Терахерцова спектроскопия с висока разделителна способност на газови продукти от термично разлагане на диабетна и недиабетна кръвна плазма и пелети от бъбречна тъкан

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Резюме

Значение:Едно от съвременните направления в медицинската диагностика се основава на метаболомиката, подход, позволяващ определянето на метаболитите, които могат да бъдат специфичните характеристики на заболяването. Газовата спектроскопия с висока разделителна способност позволява изследване на съдържанието на газови метаболити в проби от биологичен произход. Представяме разработването на метод за изследване на диабетни и недиабетни биологични проби, приготвени като пелети, чрез терахерцова (THz) спектроскопия с висока разделителна способност.

Цел:Основната идея на работата е да се изследва съдържанието на газови продукти от термично разлагане на диабетични и недиабетни сушеникръвна плазмаибъбречни тъканиза разкриване на набор от газови маркери, които характеризират диабета чрез метода на THz спектроскопия с висока разделителна способност.

Приближаване:Представяме подход за изследване на диабетици и недиабетицикръвна плазма(хора и плъхове) ибъбречни тъкани(плъхове), използвайки спектроскопия с висока разделителна способност, базирана на нестационарния ефект на THz честотния диапазон. Бяха разработени методи за приготвяне на проби от кръв и бъбречна тъкан под формата на пелети и за изпаряване на пробите.

Резултати:Измерванията на ротационните абсорбционни спектри на парите при нагряване на пелети, приготвени от кръв ибъбречна тъканбяха проведени в честотния диапазон от 118 до 178 GHz. Абсорбционните линии, появяващи се в спектрите на парите на пробата, бяха открити и идентифицирани. Молекулното съдържание на продуктите от термично разлагане се различава за недиабетни и диабетни проби; например основният маркер е ацетонът, който се появява в кръвта на диабетици (човек и плъхове) и в кръвта на диабетицибъбречна тъкан.

Заключения: Нашата статия илюстрира потенциалната способност за определяне на метаболитното съдържание на биологични проби за диагностика и прогноза на заболявания за клиничната медицина. © Авторите. Публикувано от SPIE под Creative Commons Attribution 4.0 Unported License. Разпространението или възпроизвеждането на това произведение изцяло или частично изисква пълно посочване на авторството на оригиналната публикация, включително нейния DOI. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Ключови думи: терагерцова спектроскопия с висока разделителна способност; термично разлагане; тъкан;кръвна плазма; диабет; лиофилизация.

Ключови думи:терагерцова спектроскопия с висока разделителна способност; термично разлагане; кръвна плазма; диабет; лиофилизация, бъбречна тъкан.

Cistanche опит

1. Въведение

Днес проблемът за диагностиката на социално значими заболявания (диабет, ракови заболявания и др.), Включително ранен стадий, привлича голямо внимание на научните групи в света.Един от новите подходи, откриващ нови възможности в диагностиката и лечението на различни заболявания, е метаболомиката. Метаболомиката е научна област, която изследва крайните и междинните метаболитни продукти на биологична система (клетка, органи или цял организъм). Метаболомиката може да разкрие метаболитите, които могат да бъдат специфичните характеристики на заболяването и могат да играят голяма роля в диагностиката и прогнозата за дадено заболяване. Средите, съдържащи крайните и междинните метаболитни продукти в човешкия организъм и полезни за разкриване на метаболитите, свързани със заболявания и патологии, са издишаният дъх, кръв, урина, слюнка и др.

Едно от социално значимите заболявания, застрашаващи качеството на живот на хората, е диабетът. Захарният диабет тип 2 преди беше заболяване на средната възраст, но сега се диагностицира при възрастни, млади хора и деца. Резултатите от метаболомни изследвания на проби от кръв и урина на пациенти с диабет на възраст от 18 години, както и деца от 1 до 13 години са представени в базата данни на човешкия метаболом (HMDB).1 Основно кръв (21 химични вещества, включително изомери), урина ( Изследвани са 30 химически вещества, включително изомери) и цереброспинална течност (1 химично вещество). Например, (R)-3-хидроксимаслена киселина беше открита и в трите вида течности. Някои вещества (ацетооцетна киселина, D-фруктоза и D-глюкоза) са открити и в двете течности (кръв и урина). По-характерната характеристика на диабета (ацетон, CH3COCH3) присъства само в урината. Пробите от течности, резултатите от изследванията, представени в HMDB, са изследвани чрез различни методи — газова хроматография;2 газова хроматография с мас-спектрометрия;3,4 газо-течна хроматография с мас-спектрометрия;5 спектроскопия с висока разделителна способност на ядрени протонен магнитен резонанс;6 и методи, използващи специални устройства за мониториране на състоянието на пациенти с диабет, система за непрекъснат мониторинг на глюкозата.7

Развитието на хронично бъбречно заболяване е основно усложнение на захарния диабет. Въпреки че определянето на гликиран албумин е обичайният подход към скрининга, увреждането на бъбреците може да започне много преди да се появят клинично значими промени в албумина в урината. Като се има предвид многофакторната патогенеза на хроничното бъбречно заболяване, са взети предвид различни маркери за неговия скрининг.8,9 Въпреки това, тяхната диагностична стойност без бъбречна биопсия изглежда съмнителна.

Спектроскопският подход може да предостави информация за съдържанието на биологичните проби, които могат да се използват за медицинска диагностика. Терахерцовият (THz) честотен диапазон е много важен за изследване на газовете, течностите и тъканите на живите организми. Има някои рецензии, посветени на приложенията на методи на THz честотен диапазон, включително THz времева спектроскопия, THz рефлектометрия и THz изображения за биология и медицина.10

THz времева спектроскопия позволява откриване на спектрите, където коефициентът на поглъщане или индексът на пречупване има някои спектрални характеристики, съответстващи на присъствието на някои биомолекули (протеини, захари и др.) в пробите или техните различни концентрации.11

Молекулярната абсорбционна спектроскопия и по-специално THz газовата спектроскопия е много обещаващ подход за изследване на многокомпонентни газови смеси от различен произход.12 Пробите в течно и твърдо състояние могат да бъдат изследвани чрез изпаряване или термично разлагане. Метаболитите-маркери на социално значими заболявания (диабет, рак и др.) Могат да бъдат разкрити по неговите спектрални линии в спектрите на поглъщане, извършени при предаване на радиация през газови проби.

Нивото на ацетон в проби от издишания въздух и урина, взети от пациенти с диабет (12 души), се измерва с помощта на терагерцов спектрометър с фазово изместване на действащото лъчение. Експериментите са направени в сътрудничество с Националния медицински изследователски център Алмазов. Измерванията са извършени на линиите на абсорбция на ацетон с централни честоти 150.537 и 151.647 GHz. Измерванията са извършени без нагряване. Едновременният анализ на пробите от издишания дъх и урината на пациенти с диабет разкри, че нивото на ацетон в урината е много по-високо, отколкото в издишания дъх, в някои случаи с порядък по-високо.13,14

Резултатите от THz газова спектроскопия с висока разделителна способност накръвна плазмана пациенти и плъхове (условно здрави и с диабет), както и на плъховебъбречна тъкан(здрави и с диабет) се представят изсушени и пресовани на пелети. Тъканите иликръвна плазмана живи организми, без никаква подготовка, трябва да се изследват веднага след вземането на пробата. Препаратът под формата на пелети позволява изследване след достатъчно дълго време след вземане на кръв или бъбречна биопсия.

2 Експерименти и методология

2.1 Метод за приготвяне на пелети от кръвна плазма и бъбречни пелети

Венозна кръв от пациенти със захарен диабет тип 2 и условно здрави участници бяха събрани в ендокринологичния отдел на Националния медицински изследователски център Алмазов; центърът предоставя медицински грижи за пациенти с диабет. Трима пациенти и двама участници бяха мъже на еднаква възраст (39 до 43 години). Всички експериментални протоколи, използвани в това изследване, бяха прегледани и одобрени от пациентите и участниците и Комисията за използване на Медицинския център. Венозна кръв се събира сутрин след 8 до 12 часа гладуване в епруветка с антикоагуланта K3EDTA (Vacutest Kima, Италия). Получава се плазма за анализ на биохимични параметри чрез центрофугиране на цяла кръв при 3000 rpm за 15 минути в лабораторна центрофуга (Eppendorf 5702R, Германия) при температура þ4 градуса. Стойности на биохимичните параметри накръвна плазмапробите и референтните интервали са представени в таблица 1 (нивото на гликиран хемоглобин е получено от цяла кръв). Таблица 1 показва, че концентрацията на глюкоза, триглицериди и гликиран хемоглобин в пробите на пациент с диабет се повишава съответно 1,5, 2 и 2,3 пъти.

Изследването е проведено и с мъжки плъхове Wistar на възраст 8 седмици и тегло от 180 до 200 g, съгласно протокола от експериментални изследвания, одобрен от Комисията за грижа и използване на животните към Института за експериментална медицина Национален медицински изследователски център Алмазов. Нивото на глюкозата при животните от експерименталната група е 21 mmol ∕ l след 120 минути след натоварване с глюкоза. Интактните плъхове бяха използвани като контролна група. Венозна кръв се събира от долната празна вена преди животните да бъдат евтаназирани. Също така, бъбрекът беше събран. Кръвните проби се събират в епруветки, съдържащи антикоагулант.

Тестовите проби бяха замразени при температура от −80 градуса (хладилник с ниска температура DW-86L388A, Haier, Китай). След това се лиофилизира чрез сушене чрез замразяване Vaco 2 (ZirBus, Германия) при температура от −50 градуса и налягане от 3 Pa. Замразяването се извършва преди лиофилизирането, тъй като по време на лиофилизирането под въздействието на високо вътрешно налягане биологичните компоненти могат да бъде унищожен. Изсушените проби представляват гъба, състояща се от биологични кристали. Гъбата се разрушава с метална шпатула и се натрошава на кристали с размер няколко десетки микрометра. Използването на хаванче и пестик беше невъзможно, тъй като смилането на протеините в състава на пробите би довело до нежеланото им слепване и образуването на кръгли гранули.

Лиофилизираните проби на прах се претеглят (аналитична везна OHAUS Discovery, Швейцария) и след това се поставят в стоманена пресформа. С помощта на лабораторни преси (Angkor, Русия и Specac, UK) при определено налягане на формоване,кръвна плазмаса получени пелети и бъбречни пелети. Всеки кристал от пелети съдържа определен процент мазнини (триглицериди), протеини (албумин) и фибриноген - всички нормални или гликирани (в случая на диабет). Пелетите от пробите от контролната група по-нататък се наричат ​​"недиабетни пелети", а пелетите от пробите отдиабетна група по-нататък се наричат ​​"диабетни пелети".

Експериментална настройка за спектроскопия с висока разделителна способност 2,2 THz

THz спектроскопия с висока разделителна способност, базирана на нестационарни ефекти, позволява анализ на компонентния състав на многокомпонентни газови смеси газ и пара. Спектрометрите осигуряват чувствителност, близка до теоретичната граница, с разделителна способност, ограничена само от ефекта на Доплер и могат да записват бързи процеси. Чувствителността се запазва дори при значително намаляване на налягането на газа и е приблизително 0.2 ppb в режим на сканиране за някои газове (напр. амоняк при измервания на абсорбционната линия близо до честота от 572 GHz). В допълнение, той дава възможност за определяне на компонентния състав на газова смес с висока надеждност.12 Проведено е изследване на продуктите на термично разлагане на пелети с помощта на метода на THz нестационарна газова спектроскопия в диапазона от 118 до 178 GHz. Спектрометърът използва фазово заключена верига за автоматично управление на честотата на лампата с обратна вълна и фазовото изместване, регистрация във времевия домейн, осредняване и обработка на спектроскопичния преходен сигнал. Устройството регистрира сигнал във времевата област. Парите на пробите се анализират, като се използва следната процедура. Пелетите се поставят в епруветка с помощта на вакуумна помпа, постепенно се нагрява епруветка (до 240 градуса) и получената смес от продукти на термично разлагане на пробата се пуска в измервателната клетка. Файлът с данни обикновено включва записи на избран или на целия работен диапазон на спектрометъра. Следователно веществата могат да бъдат идентифицирани чрез абсорбционни линии, появяващи се в общия спектър на пробата, а динамиката на концентрациите в смес може да бъде проследена чрез сравняване на няколко файла с данни. Веществата бяха идентифицирани чрез търсене в бази данни с отворен код MW, mmw и THz.15,16

3 Анализ на парите на кръвната плазма и бъбречните пари с помощта на терахерцов спектрометър с висока разделителна способност

С нашите системи THz-TDS ние измервахме предаването на пелети в спектралния диапазон от 0.2 до 1,4 THz,17 но знаем, че биомолекулите и по-специално техните продукти на разлагане в газово състояние имат информативен отговор (ротационна абсорбция спектри) при тези честоти и по-ниски, така че извършихме допълнително проучване на THz газов спектрометър с висока разделителна способност. Откритите линии на абсорбция на вещества при хора с диабеткръвна плазмасъвпадат с веществата на недиабетични хоракръвна плазма, с изключение на ацетон. В работния честотен диапазон на спектрометъра (118 до 178 GHz) има много абсорбционни линии на ацетон. Обикновено е повече от достатъчно да се открие някаква линия на поглъщане на едно вещество за недвусмислено определяне на присъствието на веществото в многокомпонентната газова смес. Пример за запис на части от спектрите на абсорбция с линията на абсорбция на ацетон е показан на фиг. 1. Ацетонът може да се появи в кръвта при нарушение на метаболизма на въглехидратите. Както се отбелязва в литературата, кръвта на пациенти с диабет съдържа -OH-бутират и ацетоацетат, но по-късно тези вещества се разлагат на ацетон и въглероден диоксид.18 Въглеродният диоксид няма диполен момент; следователно няма ротационни преходи. Неговото повишено съдържание може да бъде открито само чрез изследване на вибрационния спектър на пробата в инфрачервения диапазон.

Вещества от плазмени пари, като карбонилсулфид (OCS), серен диоксид (SO2), мравчена киселина (HCOOH), изоцианова киселина (HNCO) и амоняк (NH3), бяха открити както в човешки диабетици, така и в човешки проби без диабет. В някои случаи има една експериментална линия, открита в спектрите на пробата, съответстваща на повече линии от една за едно вещество (напр. изоцианова киселина) в каталожните данни (вижте таблица 2).15,16

Това се обяснява с факта, че каталозите съдържат данни за свръхфините структури на веществата, които не са разрешени в този експеримент, тъй като линиите имат крайна ширина от порядъка на няколкостотин kHz. Получените абсорбционни линии на изследваните вещества съвпадат с абсорбционните спектри на парите на капилярната кръв икръвна плазмана пациенти с диабет и условно здрави участници, които бяха публикувани в предишната ни работа.19 Откритите газообразни вещества може да са се образували по време на подготовката на пробата като продукти от химическата трансформация на аминокиселини. Въпросът дали тези съединения имат диагностична стойност изисква изследване. В клиничната практика в диабетологията анализът на съдържанието на тези вещества все още не се използва.

Изпаренията накръвна плазмана здрави плъхове съдържа карбонил сулфид (OCS), метанетиол (CH3SH), бутиронитрил (C3H7CN), ацеталдехид (CH3CHO) и мравчена киселина (HCOOH). Пробата накръвна плазмана плъхове с диабет се различаваше по наличието на ацетон. В допълнение към линиите на абсорбция на пропионитрил (C2H5CN), беше открит метилформиат (CH3OCHO).

Проби от изпарения на изсушени пелети от здрави и диабетни плъховебъбречни тъканибяха проучени. Изпаренията набъбречна тъканздрави плъхове съдържат карбонилсулфид (OCS), серен диоксид (SO2), мравчена киселина (HCOOH), изоцианова киселина (HNCO), етилформиат (C2H5OCHO) и пропилей гликол (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Съдържанието на пари в диабетен плъхбъбречна тъкансе различава от здравия плъх по наличието не само на карбонилсулфид (OCS), но и на неговия изотополог OCS-34. Ацеталдехидът (CH3CHO), метанетиолът (CH3SH), етиленсулфидът (C2H4S), метанолът (CH3OH) и гликолалдехидът (CH2ðOHÞCHO) също бяха открити в изпаренията на пелета от диабетен плъхбъбречна тъкан(виж Фиг. 2 и Фиг. 3).

Наличието на серни съединения, като метанетиол, може да се определи чрез термично разлагане на серни аминокиселини (метионин, цистеин и цистин) в състава на кръвния протеин. Метионинът е незаменима аминокиселина, която не се синтезира в човешкия организъм. Получава се от храната и е източник на сяра за биосинтеза на цистеин. Когато серни аминокиселини се нагряват до температури от около 240 градуса, метанетиол и етилен сулфид (разлагане на метионин) се откриват в масовия спектър на тези вещества.20

4. Заключение

Молекулното съдържание на човек и плъхкръвна плазмаи плъхбъбречна тъканпо време на термичното разлагане на пробите е изследвано с помощта на THz спектрометър с висока разделителна способност. Представен е методът за приготвяне на биологични проби под формата на пелети. Този метод дава възможност за съхранение и транспортиране на проби. Газовата спектроскопия с висока разделителна способност позволява определяне на съдържанието на многокомпонентни газови смеси от всякакъв произход, включително биологични със следи от концентрации на газови компоненти. Ацетон е открит при диабетицикръвна плазмамостри. Информация за разликата в съдържанието на диабетици и здравикръвна плазмана мъже и плъхове и диабетици и здрави плъховебъбречни тъканисе получава от абсорбционни ротационни спектри на пари. Използването на THz спектроскопия с висока разделителна способност осигурява качествен анализ на съдържанието на компоненти в проби от кръвни пари ибъбречни тъканипелети. Възможността за извършване на количествена оценка на концентрациите на важни диабетни газови маркери в зависимост от състоянието на пациентитетрябва да бъдат проучени при по-нататъшни изследвания.