финансиране:Това изследване е финансирано от Института за клинични и транслационни изследвания на UW и предоставя UL1TR002373 на UW ICTR от NIH/NCATS, Американското дружество на трансплантационните хирурзи (133 AAA1552), Американския колеж на хирурзите (133 AAB2176) и предоставя подкрепа на WEF (# R03CA176799).
Декларация на институционалния съвет за преглед: Това изследване е проспективно одобрено от Комитета за институционална грижа и използване на животните към Училището по медицина и обществено здраве към Университета на Уисконсин (Протокол за животните #M005204).
Декларация за наличност на данни:Данните от изследването са напълно достъпни в този ръкопис. Конфликт на интереси: Авторите декларират липса на конфликт на интереси.
Препратки
1. Уанг, Х.; Нагави, М.; Allen, C.; Бръснар, RM; Bhutta, ZA; Кейси, окръг Колумбия; Чарлсън, FJ; Чен, Аризона; Coates, MM; Coggeshall, M.; et al. Глобална, регионална и национална очаквана продължителност на живота, смъртност по всякаква причина и смъртност по конкретна причина за 249 причини за смърт, 1980–2015 г.: систематичен анализ за изследването на глобалното бреме на болестта 2015 г. Lancet 2016, 388, 1459–1544. [CrossRef]
2. Лекувайте, Е.; Чоу, Е.; Peipert, JD; Уотърман, А.; Kwan, L.; Massie, AB; Thomas, AG; Боуринг, MG; Leeser, D.; Flechner, S.; et al. Изпращане на бъбреци от живи донори и резултати при трансплантирани реципиенти. арабски. Археол. епигр. 2017, 18, 632–641. [CrossRef] [PubMed]
3. Тегло, SC; Бел, PR; Nicholson, ML Бъбречно исхемично-реперфузионно увреждане. бр. J. Surg. 1996, 83, 162–170. [PubMed]
4. Sellarés, J.; De Freitas, DG; Менгел, М.; Рийв, Дж.; Reinecke, G.; Сис, Б.; Идалго, LG; Фамулски, К.; Матас, А.; Halloran, PF Разбиране на причините за неуспех на бъбречна трансплантация: доминиращата роля на антитяло-медиираното отхвърляне и непридържане. Am. J. Трансплантация. 2012, 12, 388–399. [CrossRef]
5. Siedlecki, A.; Ирландски, W.; Brennan, DC Забавена функция на присадката при бъбречна трансплантация. арабски. Археол. епигр. 2011, 11, 2279–2296. [CrossRef]
6. Идалго, LG; Кембъл, PM; Сис, Б.; Meinecke, G.; Менгел, М.; Chang, J.; Selars, J.; Рийв, Дж.; Halloran, PF; Идалго, LG; et al. De NovoDonor-специфично антитяло по време на биопсия на бъбречна трансплантация се свързва с микроваскуларна патология и късна недостатъчност на присадката. арабски. Археол. епигр. 2009, 9, 2532–2541. [CrossRef]
7. Лупи, А.; Хил, GS; Jordan, SC Влиянието на донор-специфични анти-HLA антитела върху късна бъбречна алографтна недостатъчност. Нац. Нефрол. 2012, 8, 348–357. [CrossRef]
8. Хуанг, Г.; Wilson, NA; Рийз, SR; Jacobson, LM; Zhong, W.; Djamali, A. Характеризиране на предизвикано от трансфузия остро антитяло-медиирано отхвърляне в плъх модел на бъбречна трансплантация. арабски. Археол. епигр. 2014, 14, 1061–1072. [CrossRef] [PubMed]
9. Джордан, SC; Pescovitz, MD Пресенсибилизация: Проблемът и неговото управление. Clin. J. Am. Soc. Нефрол. 2006, 1, 421–432. [CrossRef] [PubMed]
10. Стегал, М.; Gloor, J.; Winters, J.; Мур, С.; DeGoey, S. Сравнение на плазмафереза срещу десенсибилизация с висока доза IVIG при реципиенти на бъбречен алографт с високи нива на донорно специфично алоантитело. арабски. Археол. епигр. 2006, 6, 346–351. [CrossRef] [PubMed]
11. Peebles, DD; Soref, CM; Fahl, WE ROS-акцептор и радиопротективна ефикасност на новия PrC-210 аминотиол. Излъчване. Рез. 2012, 178, 57–68. [CrossRef]
12. Soref, CM; Хакер, ТА; Fahl, НИЕ Нов перорално активен аминотиолов радиопротектор без странични ефекти на гадене и хипотония при най-високите радиозащитни дози. Вътр. J. Radiat. Oncol. 2012, 82, e701–e707. [CrossRef]
13. Течапесанчароенкий, Н.; Фиала, JL; Navasumrit, P.; Croy, RG; Wogan, GN; Groopman, JD Sulforaphane, химиопревантивен агент срещу рак, индуцира пътища, свързани с биосинтезата на мембраната в отговор на тъканно увреждане от афлатоксин B1. Токсикол. Приложение Pharmacol. 2015, 282, 52–60. [CrossRef] [PubMed]
14. Йермусек, Ф.; Бенедикт, C.; Драйшмайер, Е.; Бранд, М.; Под, М.; Джефри, JJ; Ranallo, FN; Fahl, WE Значително потискане на индуцираното от CT радиация увреждане на ДНК в нормални човешки клетки от PrC-210 Radioprotector. Излъчване. Рез. 2018, 190, 133–141. [CrossRef] [PubMed]
15. Хакер, Т.А.; Diarra, G.; Fahl, BL; Назад, С.; Кауфман, Е.; Fahl, WE Значително намаляване на клетъчната смърт от исхемия-реперфузия при миокардни инфаркти при мишки с помощта на незабавно действащия PrC-210 ROS-почиствач. Pharmacol. Рез. Перспектива. 2019, 7, e00500. [CrossRef]
16. Баня, NM; Фал, НИЕ; Redfield, RR Значително намаляване на миша бъбречна исхемия-реперфузионна клетъчна смърт с помощта на незабавно действащия PrC-210 реактивен поглъщач на кислородни видове. Трансплантация. Директен. 2019, 5, e549–e555. [CrossRef] [PubMed]
17. Верховен, Б.М.; Карим, AS; Бат, NM; Fahl, CJS; Wilson, NA; Редфийлд, RR; Fahl, WE Значително подобрение в хладилното съхранение на бъбреците на плъхове с помощта на UW разтвор за запазване на органи, допълнен с незабавно действащ PrC-210 чистач на свободни радикали. Трансплантация. Direct 2020, 6, e578. [CrossRef]
18. Giese, APJ; Guarnaschelli, JG; Уорд, JA; Choo, DI; Риазуддин, С.; Ahmed, ZM Радиопротективен ефект на Aminothiol PrC-210 върху облъчено вътрешно ухо на морско свинче. PLoS ONE 2015, 10, e0143606. [CrossRef]
19. Copp, RR; Peebles, DD; Fahl, WE Синтез и регулаторна активност на растежа на прототип член на ново семейство аминотиолови радиопротектори. Bioorganic Med. Chem. Лет. 2011, 21, 7426–7430. [CrossRef]
20. Фал, НИЕ; Пийбълс, Д.; Copp, RR Аминотиолови съединения и състави за използване във връзка с терапия на рак. Патент на САЩ 7,314,959, 12 април 2004 г.