Абстракт

Заден план: Все повече проучвания съобщават за терапевтичния ефект на екзозоми, получени от мезенхимни стволови клетки (MSC), чрез които се характеризират протеинът и miRNA. Въпреки това, протеомичните и миРНК профилите на екзозомите, получени от човешки ембрионални стволови клетки (hESCs) и човешки индуцирани плурипотентни стволови клетки (hiPSCs) остават неясни.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и може да улавя реактивни кислородни видове, да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена и също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на аниона от свободните радикали на тимина.

Кликнете върху Cistanche Powder Bulk против стареене

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Методи: В това проучване ние изолирахме екзозоми от hESCs, hiPSCs и човешки мезенхимни стволови клетки от пъпна връв (hUC-MSCs) чрез класическо ултрацентрофугиране и 0.22-μm филтър, последвано от консервативна идентификация. Тандемно маркиране на масови етикети и количествено определяне на относителния пептид без етикет заедно определят тяхната протеомика. Беше извършено секвениране с висока пропускателна способност за определяне на miRNA профили. След това проведохме биоинформатичен анализ, за ​​да идентифицираме доминиращите биологични процеси и пътища, модулирани от екзозомни товари. Накрая, Western blot и RT-qPCR бяха извършени за откриване на действителните натоварвания на протеини и miPHK в три вида екзозоми.

Резултати: Въз основа на нашето проучване, товарите от три вида екзозоми допринасят за сложни биологични процеси. За сравнение, hESC екзозомите (hESC-Exos) са по-добри в регулирането на развитието, метаболизма и спирането на стареенето, а hiPSC екзозомите (hiPSC-Exos) имат подобни биологични функции като hESC-Exos, докато hUC-MSCs екзозомите (hUC-MSC-Exos) допринесе повече за имунната регулация.

Изводи: Данните, представени в нашето проучване, помагат да се дефинират протеиновите и miRNA пейзажи на три екзозоми, да се предскажат техните биологични функции чрез систематичен и цялостен мрежов анализ на системно ниво и да се разкрият съответните им потенциални приложения в различни области за оптимизиране на селекцията на екзозоми в предклинични и клинични изпитания.

Ключови думи: Човешки ембрионални стволови клетки, Индуцирани от човека плурипотентни стволови клетки, Човешки мезенхимни стволови клетки от пъпна връв, Екзозоми, Протеомика, miRNA

Въведение

Екстрацелуларните везикули (EVs) са малки везикули, активно секретирани от клетките, главно съдържащи екзозоми, микровезикули (MVs) и апоптотични тела [40, 56, 57]. Те са широко разпространени в множество телесни течности, като слюнка, кърма, кръв, цереброспинална течност, жлъчка и урина [57]. Сред тях екзозомите имат липиден бислой с диаметър 40–200 nm, плаваща плътност 1,13–1,18 g/ml в градиента на захарозата и вид с форма на чаша под електронен микроскоп [21, 53]. Различни биоактивни съединения, включително протеини, нуклеинови киселини и липиди, осигуряват междуклетъчната комуникационна функция на екзозомите между клетките [16, 17]. Липидният двоен слой е деликатна бариера, която защитава съдържанието на екзозомите от ензимна дегенерация на телесните течности [49]. Стабилните екзозоми могат да медиират сложни физиологични и патологични процеси чрез паракринна активност, включително органно и репродуктивно развитие, представяне на антиген, невронална комуникация, имунен отговор, регулиране на стареенето и клетъчна пролиферация [57, 62].

Образуването и освобождаването на екзозоми е напълно регулиран процес и сортирането на съдържанието, капсулирано в екзозоми, става чрез мобилизиране на различни протеини [22, 47]. Множество протеини са от решаващо значение за образуването на екзозома, която съдържа ендозомния сортиращ комплекс, необходим за транспорт (ESCRT), тетраспанини (CD9, CD63 и CD81), свързан с апоптоза ген 2-взаимодействащ протеин X (Alix) и туморна чувствителност ген 101 (TSG101) [38, 55]. Вътреклетъчният трафик на екзозоми се задвижва от колективната активност на серия от протеини, включително молекулярни превключватели RAB GTPases и цитоскелетни протеини, като актин и тубулин [24]. Впоследствие секрецията на екзозома се допълва от комплекса SNARE и семейството на синаптотагмин [22]. Изследванията са установили, че размножаването и отделянето на екзозоми зависи от калциевата активност и набирането на ESCRT [15]. Като пратеник, освобождаването на екзозома участва в клетъчно пресичане в отговор на клетъчната физиология и патологични промени, като активиране, промяна на pH, хипоксия, радиационно увреждане или клетъчен стрес [61].

За да се разкрият компонентите на екзозомите и техните възможни физиологични и патологични функции, често се използват протеомни, транскриптомични и други техники за изследване на екзозомни РНК и протеини от различни видове, тъкани и клетки [44]. Протеомичният анализ на екзозомите обикновено включва три стъпки: изолиране, пречистване и характеризиране на екзозоми, идентифициране на протеинови компоненти с помощта на масспектрометрия и анализ на необработени данни [14]. Клетъчното състояние значително влияе върху протеиновия състав и изобилието от екзозоми. Понастоящем се използват количествени протеомни техники за анализиране на характеризирането и изобилието на протеини, за да се изясни механизмът, който е в основата на производството на екзозоми и да се задълбочи разбирането ни за физиологичните и патологичните роли на екзозомите в клетките [39]. Сред тях широко се използват базирани на масспектрометрия количествени протеомични технологии, включващи главно методи без етикети и маркирани със стабилни изотопи [13, 42]. miRNA са малки биоактивни молекули, които са тясно свързани с различни жизнени дейности. Техниката за високопроизводително секвениране се характеризира с висока чувствителност и прецизност и има широко приложение в секвенирането на miRNA (18–30 nt) [6]. Като се има предвид развитието на сегашната технология, няма пречка за дисекция на протеиновите и miPHK профилите на екзозомите.

hESCs и hiPSCs имат висок потенциал за диференциация [36]. Директното им приложение в лечението обаче е ограничено поради риска от злокачествено заболяване и етични проблеми [31]. За разлика от това, мезенхимните стволови клетки (MSC) имат по-широко приложение за интервенция при множество заболявания в клинични условия [8]. Въпреки това, тяхната директна употреба все още е изправена пред няколко ограничения, включително нисък процент на преживяемост, имунологично отхвърляне и проблеми с безопасността [8, 43]. Понастоящем се обръща много внимание на екзозомите поради тяхната биосигурност, стабилност, неанеуплоидия и ниска имуногенност [51]. Предишни проучвания са документирали компонентното сравнение на MSCs, получени от различни тъкани и техните екзозоми, съдържащи протеомни и miRNA профили [59]. Гонг и др. също изобразява регулаторната мрежа на hESC извънклетъчни везикули (EVs) по отношение на протеома, но само в свързани със стареенето пътища, без да се фокусира върху други [19]. Questa и др. изтъка EV протеомния атлас на hiPSCs, получени от човешки фибробласти на препуциума (HFF) [45]. Въпреки че тези проучвания отчасти съобщават за протеиновите компоненти на EVs, те не се фокусират единствено върху екзозомите и техният цялостен протеомен анализ не е ясно артикулиран. По-специално, профилите на miRNA все още не са описани. За да се отговори на това, екзозоми, изолирани от hESCs, hiPSCs и hUC-MSCs, бяха избрани в настоящото проучване за по-нататъшно изследване, насочено към техните протеомни и miRNA профили, за да получат нови прозрения за тяхното изследване и клинично приложение.

Методи

Подготовка и характеризиране на екзозоми

hESCs и hiPSCs бяха култивирани в среда ncTarget (кат. № RP01020; Nuwacell. Ltd, Китай), докато 3-то поколение hUC-MSCs беше култивирано в безсерумна мисия hMSC среда (кат. № RP02010; Nuwacell. Ltd, Китай). След това 350 mL от супернатантата на клетките в логаритмичната фаза на растеж (~80 процента сливане) се събират за екзозомно пречистване. Екзозомите бяха извлечени чрез серия от признати центрофугиране и ултрацентрофугиране, както е описано по-рано [34, 52]. Накратко, кондиционираната среда (CM) се събира и се подлага на градиентно центрофугиране (300×g за 10 минути, 2000×g за 15 минути, 10, 000×g за 30 минути), за да се разделят клетъчни остатъци. Екзозомите се пелетират от събраните супернатанти при 100, 000×g за 70 минути с помощта на Ti45 ротор (Beckman Coulter, САЩ). След това те бяха ресуспендирани в PBS за следващото филтруване с помощта на 0.22-μm MF-Millipore™ мембранен филтър (Sigma, САЩ). Филтратът се подлага на ултрацентрофугиране при 100 000 × g за 70 минути. Крайната екзозомна пелета се ресуспендира в PBS за следващия анализ. Система за динамично разсейване на светлината (DLS) (Wyatt Technology, САЩ) беше използвана за измерване на концентрацията и размера на изолираните екзозоми.

Трансмисионна електронна микроскопия (ТЕМ)

Извършено е TEM сканиране, за да се опише морфологията на изолирани екзозоми, както е описано по-горе. Ресуспендираните екзозоми (1 ug в 10 ul PBS) се засаждат върху покрита с въглерод медна решетка (200-мрежа) и се оставят да се адсорбират върху нея за 2 минути, последвано от две промивания с двойно дестилирана вода. След това решетките бяха отрицателно оцветени с 8 μL 2% разтвор на уранил ацетат за 1 минута. След естествено изсушаване, пробите бяха изследвани с помощта на система Tecnai Spirit (Thermo Fisher, САЩ) при 120 kV.

Динамично разсейване на светлината

Разпределението на размера на екзозомите беше описано чрез анализ на проследяване на наночастици с помощта на динамичен светлинен скатерометър (Wyatt Technology, САЩ) съгласно инструкциите на производителя (271-DPN), както беше съобщено по-рано[23]. Накратко, екзозомната пелета се ресуспендира в 100 μL PBS. Десет, 50 μL от горните екзозоми се добавят към 1450 μL PBS и се разбъркват за 30 s. Екзозомите (1.5 mL) се прехвърлят в кювета за еднократна употреба за еквилибриране при 25 градуса за 30 s. Стойността на индекса на пречупване на диспергиращия агент беше 1,37 и както Z-средната, така и полидисперсността (PDI) определят размера на екзозомните частици. За всяка проба бяха направени независими от дървото измервания.

Тандемно етикетиране на масата (TMT) и анализ на относително пептидно количествено определяне без етикет (LFQ)

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 и П<0.05) and label-free (at least two tests results>0 и П<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), както и статистическа значимост (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

анализ на профила на miRNA

Общата РНК се екстрахира от изолирани екзозоми с помощта на комплекта за изолиране на miRNA mirVana™ (кат. № AM1560; Thermo Fisher, САЩ). РНК пробите бяха подложени на проверка на качеството за микрочипов анализ на miRNA, извършен от LC-Bio Technology Co., Ltd. Анализът на необработените данни беше извършен, както беше съобщено по-рано [9]. Диференциално експресирани miRNAs бяха избрани като кандидат miPHKs при p-стойност<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) и максимална свободна енергия<−10 (miRanda).

Биоинформатичен анализ

Суровите данни бяха подложени на анализ с помощта на софтуерния пакет Maxquant (v1.6.0), а данните от Swiss-Prot_Human бяха зададени като референтни (20 600 протеина) (Proteome ID: UP000005640) . Идентифицираните протеини бяха картографирани в Генната онтология (GO) и Киото Енциклопедия на гените и геномите (KEGG) въз основа на термините на анализа KOBAS [60], за да се определят техните биологични и функционални свойства. Софтуерът Cytoscape и пакетът igraph в R софтуер (версия 3.6.1) бяха използвани за начертаване на преплетената мрежа от екзозомни протеини или miRNAs между сигналните пътища.

Статистически анализ

Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра. Количествената повторяемост на протеини и miRNAs беше повишена чрез анализ на главния компонент (PCA), относително стандартно отклонение и коефициент на корелация на Pearson. Резултатите бяха анализирани с помощта на несдвоен t-тест на Student. Данните са изразени като средна стандартна грешка на средната стойност (SEM). P-стойностите се считат за статистически значими при *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Резултати

Изолиране и идентифициране на екзозоми

Културата и идентифицирането на три човешки плурипотентни стволови клетки бяха описани в Допълнителен файл 1. Екзозомите бяха изолирани от кондиционираната среда на три вида стволови клетки (Допълнителен файл 1: Фиг. S1) и идентифицирани въз основа на морфология, размер на частиците, концентрация, и повърхностни маркери [19]. ТЕМ разкрива, че тези екзозоми имат морфология с форма на чаша (Фиг. 1А), а DLS разкрива, че тяхното разпределение на размера е в рамките на 50–200 nm (Фиг. 1В). Western blotting показва, че изолираните екзозоми носят положителните маркери CD63, TSG101 и HSP70, но не и отрицателния маркер калнексин (фиг. 1C). Всеки hESC има сходен екзозомен добив с този на hiPSCs и двата са по-високи от този на hUC-MSCs (фиг. 1D). Тези резултати показват, че представителни екзозоми са задържани, без разлики във формата; въпреки това бяха открити разлики между концентрациите на екзозоми, изолирани от трите вида стволови клетки.

Биоинформатика на споделени и най-заредени протеини

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (тест без етикет). Накрая бяха избрани 554, 437 и 911 семена за анализиране на протеиновите профили на hESC-Exos, hiPSC-Exos и hUC-MSC-Exos, съответно (Допълнителен файл 1: Фиг. S3A). След това тези кандидати бяха подложени на анализ на диаграма на Venn за избор на споделени протеини (Допълнителен файл 1: Фиг. S3B). Биоинформационният анализ разкрива, че 303-те споделени протеина доминират в регулирането на тези сигнални пътища, включително регулиране на актиновия цитоскелет, фокална адхезия, PI3K-AKT, въглероден метаболизъм и т.н. (Допълнителен файл 1: Фиг. S3C). GO анализът също така показва, че споделените протеини са обогатени с извънклетъчна екзозома, мембрана, протеиново свързване и извънклетъчна област (Допълнителен файл 1: Фиг. S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (тест без етикет) (фиг. 2A). Въз основа на тези резултати, 163, 187 и 451 протеини бяха скринирани съответно в hESC-Exos, hiPSC-Exos и hUC-MSC-Exos (Допълнителен файл 1: Фиг. S3E). След това описахме кривата на изобилие на експресия на трите типа екзозоми и идентифицирахме първите десет генни символа на заредени протеини в екзозоми (фиг. 2B). ThСилно натоварените протеини бяха подложени на биоинформатика, базирана на алгоритъма KOBAS. Всички протеоми на трите типа екзозоми бяха включени в сложна регулаторна мрежа на сигналния път и първите 20 пътя след това бяха сортирани въз основа на стойността на -log10 (P-стойност) (фиг. 2C–E). Всички протеоми бяха обогатени с взаимодействието на рецептора на екстрацелуларния матрикс (ECM) и сигналните пътища на PI3K-AKT. Анализът на взаимодействието протеин-протеин (PPI) разкрива, че най-заредените протеини както в hESC-Exos, така и в hiPSC-Exos саобогатени в клетъчния цикъл и метаболитния път, докато най-заредените протеини в hUC-MSC-Exos са обогатени в пътища, свързани с регулиране на имунитета (фиг. 2F-H).

Сравнение по двойки на екзозомна протеомика

За да оценим разликата между всеки два екзозомни протеома, ние конструирахме диаграма на Venn, за да разпознаем уникалните и припокриващи се генни клъстери, кодиращи протеини. След това споделените гени, кодиращи протеини, бяха подложени на анализ на вулкан и топлинна карта и на GSEA, а диференциално експресираните протеини бяха филтрирани при P<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

Сравнението между hESC-Exos и hUC-MSC- 1: Фиг. S4 D) разкри, че уникалните кодиращи протеини генни клъстери на hESC-Exos са включени главно в EGFR, TGF-, клетъчния цикъл, регулирането на плурипотентността и Wnt сигнализиране (Допълнителен файл 1: Фиг. S4E). За разлика от тях, уникалните клъстери на hUC-MSC-Exos бяха обогатени с много сигнални пътища, свързани с имунорегулацията, като система на комплемента, регулиране на възпалението и микробна инфекция (Допълнителен файл 1: Фиг. S4F). Припокриващите се клъстери бяха силно обогатени с ECM-рецепторно взаимодействие, комплемент и коагулационни каскади и PI3K-AKT сигнализиране (фиг. 3D). Графиката на вулкана изобразява разликите между hESC-Exos и hUC-MSC-Exos (фиг. 3E). Повишените протеини в hUC-MSC-Exos (Клъстер 1) участват главно в отговора на комплемента, активността на естествените клетки убийци и сигнализирането на Rap1 и PPAR. Обратно, регулираните нагоре протеини на hESC-Exos са включени главно в сигнализирането на PI3K-AKT, MAPK и AMPK (фиг. 3F). GSEA потвърди по-високата регулаторна способност на hiPSC-Exos в плурипотентността (Допълнителен файл 1: Фиг. S6A и D) и тази на hESC-Exos в имунорегулацията, включително цитотоксичност, медиирана от естествени клетки убийци (Допълнителен файл 1: Фиг. S6B и E) и регулиране на COVID19-SARS-CoV2 (Допълнителен файл 1: Фиг. S6C и F).

Сравнението hiPSC-Exos и hUC-MSC-Exos (Допълнителен файл 1: Фиг. S4G) разкри, че уникалният генен набор, кодиращ протеин hiPSCExos, е значително свързан с нехомоложно свързване на краищата, метаболизма на TGF- и витамин B6 (Допълнителен файл 1: Фиг. S4H), докато този на hUC-MSC-Exos е участвал главно в пътища, свързани с имунорегулацията (Допълнителен файл 1: Фиг. S4I). Техните припокриващи се протеини също участват в регулирането на ECM-рецепторните взаимодействия, каскадите на комплемента и коагулацията и PI3K-AKT сигнализирането (фиг. 3G). Диаграмата на вулкана представя диференциално експресираните протеини (фиг. 3H). Клъстер 1 протеини в топлинната карта показват, че hUCMSC-Exos регулира основно имунния отговор и AMPK сигналния път, докато hiPSC-Exos основно регулира клетъчния цикъл и инсулин, Hippo и mTOR сигнални пътища (фиг. 3 I). GSEA допълнително подкрепи доминиращата роля на hiPSC-Exos в регулирането на процесите на развитие (Допълнителен файл 1: Фиг. S7A и D) и поддържането на плурипотентност (Допълнителен файл 1: Фиг. S7B и E), докато hUC-MSC-Exos бяха участва предимно в процеса на имунорегулация (Допълнителен файл 1: Фиг. S7C и F).

Биоинформатика на припокриващи се протеоми

След това изследвахме споделените протеоми на трите вида екзозоми. Общо 309 протеин-кодиращи гена (фиг. 4А) бяха подложени на GO и KEGG анализи. Резултатите показват, че споделените кодиращи протеин набори гени сред трите вида екзозоми са включени главно в извънклетъчни дейности и биологични процеси, включително метаболитни процеси на клетъчни протеини, свързване на сигнален рецептор, свързване на ATP, свързване на NAD, заздравяване на рани и липидни метаболитни процеси (фиг. 4B). Те също така допринесоха за изграждането на сложни регулаторни мрежи от сигнални пътища като PI3K-AKT, гликолиза/глюконеогенеза, Hippo, Oxytocin, HIF-1, клетъчен цикъл и AMPK пътища (фиг. 4C). Имаше сложни регулаторни връзки между тези протеомични и канонични сигнални пътища (фиг. 4D). Графиката на мехурчетата доказва различното изобилие на всеки протеинов клъстер в каноничния сигнален път. Докато hESC-Exos и hiPSC-Exos може да имат по-силни регулаторни способности от hUC-MSC-Exos по отношение на клетъчния цикъл и AMPK сигналните пътища, hUC-MSC-Exos може да има забележими регулаторни ефекти върху VEGF и NF-κB сигналните пътища (Допълнителни файл 1: Фиг. S8).

Анализът на топлинната карта допълнително разкрива разлики в експресията на споделени протеини (фиг. 4E). В клъстер А протеините, включени в сигналните пътища на PI3K-AKT, Hippo, VEGF и В-клетъчния рецептор, бяха обогатени с hUC-MSCExos и hESC-Exos. Протеините в клъстер B участват главно в регулирането на PPAR сигнализацията, метаболизма на холестерола и производството на IgA и са изчерпани в hESC-Exos. hUC-MSC-Exos съдържа главно протеини на клъстер С, които регулират отговора на комплемента, микробна инфекция, HIF-1 сигнализиране, MAPK сигнализиране, метаболитни пътища и NF-κB пътя. Протеините в клъстер d, които са обогатени с hiPSC-Exos, участват в регулирането на Ras сигнализирането, окислителното фосфорилиране и mTOR сигнализирането. Протеините в Cluster e са по-изобилни както в hiPSC-Exos, така и в hESC-Exos, отколкото в hUC-MSCExos, и те участват в множество метаболитни процеси, като цитратния цикъл, клетъчния цикъл, инсулиновото сигнализиране, метаболизма на мастни киселини и AMPK сигнализирането . Протеините в клъстер f участват в регулирането на реабсорбцията на калций, гликолизата/глюконеогенезата, адренергичното сигнализиране и метаболизма на пирувата и са изчерпани както в hUC-MSCExos, така и в hiPSC-Exos. Протеините в различните клъстери са изброени в Допълнителен файл 4.

miRNA профили на трите вида екзозоми

За да се изследват miPHK профилите на трите вида екзозоми, общата РНК се изолира от екзозомите за свързване на 5' и 3' краищата за последваща обратна транскрипция. Получената cDNA се използва за изграждане на библиотека и широко тестване. Номерът на интегритета на РНК (RIN) беше съответно 2.7, 2.6 и 2.6 в hESC-Exos, hiPSC-Exos и hUC-MSC-Exos (Допълнителен файл 1: Фиг. S9A). Определянето на концентрацията на РНК разкри, че hESC-Exos доминира натоварването на РНК, последвано от hiPSC-Exos и hUC-MSCExos (Допълнителен файл 1: Фиг. S9B). Корелационният коефициент на Pearson (Допълнителен файл 1: Фиг. S9C) и PCA (Допълнителен файл 1: Фиг. S9D) бяха използвани за количествена оценка на повторяемостта на miPHK. Бяха използвани топлинни карти за представяне на диференциално експресираните miRNAs в трите вида екзозоми (Допълнителен файл 1: Фиг. S9E) и броя на диференциално експресираните miPHKs при P<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

За да се изследват miRNAs, участващи в биологични процеси, горните miRNAs бяха филтрирани при P<0.05 and read count>1000 за по-нататъшно прогнозиране на целевия ген. След това обогатените гени бяха подложени на GO и KEGG анализи. Резултатите показват, че hESC-Exos miPHK значително повлияват следните процеси: Rap1, PI3K-AKT, калций, Hippo, cAMP, ErbB, Foxo, клетъчен цикъл, AMPK сигнален път и т.н. (KEGG анализ) (фиг. 5D) и клетъчен цикъл, развитие на множество организми, вътреклетъчна сигнална трансдукция, клетъчна диференциация, стареене, Wnt сигнализиране и метаболизъм на мастни киселини. (биологичен процес) (фиг. 5G). Обогатяването на таргетния ген на miPHK на hiPSC-Exos показва, че следните процеси са значително регулирани: PI3K-AKT, Rap1, Ras, калций, хипопотамия, cAMP и cGMP-PKG сигнален път и др. (KEGG анализ) и клетъчния цикъл, развитие на множество организми, фосфорилиране, клетъчна диференциация, клетъчна миграция и отговор на хипоксия. (биологичен процес) (фиг. 5Н). В регулаторната мрежа на hUC-MSC-Exos miRNA, най-правдоподобните биологични процеси бяха: Rap1, Ras, PI3K-AKT, калций, cAMP, Hippo, клетъчният цикъл, JAK-STAT и HIF{19}} сигнален път . (KEGG анализ) (Фиг. 5F) и фосфорилиране, вътреклетъчна сигнална трансдукция, ATP свързване, клетъчно делене, липиден метаболизъм, Т клетъчна ко-стимулация, заздравяване на рани, NF-кВ свързване и възпалителен отговор. (биологичен процес) (фиг. 5 I). Мрежата от първите пет miPHK и техните регулаторни пътища също беше изобразена (Допълнителен файл 1: Фиг. S10).

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】