Насочването към лактат дехидрогеназа А с катехин ресенсибилизира SNU620/5FU раковите клетки на стомаха към 5-флуороурацил, част 2

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

2.5. Съвместното лечение с CA и 5Fu индуцира митохондриална ROS-зависима апоптоза

Тъй като инхибирането на LDHA директно увеличава митохондриалната ROS и загубата на нейния мембранен потенциал, впоследствие предизвиквайки апоптоза [16,29], бяха изследвани факторите, свързани с митохондриалната ROS-медиирана апоптоза. CA или 5FU еднократно третиране леко повишава митохондриалното ниво на ROS в SNU620/5FU клетки, измерено чрез поточна цитометрия с помощта на MitoSOX. Въпреки това, съвместното лечение с CA и 5FU значително повишава производството на митохондриални ROS. Това увеличено производство на ROS беше обърнато от Mito-TEMPO, антиоксидант, насочен към митохондриите (Фигура 5A-C). Инхибирането на растежа след третиране с CA и 5FU също се възстановява при третиране с Mito-TEMPO в SNU620/5FU клетки (Фигура 5D). Освен това апоптозата беше оценена чрез оцветяване с анексин V-FITC/PI в SNU620/5FU клетки. Съвместното лечение с CA и 5FU увеличава броя на апоптотичните клетки сред SNU620/5FU клетките (Фигура 6A, B). Ядрената морфологична фрагментация се появява по време на апоптозата и може да се наблюдава чрез оцветяване с 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) [30,31]. Установено е, че ДНК фрагментацията се е увеличила значително в групата на съвместно лечение, в сравнение с тази в контролната група (Фигура 6C). Накрая бяха изследвани биомаркери на апоптоза, включително Bcl-2, Bax, Caspase-9, Caspase-3 и PARP. Проапоптотичната каскада се увеличава след съвместно лечение с CA и 5FU в SNU620/5FU клетки (Фигура 6D). Тези открития предполагат, че съвместното лечение с CA и 5FU индуцира апоптоза в SNU620/5FU клетки.

Фигура 5. Съвместното лечение с катехин (CA) и 5-флуороурацил (5FU) повишава производството на митохондриални ROS: (A)SNU620/5FU клетките са третирани с посочените концентрации на CA, 5FU（10 μM） и Mito -TEMPO（20 μM） за 48 часа. Митохондриалната ROS на клетките беше измерена чрез FACS анализ, използвайки MitoSOXTM Red; (B) лентовата графика показва процента на клетките, които са положителни за оцветяване с MitoSOX; (C) изображения с флуоресцентна микроскопия (X100) на SNU620/5FU клетки, оцветени с MitoSOX бяха представени; (D) жизнеспособността на клетките беше измерена чрез МТТ анализ. Резултатите са показани като средна стойност ± SEM.*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Фигура 6. Увеличаване на апоптозата чрез съвместно лечение с катехин (СА) и 5-флуороурацил (5FU); Клетките SNU620/5FU бяха третирани с CA （10 uM） и/или 5FU （10 μM） за 48 часа∶（A） броят на апоптотичните клетки беше анализиран чрез FACSанализ, използвайки оцветяване с PI-Annexin V; (B) лентовата графика показва процентът на клетките в ранна и късна апоптотична фаза. Резултатите са показани като средна стойност ± SEM.**p<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Моля, щракнете тук, за да научите повече

3. Дискусия

В това проучване, за да характеризираме и оценим химиорезистентността към 5FU, използвахме SNU620/5FU клетки, които бяха установени чрез дългосрочно излагане на 5FU със серийно увеличение на концентрацията на лекарството [32]. Съобщава се, че родителските клетки SNU620 съдържат p53 мутант с хомозиготна делеция в екзон 5 [33]. Въз основа на ДНК микрочип, няколко гена, участващи в химиорезистентността, включително тимидилат синтетаза, специфичен за увреждане ДНК свързващ протеин 2, клъстерин и мидкин, са повишени в SNU620/5FU клетки [32]. Няколко предишни проучвания са използвали линията SNU620/5FUcell като модел за оценка на in vitro ефикасността на лекарства срещу резистентност към 5FU чрез антимитоза, активиране на AMPK и сигнализиране на канабиноидния рецептор [34-36]. Въпреки това, метаболитните характеристики и нивата на експресия на свързаните с метаболизма гени в клетките SNU620/5FU и тяхната роля в химиорезистентността не са до голяма степен изследвани.

Тук демонстрирахме, че клетките SNU620/5FU имат напреднали гликолитични фенотипове, включително повишено производство на лактат и експресията на ензими, свързани с превръщането на пируват в лактат, като LDHA. Фосфорилирането на PDHA1, представляващо намалената PDH активност чрез повишени PDK2 и PDK3, също се увеличава в SNU620/5FU-резистентни клетки, в сравнение с това в SNU620 родителски клетки. Въпреки това, OCR не е значително намален в резистентните клетки. Възможно обяснение за това несъответствие е хранителната пластичност на раковите клетки за TCA цикъла, тоест аминокиселините или ацетил-CoA, получен от мастни киселини, не само ацетил-CoA, получен от глюкоза, могат да доставят субстрати за TCA цикъла [37]. ].В съответствие с това, 5FU-резистентните ракови клетки на стомаха насърчават стволовостта чрез митохондриално окисляване на мастни киселини [38]. В допълнение, 5FU-резистентността е свързана с повишена маса и активност на митохондриите, включително експресията на ензимите на електронната транспортна верига (ETC) и консумацията на кислород [39,40]. По този начин ние се фокусирахме върху модулирането на LDHA, за да ресенсибилизираме 5FU-резистентността. Въз основа на нашите резултати, инхибирането на LDHA активността с оксамат или СА успешно потиска растежа на резистентни SNU620/5FU клетки и ги ресенсибилизира към лечение с 5FU. Тези констатации показват добра корелация с тези от предишни проучвания, които съобщават, че генетичното или фармакологично инхибиране на LDHA успешно намалява резистентността към химиотерапия, включително 5FU [19,41,42]. По този начин, ние предположихме, че инхибирането на LDHA може да бъде достатъчно, за да потисне резистентността срещу 5FU в SNU620/5FU клетки.

Cistanche може да подобри имунитета

Няколко синтетични молекули, като оксамат, FX11, PSTMB и GNE-140 са установени като нискомолекулни LDHA инхибитори [11,43]. Сред тях се съобщава за FX11 като сенсибилизатор към химиотерапия в резистентни туморни клетки [44]. Въпреки това, въпреки че много LDHA инхибитори са под наблюдение за одобрение като нови противоракови лекарства, нито едно от тях все още не е одобрено. По този начин са необходими повече подобни на лекарства кандидати за генериране на нови LDHA инхибитори [45]. Естествените съединения се считат за потенциални ресурси за противоракови лекарства, особено за преодоляване на химиорезистентността като комбинирана терапия [46,47]. Следователно, насочването към метаболизма на рака, особено метаболизма на глюкозата с естествени продукти от растителен произход, е нововъзникваща изследователска тенденция за разработване на нови терапевтични средства за рак [48].

Освен това, няколко доклада предполагат, че естествените продукти, като госипол, галофлавин, кроцетин, машина А и EGCG, са мощни LDHA инхибитори [43,49,50]. Въпреки че сред тях госиполът има най-мощното инхибиторно действие върху LDHA (IC50=9.8 uM), той също инхибира активността на LDHB, който превръща лактат в пируват [51]. Нашите резултати показаха, че EGCG, установен LDHA инхибитор и сенсибилизатор към 5FU химиотерапия [22-25], упражнява инхибиторни ефекти както върху LDHA, така и върху LDHB активностите. Сред инхибиторите на LDHA, получени от естествени продукти, показващи LDHA-специфични инхибиторни активности, като машина A(IC50 =84 μM）, кроцетин （IC50 =54.9 μM） и CA （IC{{13} }.69 μM）【49,50】, CA показа най-добър супресивен ефект върху активността на LDHA по отношение на стойността на ICsn.Въпреки че химичните структури на CA и EGCG са много сходни, с изключение на допълнителната част от галова киселина, тяхната инхибиторна селективност беше Освен това, въпреки че СА е най-простото съединение, в сравнение с неговите производни, той показва най-доброто инхибиторно действие както върху производството на лактат, така и върху активността на LDHA.По този начин трябва да се проведе обширно изследване на връзката структура-активност, за да се демонстрира СА като потенциален нов гръбнак за разработването на специфични и мощни LDHA инхибитори.

Известно е, че EGCG е конкурентен инхибитор на NADPH. В допълнение, EGCG инхибира транслокацията и възпроизводството на NADPH оксидазата [52-54]. Въпреки това, според резултатите от молекулярното моделиране, CA и EGCG са структурно разположени на различни места (Фигура 3A, B). В допълнение, те не показват корелация в специфичността при инхибирането на активността на LDHA и LDHB, които използват NADH и NAD плюс като кофактор, съответно. От тези данни ние предположихме, че CA няма пряка корелация с EGCG в механизма на конкуренция с NAD (P) H. Между другото, инхибирането на LDHA от няколко инхибитора, като FX11, GSK 2837808A, NCI-737 и NCI-006, намалява производството на NADt и увеличава натрупването на NADH, като по този начин намалява съотношението на NAD плюс /NADH[16,17,55]. Апоптозата, индуцирана от p53/NAD-зависим път на увреждане на ДНК, също се повишава чрез инхибиране на LDHA с помощта на siRNA или химически инхибитор, NH-2 [56]. GCN2-ATF4 сигналният път също се съобщава като друг механизъм, отговорен за апоптотична клетъчна смърт, индуцирана от LDHA инхибитора, GSK 2837808A [17]. Тъй като съотношението NAD/NADH играе ключова роля в редокс хомеостазата и клетъчната пролиферация [5758], СА като инхибитор на LDHA може да повлияе на 5FU-резистентните ракови клетки чрез модулиране на съотношението NAD плюс /NADH.

СА индуцира клетъчна смърт както в родителските SNU620, така и в 5FU-резистентните SNU620/5FU клетки. Въпреки това, CA-индуцираната клетъчна смърт е зависима от LDHA чрез изчерпване на shRNA в SNU620/5FU клетки. В допълнение, съвместното лечение на CA и 5FU показва допълнителни противоракови ефекти върху 5FU-резистентни клетки. Както беше съобщено по-рано [16,59], инхибирането на LDHA увеличава ROS и следователно потиска растежа на раковите клетки. Когато LDHA беше инхибиран, енергийният метаболизъм се преобразува от гликолиза в TCA цикъл и митохондриално окислително фосфорилиране [60]. По този начин раковите клетки произвеждат повече ROS, което води до увреждане на митохондриалната мембрана и индуцирана от митохондриите апоптоза [61,62]. В добро съгласие с предишни проучвания, CA индуцира апоптотична клетъчна смърт чрез митохондриален ROS-зависим път. Повишената ROS-защитна способност и намалените апоптотични сигнали са общи свойства на химиорезистентните ракови клетки, особено в 5FU-резистентните клетки 3,63]. Освен това, промените в метаболизма на рака, особено в метаболизма на глюкозата, също водят до резистентност към химиотерапия чрез промяна на клетъчните дейности, като анормално възстановяване на ДНК, засилена аутофагия, намалена апоптоза, защита срещу ROS и повишена секреция на екзозоми [9,64,651]. . По този начин, насочването към гликолитични ензими, включително LDHA, с CA може да бъде алтернативна стратегия за преодоляване на химиорезистентността, особено при 5FU-резистентен рак на стомаха. Като цяло, бързо делящите се злокачествени тумори са силно чувствителни към инхибитори на синтеза на ДНК, включително 5FU, в сравнение с нормалната тъкан. Някои ракови клетки обаче могат да развият резистентност към лечението чрез няколко механизма, както е описано по-рано [34-36]. Едновременното лечение с биоактивни съединения и конвенционална химиотерапия има по-голям ефект, в сравнение с едно съединение, върху забавянето на развитието на резистентност |66. Следователно, биологичните ефекти на специфични фитохимикали с доказани цитотоксични ефекти, администрирани с конвенционална химиотерапия за насочване към по-широк спектър от сигнални пътища в раковите клетки, включително раков метаболизъм и митохондриални функции, трябва да превъзхождат отделните съединения при лечението на рак, тъй като те могат да забавят развитието на резистентност [67]. В това проучване комбинацията от CA и 5FU показва по-високо инхибиране на клетъчната жизнеспособност в сравнение с това на еднократно лечение. Освен това, ние показахме, че инхибирането на LDHA активността и последващата митохондриална ROS-медиирана апоптоза може да бъде механизмът, който е в основата на сенсибилизиращия ефект на СА върху 5FU-резистентни клетки (Фигура 7).

В допълнение към ефикасността и специфичността на инхибирането на LDHA, CA е по-безопасен от установените преди това инхибитори на LDH, получени от природни продукти. Освен това CA е добре позната химическа съставка на зеления чай и неговата безопасност и фармакодинамични свойства са потвърдени в предишни проучвания [68-70]. Все още обаче не е извършена точна оценка на токсичността на едновременното приложение на CA и 5FU. В допълнение, in vivo ефикасността на CA в 5FU-резистентни ракови клетки не е изследвана в това проучване. Предишни проучвания обаче съобщават за in vivo противораковата ефикасност на CA и неговите производни за преодоляване на химиорезистентността, включително 5FU-резистентността при рак на стомаха и дебелото черво при хора [71-77]. В това проучване ние се фокусирахме върху инхибирането на LDHA като основен молекулярен механизъм на CA за преодоляване на резистентността към 5FU. Следователно, за да се разработи СА като нов адювант за химиорезистентни ракови клетки, in vivo ефикасността и безопасността на съвместното лечение с СА и 5FU трябва да бъдат оценени чрез обширни проучвания върху животни, включително модели на ксенотрансплантация и добри лабораторни оценки на токсичността.

4. Материали и методи

4.1.Материали

Антитела срещу поли(ADP-рибоза)полимераза, каспаза-3 и каспаза-9 бяха закупени от Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Антитела срещу LDHA, глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) и PDHA1 бяха закупени от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния, САЩ), а тези срещу фосфор-PDHA1 и PDK3 бяха закупени от Abcam ( Abcam, Кеймбридж, Масачузетс, САЩ). Освен това, антителата срещу PDK2 и PDK4 бяха закупени от Signalway Antibody (Signalway Antibody, Dallas, TX, USA), тези срещу PDK1 бяха получени от Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), а тези срещу B-клетки лимфом-2(Bcl-2) и Bcl-2-свързан X протеин са закупени от Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). MitoSOX е закупен от Invitrogen (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ). Химикали и реактиви, включително 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT),4',{{22} }диамидино-2-фенилиндол, оксамат, никотинамид аденин динуклеотид, СА и производни на СА (EC GC, EGC и EGCG) са закупени от Merck (Merck, Дармщат, Германия). - никотинамид аденин динуклеотид (окислена форма) е закупен от Tokyo Chemical Industry (Tokyo Chemical Industry, Токио, Япония).

4.2.Клетъчна култура

Човешки рак на стомаха SNU620, SNU620/5FU и AGS, рак на панкреаса Panic-1 и MIA PaCa-2 и рак на дебелото черво LS174T и RKO клетки са получени от Корейската банка за клетъчни линии (KCLB, Сеул, Корея ).SNU620, SNU620/5FU, AGS и LS174T клетки бяха култивирани в среда 1640 на Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) (Welgene, Daegu, Корея), допълнена с 10 процента топлинно инактивиран фетален говежди серум (FBS )(Gibco, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ) и 1% пеницилин/стрептомицин (Invitrogen), и клетките Panc-1, MIA PaCa-2 и RKO бяха култивирани в модифицираната среда на Dulbecco на Eagle (Welgene ), съдържащ 10 процента топлинно инактивиран FBS и 1 процент пеницилин/стрептомицин. Всички клетки бяха култивирани в овлажнен СО, инкубатор при 37 градуса и 5 процента СО2.

4.3. Анализ на клетъчната жизнеспособност

Нивата на цитотоксичност на CA и 5FU в SNU620 и SNU620/5FU клетки бяха измерени с помощта на МТТ анализ. Клетките се култивират в 24-плаки с ямки (2 × 104 клетки/ямка) с посочените концентрации на СА и 5FU за посочения ден. След това към всяка ямка се добавя МТТ разтвор (2,0 mg/mL), последвано от 3-4 h инкубиране при 37 градуса и 5 процента CO в инкубатор за клетъчни култури. Впоследствие културалната среда се отстранява и абсорбцията на формазанови кристали се прави от живи клетки. Добавя се DMSO за разтваряне на кристалите на формазан и се измерва при 540 nm, като се използва Spectramax M2 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

4.4. Степен на екстрацелуларно подкисляване (ECAR) и степен на потребление на кислород (OCR)

ECAR и OCR, показващи съответно клетъчните скорости на гликолиза и окислително фосфорилиране, бяха наблюдавани с анализатора Seahorse XF (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ), както е описано по-рано [78,79]. Накратко, 60,000 SNU620 или SNU620/5FU клетки на ямка бяха посяти в Seahorse XF плаки с шест ямки в RPMI среда, допълнена с 1 процент пеницилин/стрептомицин. След 30 минути инкубация, средата от всяка ямка беше заменена с 80 uL от предварително затоплена среда без серум с 5 mM оксамат, стандартен LDH инхибитор [11]. След това клетките се инкубират при 37 градуса С в продължение на 24 часа. След инкубацията, средата от всяка ямка беше заменена с 180 μL предварително затоплена XFbase среда (съдържаща 10 mM глюкоза, 2 mM глутамин и 1 mM натриев пируват; рН 7,4) за измерване на ECAR и OCR. Резултатите бяха анализирани с помощта на софтуера Wave 2.6.0.31 (Agilent Technologies).

4.5. Количествена обратна транскрипция - полимеразна верижна реакция (qRT-PCR)

Общата РНК се екстрахира с помощта на комплекта за екстракция на обща РНК RiboEx (GeneAll Biotechnology, Сеул, Корея) и сДНК се синтезира с помощта на комплект за обратна транскриптаза (Promega, Медисън, Уисконсин, САЩ). При обратна транскрипция се използва 1 ug обща РНК , а общото количество на синтезираната cDNA е 20 μL.Всеки комплект беше използван съгласно инструкциите на производителя.Количествената PCR беше извършена с помощта на StepOneTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), с Real HelixgPCR Комплект (NanoHelix, Daejeon, Корея), за 40 цикъла, състоящи се от 15 секунди при 95 градуса и 1 минута при 60 градуса. Относителните нива на иРНК се нормализират до нивата на 18S рибозомна РНК, която служи като ендогенна контрола. Последователности на праймерите използвани за qRT-PCR са изброени в таблица 1.

4.6.Wester" блот анализ

Клетките се промиват с 1 × PBS и общите протеини се екстрахират от клетки с помощта на RIPA буфер и 1 процент NP-40 лизисен буфер, съдържащ коктейлни таблетки с протеазен инхибитор (Roche, Basel, Швейцария). Концентрациите на всеки протеин бяха измерени с помощта на Bio-Rad протеинов анализ. Равни количества протеин се фракционират от всяка проба през 8-15 процента SDS-PAGE и след това протеините се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани (GE Healthcare, Мюнхен, Германия) чрез електрофореза. Мембраните бяха блокирани при стайна температура (20-25 градуса) за 1 час, използвайки 5 процента обезмаслено сухо мляко и инкубирани с първични антитела при 4 градуса за една нощ. Впоследствие тези мембрани се промиват три пъти с 1 × Tris-буфериран физиологичен разтвор за 10 минути. Специфични ленти от протеини бяха измерени с хемилуминесцентна система за изобразяване (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). Експресията на протеини беше коригирана от GAPDH. 4.7. Тест за производство на лактат

Производството на лактат се измерва в хранителната среда на SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T и RKO клетки. Тези клетки се инкубират в продължение на 1 ден при 37 градуса и културалната среда впоследствие се заменя със среда без фенолно червено, последвано от инкубиране в продължение на 1 час при 37 градуса. След това средата на всяка клетка беше оценена с помощта на търговски комплект за лактатен флуорометричен анализ (BioVision, Milpitas, СА, САЩ).

4.8. Анализи на активността на LDHA и LDHB

За да се открие активността на LDHA, посочените концентрации на СА се инкубират за 20 минути в буфер, съдържащ 2 mM пируват, 20 μM NADH и 20 mM HEPES-K плюс （pH7,2）. За LDHBактивност беше използван буфер, съдържащ 1 М Tris-HCl (рН 8,0), 25 mM NAD плюс и 2 М натриев L-лактат. Накратко, 10 нанограма от всеки от пречистените рекомбинантни LDHA и LDHB протеини бяха използвани за in vitro анализи на активността на LDHA и LDHB. Един микрограм общ протеин от клетъчни лизати беше използван за вътреклетъчни анализи на LDHA и LDHB активност като ензимен източник. Флуоресценцията на NADH при дължина на вълната на възбуждане от 340 nm и дължина на вълната на излъчване от 460 nm се открива с помощта на спектрофлуорометър (Spectramax M2; Molecular Devices), както е описано по-рано [80]. Активността на LDHA се измерва чрез намаленото количество NADH, докато активността на LDHIB се оценява чрез измерване на количеството NADH, преобразувано от NAD плюс.

4.9. Взаимодействие протеин-малка молекула

Взаимодействието между протеин и малки молекули беше предсказано с помощта на програмата Pyrex. Молекулите LDHA (PDB ID:1l10) и 2D структурите на CA и EGCG, получени от базата данни за съединения на NCBI PubChem, бяха използвани в Pyrex. ID на CA беше 9064, а този на EGCG беше 65064. Относителното разпределение на повърхностния заряд беше показано с киселинната област в червено, основната област в синьо и неутралната област в бяло. Водородните връзки в LDHA комплекси с CA или EGCG, съответно, бяха показани като черни пунктирани линии. Последователностите са получени от UniProt (https://www.uniprot.org, достъпен на 9 ноември 2020 г.) с номера за достъп P00338(LDHA).

4.10. Трансфекция на РНК с къса фибичка (shRNA)

Използвани са pLKO.1 макет-вектор и shRNA, насочен към LDHA вектор, както е описано по-рано [50]. Клетките се посяват в плочи с шест ямки (2 × 10 градуса клетки/ямка) и се инкубират за една нощ. SNU620/5FU клетки бяха трансфектирани с помощта на полиетиленимин (PED) (Polyplus-transfection, llkirch, Франция), ген и PEI съотношението е 1:3. След това трансфектираните клетки бяха третирани с 1 ug/mL пуромицин в продължение на 1 седмица. Контролната клетъчна линия се генерира след инфекция с разбъркан плазмид.

4.11.Свръхекспресия на LDHA

Плазмидът pDEST27-LDHA е конструиран чрез субклониране на LDHA cDNA (закупена от Korea Human Gene Bank, Daejeon, Корея) в pDEST27 (Invitrogen) вектори. Проведени са два комплекта субклонирани за LDHA. За реконструкция на LDHA, SNU620/5FU-shLDHA клетките бяха трансфектирани с pDEST27-LDHA и празен pDEST27 плазмид. Накратко, клетките се култивират до 70 процента сливане. След това клетките бяха третирани със смес, включваща 3 ug ДНК и Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в продължение на 48 часа. След инкубиране, клетките бяха избрани с 200 ug/mL G418 за 1 седмица. След това, за да потвърдим ефикасността на трансфекцията, направихме Western blot анализ.

4.12. Анализ на апоптоза

Апоптозните клетки бяха открити с помощта на комплекта за откриване на апоптоза Annexin V-FITC (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ), съгласно инструкциите на производителя. Накратко, клетките се посяват в шест ямкови плаки (2 × 10 градусови клетки/ямка) и се третират с посочените концентрации на СА и 5FU в продължение на 2 дни. След 2 дни лечение, клетката се промива с 1 × PBS. Клетките се суспендират в 500 μL свързващ буфер и се третират с 5 uL анексин V-FITC и 5 μL пропидиев йодид (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), последвано от инкубиране за 15 минути при стайна температура в тъмното. Интензитетите на флуоресценция бяха изследвани с помощта на BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).

4.13. Тест за откриване на митохондриални реактивни кислородни видове (ROS).

Производството на митохондриална ROS беше открито с помощта на MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator (Thermo Fisher Scientific). Клетките се посяват в плочи с шест ямки (2 × 10 градусови клетки/ямка) и Mito-TEMPO (20 μM; Sigma-Aldrich） се третира предварително за 1 час преди лечението с лекарството. Клетките бяха ресуспендирани в 1 mL от 1 × фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), след което бяха добавени 5 μM MitoSOX. След това клетките бяха инкубирани за 10 минути при 37 градуса. Интензитетът на флуоресценция беше анализиран с помощта на BD FACS CANTO II (BD Biosciences). Флуоресцентното изображение се открива чрез флуоресцентен микроскоп (увеличение, 100 ×) (микроскоп Axioimager M1, Carl Zeiss, Oberkochen, Германия).

4.14. DAPI оцветяване на ядрото

SNU620/5FU се посява в 24-ямкова плака (5 × 104 клетки/ямка) и се третира с посочените концентрации на СА и 5FU в продължение на 48 часа. След промиване с 1 × PBS, клетките се ресуспендират в 1- mL 1 × PBS. След това клетките се оцветяват с 4 ug/mL DAPI за 30 минути при стайна температура и се изследват под флуоресцентен микроскоп (увеличение, 200 ×) (Carl Zeiss).

4.15. Статистически анализ

Резултатите от клетъчната жизнеспособност, производството на лактат, ECAR, OCR, qRT-PCR, LDHA, LDHB активностите, апоптозата и митохондриалната ROS бяха посочени спрямо контролните стойности и изразени като средна ± стандартна грешка на средната стойност от три независими експеримента. Разликите над средната стойност на всяка група бяха анализирани чрез t-тест на Student, докато разликите между групите бяха анализирани чрез еднопосочен анализ на дисперсията с post hoc теста на Tukey, използвайки GraphPad Prism (Версия 5.0, GraphPad Software, San Диего, Калифорния, САЩ).

5. Изводи

Взети заедно, резистентните клетки на рак на стомаха SNU620/5FU имат гликолитични фенотипове, включително повишено производство на лактат и по-висока експресия на LDHA от тези в родителските SNU620 клетки. Ограничаването на гликолизата с CA, като LDHA-специфичен инхибитор, сенсибилизира SNU620/5FU клетките към 5FU. Освен това, съвместното лечение с CA и 5FU повишава митохондриалната ROS и апоптотичната клетъчна смърт в 5FU-резистентни клетки. Нашите открития предполагат, че СА може да бъде обещаващ кандидат за разработването на адювантно лекарство, което намалява резистентността към химиотерапия, базирана на 5FU, чрез ограничаване на активността на LDHA.

Допълнителни материали: Следното е достъпно онлайн на https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22105406/s1, Фигура S1: Ефект на 5FU върху жизнеспособността на клетките SNU620/5FU, Фигура S2: Растежът на SNU620 и SNU620/5FU клетки, измерени чрез преброяване на клетките, Фигура S3: Нива на производство на лактат на SNU620 и SNU620/5FU клетки, Фигура S4: Експресии на PDK изотипове в SNU620 и SNU620/5FU клетки, Фигура S5: Ефект на оксамата върху жизнеспособността на SNU620 и SNU620/5FU клетки, Фигура S6: Ефекти на EGCG върху активностите на LDHA и LDHB, Фигура S7: Ефекти на катехин (CA) върху нивата на експресия на p-PDHA1, PDHA1 и PDKs протеини, Фигура S8: Анализ с калориметрия с изотермично титруване (ITC) на LDHA и CA, Фигура S9: LDHA експресия в SNU620/5FU клетки, трансфектирани с shLDHA, Фигура S10: Измерване на гликолитични фенотипове и клетъчна жизнеспособност в различни ракови клетки, Фигура S11: Суровите данни от Western blot анализ.

Тази статия е извлечена от Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms