Благоприятните ефекти на вербаскозид от билката Cistanche

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Вербаскозидът предпазва мишките от клостридиална газова гангрена чрез инхибиране на активността на алфа токсина и перфринголизин О

Газовата гангрена, причинена главно от анаеробната бактерия Clostridium perfringens (C. perfringens), причинява смърт в рамките на 48 часа от началото. Налични са ограничени терапевтични стратегии и това е свързано с изключително висока смъртност. Алфа-токсинът на C. perfringens (CPA) и перфринголизин O (PFO) са важни вирулентни фактори в развитието на газова гангрена, което предполага, че те са терапевтични цели. Ето, открихме товавербаскозид, a фенилпропаноиден гликозидшироко разпространен в Китайски билкови лекарства Cistanche, може ефективно да инхибира биологичната активност както на CPA, така и на PFO в хемолитични анализи.

Олигомеризацията на PFO беше забележително инхибирана от вербаскозид. Въпреки че не е наблюдавана антибактериална активност,вербаскозидлечението предпазва Caco-2 клетките от увреждането, причинено от CPA и PFO. Освен това, заразени мишки, третирани свербаскозидпоказа значителнооблекчени щети, намалено бактериално натоварване, инамалена смъртност. В обобщение,вербаскозидът има ефективен терапевтичен ефект срещу вирулентността на C. perfringens както in vitro, така и in vivoчрез едновременно насочване към CPA и PFO. Нашите резултати предоставят обещаваща стратегия и потенциално водещо съединение за инфекции с C. perfringens, особено газова гангрена.

Ключови думи: алфа-токсин, антиинфекция, Clostridium perfringens, газова гангрена, перфринголизин О, вербаскозид

Clostridium perfringens (C. perfringens) е грам-положителна анаеробна бактерия, която е широко разпространена в природата и в червата на човека (Fraser and Collee, 1975). C. perfringens може да секретира четири основни токсина ( , , ε и Ì) и съответно е разделен на пет серотипа, A–E (Titball, 2005). При хората C. perfringens може да причини различни заболявания, като хранително отравяне и газова гангрена, последната от които може да се появи и при животни, като котки, говеда, кучета, овце, коне и кози (Verherstraeten et al. , 2015). Инкубационният период на газовата гангрена е кратък и инфекцията може да се установи в рамките на 6–8 часа (Uzal et al., 2015). По-сериозно, повече от 50 процента от заразените ще продължат да развиват системна токсемия, в крайна сметка водеща до смърт; по този начин, без навременно и ефективно прилагане на лечение, газовата гангрена може да доведе до сериозни икономически загуби (Low et al., 2018). Въпреки това, обичайните лечения, като антибиотично лечение и хирургично лечение на газова гангрена, всички имат определени недостатъци, включително, но не само, антибиотична резистентност и ампутация на пациентите (Park et al., 2010; Osman and Elhariri, 2013). Следователно е необходимо да се намерят нови методи или идеи за лечение на газова гангрена.

Клостридиалната газова гангрена е фулминантно инфекциозно заболяване, причинено главно от взаимодействието на C. perfringens токсин (CPA) и перфринголизин O (PFO) (Hifumi et al., 2018). CPA, принадлежащ към семейството на бактериалните ензими цинк-метало фосфолипаза, се произвежда от всички C. perfringens, кодира се от хромозоми, е основен токсин в C. perfringens и проявява както фосфолипаза С, така и сфингомиелиназна активност (van Bunderen et al. , 2010; Масатака и др., 2015). През 90-те години Awad et al. (1995) използва CPA мутанти, за да тества модел на мишка с газова гангрена и откри, че щамове без CPA ген показват намалена патогенност и по-малко увреждане на тъканите след инфекция. Тази работа потвърди, че CPA е основният токсин при газова гангрена. През 2000 г. Алберто провежда задълбочени проучвания чрез конструиране на молекулярен модел на а-токсин и мутанти с три бримки в С-терминалния домен и хемолитичната активност и цитотоксичността на мутантите са намалени в сравнение с тези на дивия тип. Беше демонстрирано, че сфингомиелиназната активност и С-терминалният домен са необходими за миотоксичност in vivo (Alape-Giron et al., 2000). PFO, зависим от холестерола цитолизин (CDC), взаимодейства с клетъчната мембрана като мономер и след това подготвеният комплекс се вмъква в двойния мембранен слой чрез олигомеризация, като накрая лизира клетките гостоприемници (Johnson and Heuck, 2014). Въпреки че PFO не е необходим за леталност, той може да причини цитотоксичност на макрофагите в ранните етапи на мионекроза и е важен за образуването на тромби в късните етапи на инфекцията, допринасяйки за патогенезата на газовата гангрена (Verherstraeten et al., 2015). CPA може да се комбинира с PFO, за да увреди неутрофилите, натрупани на заразеното място и да предизвика дисфункция на ендотелните клетки, оток и исхемия, което накрая води до тъканна хипоксия и осигурява благоприятна анаеробна среда за растежа и възпроизвеждането на C. perfringens (Bryant и Stevens, 1996). ). По този начин това проучване е насочено към CPA и PFO и има за цел да разкрие нов метод за лечение на газова гангрена.

В това проучване два инхибитора на токсини са изследвани от 17 природни съединения чрез хемолиза, за да се намери потенциален инхибитор на газова гангрена. Хемолитичните данни за различни съединения са показани в таблица 1. Сред 17-те вида естествени съединения вербаскозидът има най-добър инхибиторен ефект върху двата токсина и по този начин ние избрахме вербаскозид като целево съединение за това изследване. Вербаскозидът е широко разпространен в различни китайски билкови лекарствени билки като цистанче и е изолиран и извлечен отВербаскозидот италиански учен през 1963 г. (Speranza et al., 2010; Zhu et al., 2016). Проучванията показват, чевербаскозидът има много биологични и фармакологични ефекти, катопротивовъзпалителни, антиоксидантни, антибактериални, противотуморни, противогъбични и хелатни свойства, иможе да се използва в козметиката за кожаилокални препарати.Други доклади показват, че вербаскозидът може да се абсорбира напълно в рамките на 1 час и да достигне висока концентрация в кръвта и че неговата бионаличност при доставяне чрез различни методи на инжектиране не надвишава 25 процента (Dai et al., 2017; Feng et al., 2018). Въз основа на гореспоменатите фармакологични активности, това проучване установи и проучи инхибитораефекти на вербаскозидвърху газовата гангрена чрез серия от in vitro и in vivo експерименти.

Вербаскозид инхибира хемолитичната активност на PFO и CPA

Съобщава се, че някои флавоноиди са ефективни инхибитори срещу образуващи пори токсини (Li et al., 2013; Wang et al., 2017; Zhou et al., 2017). Тук е установено, че вербаскозид, фенилпропаноид, инхибира хемолитичната активност както на PFO, така и на CPA токсините, секретирани от C. perfringens. Когато концентрациите на вербаскозид варират от 2 до 32 |ig/mL, лечението с вербаскозид значително инхибира хемолитичната активност на тези токсини по дозозависим начин, което показва, че вербаскозидът е ефективен инхибитор както на PFO, така и на CPA.

Вербаскозидът не влияе върху растежа на C. perfringens

We further performed MIC and bacterial growth curve studies to determine the antibacterial activity of verbascoside against C. perfringens, revealing a MIC assay result (Figure 2A) >256 |ig/mL. По същия начин, резултатите от кривата на бактериалния растеж (Фигура 2B) показват, че вербаскозидът не засяга нормалния растеж на бактериите. Заедно нашите резултати показват, че лечението с вербаскозид няма влияние върху жизнеспособността на C. perfringens при концентрациите, необходими за инхибиране на активността на PFO и CPA.

Вербаскозидът предпазва клетките от увреждане, причинено от PFO или CPA

Clostridium perfringens алфа-токсин и PFO в C. perfringens са основните токсини, които причиняват газова гангрена; по този начин също беше изследвано дали вербаскозидът може да защити клетките от тези два токсина. Първо, проведохме тест за цитотоксичност с лекарството вербаскозид, което не уврежда клетките (Фигура 3А). След това това съединение се добавя към системата за съвместно култивиране на клетки и PFO или CPA. Verbascoside инхибира цитотоксичността на тези два токсинав Caco{{0}} клетки. В сравнение с проби, които не са третирани с вербаскозид, увреждането, предизвикано от токсините върху Caco-2 клетките, третирани с вербаскозид при 0.5 Jig/mL, е значително намалено в зависимост от дозата. Специално за PFO протеина, клетките бяха ефективно защитени при лекарствена концентрация от 0.25 ig/mL (P <0.05). по-нататък="" беше="" използван="" последващ="" анализ="" на="" клетъчна="" жизнеспособност/смърт="" (фигури="" 3d-k),="" за="" да="" се="" докаже="" този="" защитен="" ефект.="" както="" се="" очаква,="" лечението="" с="" вербаскозид="" видимо="" защитава="" срещу="" клетъчно="" увреждане,="" предизвикано="" от="" pfo="" или="" cpa.="" взети="" заедно,="" нашите="" резултати="" установяват,="" че="" вербаскозидът="" значително="" инхибира="" клетъчното="" увреждане,="" предизвикано="" от="" pfo="" или="" cpa="" по="" дозозависим="">

Вербаскозидът инхибира хемолитичната активност на PFO чрез намаляване на неговата олигомеризация

Хемолитичната активност на PFO трябва да бъде придружена от появата на олигомеризация и образуване на пори (Johnson and Heuck, 2014). Тук олигомеризацията на PFO е индуцирана от KCl и заешка кръв и е открита олигомеризация на PFO (Фигура 4), разкривайки намален интензитет на лентата на олигомеризация, когато концентрацията на вербаскозид е повишена. Заедно нашите резултати предполагат, че лечението с вербаскозид инхибира олигомеризацията на PFO и по този начин намалява хемолитичната активност на този токсин.

Вербаскозидът предпазва мишките от инфекция с C. perfringens

Създаден е мускулен модел на гангрена на крака на мишка, за да се определи дали защитата, наблюдавана in vitro, може да се наблюдава и in vivo. Краката на мишки, заразени с ATCC13124-, бяха за разлика от тях, броят на възпалителните клетки в лекарствената група беше значително намален и тъканта беше непокътната след лечение с вербаскозид. В допълнение, броят на бактериите, колонизирани в мускулите на краката, е значително намален след лечение с вербаскозид. Както се вижда от резултатите от експеримента, 93,33 процента от заразените мишки умират до 32 часа след заразяването. Както се очакваше, степента на преживяемост на мишките, получаващи вербаскозид, се увеличи с 33,33 процента, тъй като само 60 процента от заразените мишки умряха (P=0.015 чрез логаритмичен тест). Освен това, лечението с вербаскозид забави пика на периода на смърт с близо 8 часа (от 32 часа за ATCC 13124-инфектирани мишки до 40 часа за мишки, третирани с вербаскозид) и по този начин може да удължи ценното време, необходимо за клинично спасяване. Взети заедно, нашите резултати показват, че при мишки вербаскозидът може да осигури системна ефективна защита срещу газова гангрена, причинена от C. perfringens.

Като грам-положителна анаеробна бактерия, C. perfringens е широко разпространен в природата и може да отделя различни токсини, които могат да доведат до различни заболявания при хора и животни, включително газова гангрена (Fraser and Collee, 1975; Verherstraeten et al. ., 2015). Газовата гангрена се причинява главно от комбинацията от а и тета токсини, секретирани от C. perfringens, което може да доведе до смърт на заразени животни, което води до големи икономически загуби. Към днешна дата обаче ефективните методи за лечение на газова гангрена включват хипербарен кислород, хирургия и антибиотици. Сред тях операцията може да причини значителни физически увреждания на пациентите и да има много неудобно въздействие върху следоперативния живот. Множество гени за резистентност към тетрациклин са открити в изолати на C. perfringens от Швеция, Норвегия, Дания и други места. По този начин са необходими нови стратегии или агенти за борба с тази бактериална инфекция (Park et al., 2010; Osman and Elhariri, 2013). В това проучване фенилпропаноидният вербаскозид, който се различава от традиционните антибактериални лечения (антибиотици), може да инхибира хемолитичната активност както на CPA, така и на PFO, два важни порообразуващи токсина, които критично допринасят за патогенността на C. perfringens. На клетъчно ниво вербаскозидът може също ефективно да защити Caco-2 клетките от тези два токсина при ниски концентрации (0.25-2 ig/mL). По-специално, вербаскозидът може да намали активността на токсините чрез инхибиране на олигомеризацията на PFO. Тези резултати могат да предоставят достатъчно основни данни за in vivo изследвания.