Потенциалът против стареене на Neohesperidin и неговите синергични ефекти, част 2

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

2.4. In vitro антиоксидантната активност на Neohesperidin е сравнително слаба

Налични са много методи за измерване на in vitro антиоксидантния капацитет и повечето изследователи прилагат един или повече анализи, тъй като всеки метод измерва различни антиоксидантни характеристики на съединението [32]. В това проучване използвахме три метода за определяне на антиоксидантния капацитет, включително DPPH, ABTS и FRAP анализи. Композитният индекс на антиоксидантна ефективност (APCI) беше определен, за да опише и оцени общия in vitro антиоксидантен капацитет на тестваните съединения и техните комбинации. Уравненията на линейната регресия на трите анализа са изброени в Таблица 1. И всички свързани данни бяха представени в Таблица 2. Междувременно APCI беше нанесен на Фигура 4B. От тези резултати можем да видим, че неохесперидин има относително слаб in vitro антиоксидантен капацитет; това предполага, че функцията за разширяване на CLS на неохесперидин не зависи от неговата in vitro антиоксидантна активност. Въпреки това, със сравнително висока in vitro антиоксидантна активност, CD BCD удължава CLS на дрожди BY4742. Като цяло не можем да прогнозираме капацитета за разширяване на CLS на дадено съединение само въз основа на неговата антиоксидантна активност.

A: naringin, B: hesperidin, C: hesperetin, D: neohesperidin, the concentration of A, B, Cand Dis luM. APCI=>(всяка примерна стойност/най-голямата примерна стойност в този метод)/броят методи. Данните бяха изразени като средна стойност ± SEM (n {{0}}) и сравнени с помощта на еднопосочен ANOVA тест за множество сравнения на Sidak при p < 0,05="" от="" graphpad="" prism="" 7.00.="" различните="" букви="" (a,="" b,="" c,="" d,="" e,="" f,g,="" h,="" i,="" j,="" k)="" след="" данните="" показват="" стойности="" в="" една="" и="" съща="" колона="" със="" значителни="">

Моля, щракнете тук, за да научите повече

2.5. Неохесперидинът не може да забави вариацията на извънклетъчното подкисляване на дрождите BY4742

Важни параметри включват състава на растежната среда, както и стойността на pH. Доказано е, че съставът на растежната среда и стойността на pH оказват голямо влияние върху CLS на S.cerevisiae[33]. Ефектите на pH върху CLS на пъпкуващи дрожди са изследвани от предишни проучвания и резултатите сочат механизъм на токсичност на оцетната киселина, свързан с индуцирането на сигнални пътища за растеж и оксидативен стрес в дрождите [34]. За да разберем ефекта на четирите флавоноидни съединения върху вариациите на извънклетъчното подкиселяване на дрождеви култури, ние открихме стойностите на pH на всеки пет минути с помощта на pH метър.Екстракт от цистанче против радиацияНа фигура 5, 10uM нарингин очевидно забавя вариацията на извънклетъчното подкиселяване на пъпкуващи дрожди BY4742 при различни състояния на стареене, докато другите три флавоноидни съединения не го повлияват значително при същата концентрация в сравнение с контролните групи.

Фигура 5. Вариации на културните среди след напъпилите дрожди BY4742, третирани с четирите флавоноидни съединения при 10 μM. Експериментът е проведен най-малко в три екземпляра. ∶ Нарингин, B: хесперидин, C: хесперетин, D: неохесперидин.

3. Дискусия

Предишни проучвания съобщават, че неохесперидинът проявява различни функции, свързани със стареенето, като невропротективен ефект [15], ROS-почистваща и противовъзпалителна активност [35], отслабване на намаляването на потенциала на митохондриалната мембрана и увеличаване на каспаза{ {5}} активност, предизвикана от H2O2 [16], и активност, предизвикваща клетъчна апоптоза [21]. Всички тези функции поставиха добра основа за резултата, че неохесперидинът увеличи CLS на пъпкуващи дрожди BY4742 тук. Изненадващо е, че неохесперидинът удължава значително CLS само при най-ниската тествана концентрация. Докладът на Craker, et al. също показа по-ниска концентрация на ауксин (10-6 IAA) насърчава протонната екструзия. Протонната екструзия при висока концентрация на ауксин (10-4 IAA) се инхибира от индуцирания от ауксин етилен [36].цистанче билкаАктивността на неохесперидин за отстраняване на ROS беше проверена в нашето изследване. In vitro антиоксидантният капацитет на неохесперидин е относително слаб, което обяснява защо CLSextension функцията на неохесперидин не зависи от неговата in vitro антиоксидантна активност. Въпреки това, комбинациите CD и BCD имат висока in vitro антиоксидантна активност и повишават CLS на дрождите (Фигура 3B). Слабата корелация на ROS и антиоксидантната активност може да бъде причинена от метода, който използвахме за анализ на антиоксидантната активност. Методът за антиоксидантна активност се опитва да реагира с двойна връзка при C2-C3 и/или хидроксилна група при C3 на С пръстена на флайоноида. В Areias et al. резултатите силно предполагат, че по-високата антиоксидантна активност на флавоноидите не е свързана с наличието на двойна връзка при C 2-C3 и/или хидроксилна група при C 3 на С пръстена, а по-скоро може да зависи от способността да инхибира производството на реактивни кислородни видове за хидрофобно взаимодействие с мембраните [37]. В същото време голям брой изследвания показват, че някои антиоксиданти имат функцията да удължават живота, но специфичните им механизми на действие са сложни. Доказано е, че само някои антиоксиданти показват ефекти против стареене, свързани с преките свободни радикали и изчистването на ROS. Но удължаващите живота ефекти на други антиоксиданти върху моделни организми не се ограничават до директна антиоксидантна функция, но също така включват регулиране на свързаната със стреса генна експресия и индуциране на токсични стимулиращи ефекти [38]. Следователно е невъзможно да се предскаже способността на дадено вещество да удължи CLS на дрождите въз основа на неговата антиоксидантна активност. Въпреки че не тествахме резултата при други щамове, той предложи информация за други изследователи и учени за валидиране на резултата при други щамове и моделни организми.

Cistanche може да спре стареенето

Много клетъчни процеси и външни фактори влияят отрицателно върху хронологичния живот на дрождите, включително средно подкисляване и оксидативен стрес [39]. Една от ранните промени, които настъпват в клетките на дрождите, отгледани в среда, съдържаща 2 процента глюкоза (декстроза), е производството на оцетна киселина и подкисляването на средата, за което е доказано, че влияе върху хронологичното стареене [38]. Буферирането на средата до pH 6-7 предотвратява подкисляването и увеличава хронологичния живот [10,39-41]. Освен това, оцетната киселина може да се използва от Saccharomyces cerevisiae за растеж и метаболизъм, въпреки потенциалната й токсичност [42]. 10 uM неохесперидин, хесперидин и хесперетин поддържат тенденцията на изменение на стойностите на извънклетъчното рН в сравнение с контролата (Фигура 5). Въпреки това, 10 uM нарингин ясно забавя вариацията на извънклетъчното подкисляване (Фигура 5). При тази концентрация CLS на дрожди BY4742 беше третиран с неохесперидин, хесперидин и хесперетин бяха почти същите като контролната група.

Повишеното извличане на ROS има подчертан ефект върху CLS в дрождите, но причината остава неразрешен проблем [33]. Стареенето и свързаните с него заболявания са следствие от медиирано от свободните радикали увреждане на клетъчните макромолекули и тяхната неспособност да противодействат на ендогенните антиоксидантни защитни механизми [43]. Данните обаче показват, че ROS също могат да играят положителна роля в индуцирането на гени за отговор на стреса (хормезис) [43-46].

Освен това, скорошни открития предполагат, че типът ROS и времето, в което се появяват, са важни за удължаването на живота на S.cerevisiae [47-49], което илюстрира сложната роля на ROS при стареенето на дрождите. Грациано и др. [47] съобщават, че неохесперидинът намалява генерирането на ROS в човешки кератиноцити.растеж на пениса cistancheNohara и др. наскоро разкри, че нобилетин (един от флавоноидите в цитрусовите плодове) засилва митохондриалното дишане в скелетните мускули, за да насърчи здравословното стареене срещу метаболитни предизвикателства. Производството на ROS е значително потиснато от лечението с нобилетин по дозозависим начин [50]. Фигури 3В и 4А показват, че D и CD повишават CLS на дрожди BY4742 и намаляват вътреклетъчното съдържание на ROS. Но за ABD и BCD те удължиха CLS, докато увеличиха вътреклетъчния ROS. Този резултат е в съответствие с Wu's 51]. И така, нямаше сигурна положителна или отрицателна връзка между активностите на съединенията за почистване на ROS и техните ефекти върху продължителността на живота и това също беше в съответствие със сложната роля на ROS в стареенето на дрождите.

На Фигура 3А нивата на преживяемост на дрожди BY4742 при третиране с различни съединения и техните комбинации от ден 2 до ден 20 не намаляват постепенно. Представят двойни пикове. Това може да се намери и в резултата на Wu et al. (2014 г.). През първите няколко дни нивата на оцеляване бяха относително високи. Това може да се обясни с достатъчно хранителни вещества и нисък натиск за оцеляване през това време. С течение на времето точките на долината се появиха за много кратко време, тъй като храненето намаля. След това отново се появиха пикове. Това явление може да припише успеха на метаболизма на друго хранително вещество, което облекчава натиска за оцеляване.

Тихо ал. [36] съобщават, че антиоксидантната активност на комбинацията от антиоксидантна смес/съединение е по-ефективна от едно съединение. В нашия експеримент комбинациите AB, AC, CD, ABC и BCD имаха по-силен антиоксидантен капацитет от всяко отделно вещество, съответстващо на тях.ползи от цистанче салсаВъз основа на нашите наблюдения може да се заключи, че флавоноидите, присъстващи в смес, могат да взаимодействат и техните взаимодействия могат да повлияят на общия антиоксидантен капацитет на разтвор (Фигура 4B). Въпреки че демонстрирахме, че четирите флавоноидни взаимодействия предизвикват синергични или антагонистични ефекти за антиоксидантната сила, има други флавоноидни комбинации, които изискват по-подробно проучване, за да се разберат по-добре механизмите, включени в тези взаимодействия. Lutchman и др. [52] съобщават за растителни екстракти, които повишават CLS на дрождите. И автофагията, насърчавана от намаленото TORC1 сигнализиране, е критично важна за дълъг CLS [10]. Като се позоваваме на тези проучвания, можем да проучим начина, по който съединенията изпълняват своя ефект в бъдещи проучвания.

4. Материали и методи

4.1.Материали

Щамът от див тип S. cerevisiae BY4742(ATCC⑧,201389TM)(Mata his3A1 leu2△0 lys2A0 ura3A0) е получен от American Type Culture Collection (Manassas, VA, САЩ). Културата на референтния щам дрожди се разделя на аликвотни части в 10 uL и се съхранява при -80 градуса. Всички L-аминокиселини, дрождена азотна основа без аминокиселини (YNB), амониев сулфат, пептон, агар и екстракт от дрожди, H2DCFDA, 2,4,6-трипиридил-s-триазин (TPTZ),2, 2'-и-бис(3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина)(ABTS),1,1-дифенил-2-пикрилхидразил(DPPH), диметилсулфоксид (DMSO), неохесперидин , нарингин, хесперидин и хесперетин са закупени от Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай). YPDBroth, YPD и други химикали са от Solebo Biotech Co., Ltd. (Пекин, Китай). 96-Ямковите полистиренови микроплаки с плоско дъно са закупени от Corning Corporation (Kennebunk, ME, САЩ).

4.2. Продължителност на живота и анализ на Grozoth на дрождени клетки

Определянето на хронологичната продължителност на живота (CLS) на дрождите се извършва съгласно метода на Wu et al. [25] с умерена модификация, както следва. Накратко, дрождевите клетки бяха приготвени чрез прехвърляне на набраздени щамове от замразени суровини върху YPD агар (0.5 процента екстракт от дрожди/1 процент пептон/2 процента декстроза/1,4 процента агар) плаки. След инкубиране на клетките при 30 градуса в продължение на 2 дни, единична колония беше взета и инокулирана в 1.{{10}}mL течна среда YPD (1% екстракт от дрожди/2% пептон /2 процента декстроза) в 10-mL стерилизирана центрофужна епруветка (обло дъно) и култивирана при 30 градуса за 2 дни в плосък инкубатор при 200 pm. 2-дневната YPD култура се разрежда с автоклавирана 18 Qm Milli-Q вода (1:10) и се съхранява в хладилник при 4 градуса за 2 дни. След 2-дневна инкубация при 4 градуса, 5 μL (≈1×10* клетки) от разредената култура се прехвърля в 993 микролитра синтетично дефинирана (SD) среда (допълнителна таблица S1, [51]) и се поддържа при 30 градуса, 200 оборота в минута за целия експеримент. Съединения в DMSO с няколко концентрации （2,0 μL） бяха добавени при първоначалното инокулиране （0 h）. Всеки експеримент се провежда най-малко в три екземпляра. Клетъчните култури се инкубират при 30 градуса без подмяна на средата за стареене по време на експеримента. След 2 дни култивиране в среда за стареене, клетките достигат стационарната фаза и след това се взема първата възрастова точка. Следващите възрастови точки бяха взети на всеки 2-4 дни. За всяка възрастова точка 5,0 μL от смесената култура се пипетират във всяка ямка на 96-ямкова микроплака с плоско дъно. След това към всяка ямка се добавят деветдесет и пет микролитра YPD среда. Клетъчната популация се наблюдава с четец на микроплаки (Varioskan Flash; Thermo Scientific, Waltham MA, САЩ) чрез записване на OD660 на всеки 10 минути за 24 часа.

Степента на преживяемост беше изчислена както следва[25]. Където tOD=0.3,2day е времето, когато стойността на OD на възрастовата точка от ден 2 достига 0.3 в кривите на растежа. Първоначалната възрастова точка (ден 2) се определя като 100 процента жизнеспособност и относителният процент на оцеляване на всяка следваща възрастова точка може да се изчисли, както следва:

Интегралът на оцеляване (Sl) за всяка ямка се определя като площта под кривата на оцеляване (AUC) и може да бъде оценен по формулата:

където денят е възрастовата точка, като дни 2,4,6,8,10,12,14,16,18 и 20.

4.3. Вътреклетъчни анализи на способността за почистване на ROS

За количествено определяне на нивото на вътреклетъчните реактивни кислородни видове (ROS) на дрождеви клетки, отглеждани в стандартна SD среда с/без четирите съединения, методът, описан в Wu et al. [51] е посочено. А именно, 2 μL ROS сонда H2DCFDA от пресен 5-mM изходен разтвор в DMSO беше добавен в 1.0 mL култура на стареене на дрожди (на ден 2) при 3{{10 }} градуса за 1 час. След това културата се промива два пъти в стерилна дестилирана вода и се суспендира в 1.0 mL 50 mM Tris/Cl буфер (рН 7.5). Бяха добавени двадесет микролитра хлороформ и 10 μL от 0,1 процента (w/o) натриев додецил сулфат (SDS) и клетките бяха инкубирани при 200 rpm за 30 минути, за да се позволи на багрилото да дифундира. Културата се центрофугира при 5000 rpm за 5 минути и флуоресценцията на супернатанта се измерва с помощта на четец на микроплаки с възбуждане при 480 nm и емисия при 520 nm.

4.4. Тест за антиоксидантна активност

В това проучване са използвани DPPH, FRAP и ABTS анализи за in vitro оценка на антиоксидантния капацитет. Анализът на DPPH се извършва съгласно метода, описан от Barreca et al [53]. Аликвотна част от всяка проба (0.5 mL) се смесва със 75 uM (3.5 mL) DPPH в метанол до краен обем от 4.0 mL след реакция за 30 минути без светлина, абсорбцията на сместа се открива при дължина на вълната 517 nm. Процентът на инхибиране на активността за отстраняване на радикалите беше стойността на DPPH. FRAP анализът се провежда съгласно Hunger et al. [54] с някои модификации. 0.2 mL аликвотна част от пробата се смесва с 3,8 mL FRAP реагент (0.3 mol/L ацетатен буфер (pH3.6), 10 mmol/L TPTZ разтвор и 20 mmol/L железен хлорид (FeCl3) се смесват (10:1:1, обемно съотношение)). След 30 минути абсорбцията се открива при дължина на вълната 593 nm. И ABTS анализът следва метода на Mnb et al. [55] с малки модификации. ABTS радикалният катион (ABTS· plus) се генерира чрез реакция на 176 μL разтвор на калиев персулфат （140 mM） и 10 mL воден ABTS разтвор （7 mM） при условия на липса на светлина за 12-16 h. След това се разрежда с метанол до стойност на абсорбция от 0.7±0.02 единици при 734 nm. 0.1 mL проба се добавя към 4.9 mL ABTS реагент.cistanche tubulosa дозировка redditАбсорбцията се измерва при дължина на вълната 734 nm след 10 минути реакция. Всички стойности на абсорбцията бяха определени чрез използване на UV-VIS спектрофотометър (PerkinElmer Lambda 25 UV/VIS, Waltham, MA, USA). Стойностите на антиоксидантите бяха изчислени по метода на стандартната крива и изразени като Trolox еквиваленти (TE mg/g DW).

4.5. Откриване на извънклетъчно pH

Процесът на култивиране на дрожди в ранния етап беше почти същият като метода, описан в частта "Продължителност на живота и анализ на растежа на дрождевите клетки". Конкретната операция беше следната. Клетките на дрождите се приготвят чрез прехвърляне на щама на дрождите от замразени суровини върху плаки с агар YPD. След инкубиране на клетките при 30 градуса в продължение на 2 дни, единична колония беше избрана и инокулирана в 1.0-mL течна среда YPD в 10-mL стерилизирана центрофужна епруветка и култивирана при 30 градуса за 2 дни в плосък инкубатор при 200 pm. 2-дневната YPD култура се разрежда с автоклавирана 18 mΩ Milli-Qgrade вода（1∶10）и се съхранява в хладилник при 4 градуса за 2 дни. След 2-дневна инкубация при 4 градуса, 10 μL（~2×104 клетки） от разредената култура се прехвърлят в 1986 μL SD среда и се поддържат при 30 градуса, 200rpm за 2/10/20 дни. Различни съединения в DMSO（4.0 μL） бяха добавени към средата до крайна концентрация от 10 μM при първоначално инокулиране （0 h）. След това 1 mL от 2/10/20-ден SD култура се добавя към 19 mL прясна течна YPD среда. pH се тества на всеки пет минути с помощта на pH метър, докато дрождите се култивират при 30 градуса C в шейкър при 200 rpm за цялото откриване. Всеки експеримент се провежда най-малко в три екземпляра.

4.6.Анализ на данни

Суровите данни от четеца на микроплаки бяха експортирани в Microsoft Excel 2007 (Redmond, WA, USA). От кривите на растеж може да се получи жизнеспособността на дрождите съгласно предишен доклад [25]. Интегралът на оцеляването [56] на всяка култура на стареене се определя като площта под кривите на оцеляване [25,57]. Данните бяха анализирани чрез еднопосочен дисперсионен анализ (еднопосочен ANOVA) и бяха изразени като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Значението на разликата (* стр<><0.01;***><0.001;*><0.0001) was="" determined="" using="" sidak's="" multiple="" comparisons="" test.="" graphpad="" prism="" 7(graphpad="" software,="" inc.,="" la="" jolla,="" ca,="" usa)was="" used="" for="" the="">

5. Изводи

В заключение, неохесперидин, с относително висок капацитет за отстраняване на вътреклетъчни ROS, показва голям потенциал за разширяване на CLS на пъпкуващи дрожди BY4742 индивидуално или синергично с хесперетин. Това може да доведе до нови избори за лечение на проблеми със стареенето, тъй като има ограничена връзка между CLS-удължаването на дрождите и тестваните индекси (напр. способност за пречистване на ROS, in vitro антиоксидантна активност и извънклетъчно pH). Допълнителни изследвания за откриване на молекулярните механизми на това явление ще бъдат изключително полезни за предотвратяване на стареенето. Поради това важността на избора на най-добрата комбинация от флавоноиди трябва да се има предвид при проектирането на нови хранителни добавки или функционални храни.

Тази статия е извлечена от Molecules 2019, 24, 4093; doi:10.3390/molecules24224093 www.mdpi.com/journal/molecules