Циркадният часовник регулира ритмичната експресия на еритропоетин в мишия бъбрек

За повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Lina K. Sciesielsk и др

Cistanche tubulosa предотвратява бъбречни заболявания, щракнете тук, за да получитепродукти и Cistanches

Генерирането на циркадни ритми е клетъчно автономно и разчита на обратна връзка за транскрипция/транслация, контролирана от семейство активатори на транскрипционния фактор на циркадния часовник, включително CLOCK, BMAL1 и репресори като CRY1 и CRY2. Целта на настоящото изследване беше да се изследва както молекулярният механизъм, така и хемопоетичните последици от циркадната експресия на еритропоетин. Мутантни мишки с хомозиготна делеция на основните циркадни часовникови гени криптохроми 1 и 2 (Cry-null) бяха използвани за изясняване на циркадната регулация на еритропоетина. Контролните мишки от див тип показват значителна разлика вбъбрекекспресия на мРНК на еритропоетин между циркадни времена 06 и 18. Успоредно с това, значително по-голям брой клетки, произвеждащи еритропоетин вбъбрек(с РНКоскоп) и значително по-високи нива на циркулиращ еритропоетин протеин (с ELISA) бяха открити циркадианно време 18. Такива промени бяха премахнати при Cry-null мишки и бяха независими от кислородното напрежение, кислородното насищане или експресията на индуцируем от хипоксия фактор 2алфа, което показва, че че циркадната експресия на еритропоетин се регулира транскрипционно от CRY1 и CRY2. Анализите на репортерния ген показват, че хетеродимерът CLOCK/BMAL1 активира елемент E-box в 5' еритропоетин промотора. RNAscope in situ хибридизация потвърди наличието на Bmal1 в произвеждащи еритропоетин клетки набъбрек. При Cry-null мишки беше установен значително намален брой ретикулоцити, докато броят на еритроцитите и хематокритът бяха непроменени. По този начин, циркадната регулация на еритропоетина в нормоксична възрастна мишкабъбрексе контролира транскрипционно от главните циркадни активатори CLOCK/BMAL1 и репресори CRY1/CRY2. Тази констатация може да има значение зафизиология на бъбрецитеи болести, лабораторна диагностика и лечение на анемия.

КЛЮЧОВИ ДУМИ:хронобиология; циркаден ритъм; часовник; криптохром; еритропоетин; хематопоеза; хипоксия-индуцируем фактор

Изявление за транслация Молекулярните часовници в почти всички типове клетки управляват генна транскрипция в сътрудничество с тъканно-специфични фактори. Досега циркадните колебателни механизми вбъбрекне са свързани с биологията на еритропоетина (Epo). Тук е изяснено, че циркадната Epo експресия се регулира от протеини на главния часовник (криптохроми 1 и 2, Clock и Bmal1). Тъй като EPO действа ясно в рамките на сложната регулаторна мрежа на еритропоезата, оптималното използване на рекомбинантен човешки Epo при пациенти сбъбрекнедостатъчност може да включва прилагането му непосредствено преди неговия физиологичен циркаден максимум около полунощ.

Циркадните ритми в нефрологията са до голяма степен неизследвани, но са много уместни, тъй като тяхното нарушаване от работа на смени, избор на начин на живот и стареене е свързано с повишен риск от различни заболявания, включително сърдечно-съдови нарушения.^1–4Животински модели на нарушени циркадни часовници предоставят първото доказателство за отрицателното въздействие на циркадната дисрегулация върху хемопоетичната система (напр. чрез увеличен брой стари еритроцити).^5,6

Що се отнася до еритропоезата, не само клетъчните ефекти, но и ритмичността на нейния първичен регулатор, еритропоетин (Epo), е от особен интерес, тъй като спортистите многократно са обвинявани в кръвен допинг с рекомбинантен човешки Epo (who) поради разлики в зависимост от времето на деня в циркулиращи Epo концентрации и хематологични параметри.7,8 Денонощните вариации в човешките серумни Epo (S-Epo) нива са описани за първи път през 1981 г. при пациенти с хронични белодробни и респираторни заболявания, работещи във въглища,⁹и впоследствие при здрави индивиди.^10,11Към днешна дата няколко доклада показват високи нива на S-Epo през нощта (от 20:00 до 4:00) и ниски нива на S-Epo рано сутрин (от 4:00 до 8:00). Фазата и амплитудата на S-Epo осцилациите, ако изобщо присъстват, са променливи между хората.^9,10,12,13Средно нивата на S-Epo се променят приблизително 15-пъти спрямо техния минимум.^14–22Доказано е, че този дневен ритъм не се повлиява от стареенето,20 тренировките,16 или излагането на надморска височина.17 Обратно, денонощните колебания на S-Epo се премахват при пациенти с хронична обструктивна белодробна болест, усложнена от дневна хипоксемия, при миелом с бъбречна недостатъчност , и при миелодисплазия.^15,21,23

През 2009 г. ние описахме циркадната Epo mRNA експресия в миши бъбрек в широкомащабен анализ на промоторите на контролирани от часовника гени, но не успяхме да идентифицираме нито отделен генетичен елемент в EPO гена, нито трансактивиращ фактор, отговорен за циркадните колебания. 24 Съвсем наскоро модел на хеморагичен шок при плъх предполага, според паралелни модели на експресия, че часовниковите гени (Bmal1 и Per2) са включени в регулирането на секрецията на ЕРО по време на хипоксия/исхемия.²⁵

Генерирането на циркадни ритми е клетъчно автономно и разчита на обратна връзка транскрипция-транслация, контролирана от семейство транскрипционни фактори на циркадния часовник, включително CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, CRY1 и CRY2.26 Хетеродимерът CLOCK/BMAL1 активира транскрипцията на гените на циркадния часовник PER1/2 и CRY1/2 чрез свързване към елементи на E box в техните промотори. Протеините PER и CRY обаче осигуряват отрицателна обратна връзка чрез инхибиране на активността на CLOCK/BMAL1, като по този начин намаляват собствената си експресия. Нетните резултати водят до моделите на колебания на експресията на циркадния ген и ритмичните промени в клетъчната и органната физиология.²⁷

За да се разберат последиците от биологичния часовник, досега са изследвани различни видове мутантни мишки с нарушени или аблирани едноядрени часовникови транскрипционни фактори. 28, 29 Тук се възползвахме от Cry1–/–/Cry2–/– двоен мутант мишки (Cry-null), които нямат способността да изразяват ендогенни циркадни ритми.^26,30Комбинирани in vivo и in vitro данни показват, че Cry1/2 регулира циркадната експресия на Epo чрез CLOCK/BMAL1-индуцирана транскрипция в нормоксичен бъбрек.

МЕТОДИ

Експерименти с животни

Хомозиготни Cry1–/– /Cry2–/– животни (Cry-null; мъжки и женски; базирани на C57BL/6J)31 и контроли от див тип (WT) бяха развъждани (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) и отглеждани в продължение на 5 до 7 месеца. Мишките WT идват от размножаването на колонията Cry-null.

Генотипът Cry-null беше потвърден чрез полимеразна верижна реакция (допълнителна таблица S1). За увличане, мишките бяха настанени групово и имаха храна и вода ad libitum при 12-hour:12-часов цикъл светлина/тъмнина в продължение на 14 дни. На ден 2 след освобождаване в постоянна тъмнина, животните бяха умъртвени в циркадно време (CT) 06 или 18 (n=13–15 за всяка група и времева точка). Бързо бяха получени тъкани (черен дроб и бъбрек) и бързо замразени в течен азот. Подгрупа от мъжки и женски WT и Cry-нулеви животни бяха анализирани подробно за телесно тегло и диференциална хемограма.

За кръвно-газов анализ животните бяха анестезирани (фентанил, {{0}}.075 mg/kg, мидазолам, 1,5 mg/kg и медетомидин, 0,75 mg/kg), трахеотомирани, интубирани и вентилирани (приливна обем, 9 ml/kg; дихателна честота, 160 min- 1; положително крайно експираторно налягане, 2 cm H2O), както е описано.32 Полиетиленов катетър беше хирургично въведен в лявата каротидна артерия. След 5 минути стабилизиране, експериментът беше прекратен чрез бързо обезкървяване през каротидния катетър, кръвните газове бяха анализирани (ABL-800; радиометър; контролирана температура) и бъбреците бяха изрязани за post hoc анализи.

Всички процедури са разрешени от местния комитет за грижа за животните (T0307/08; G0100/17 с допълнение от януари 2021 г.) и са извършени в съответствие с насоките и разпоредбите на германския закон за защита на животните.

Приготвяне на РНК и количествен анализ на полимеразна верижна реакция

Общата РНК се екстрахира, както е описано.33 Общо 1000 ng обща РНК се транскрибира обратно със SuperScript III обратна транскриптаза (Thermo Fisher; № 18080085) и произволни хексамери (Thermo Fisher; № SO142), съгласно инструкциите на производителя. Количествените полимеразни верижни реакции се провеждат на StepOnePlus cycler (Life Technologies) с праймери, обхващащи интрон или TaqMan анализи (допълнителна таблица S2). Абсолютно количествено определяне на иРНК се постига чрез сравняване със стандартна крива от серийни разреждания на матрица за полимеразна верижна реакция.

Откриване на експресия на Epo mRNA в бъбрека чрез РНКоскопска техника

Анализът с РНКоскоп се извършва съгласно протоколите на производителя (ACD; техническа бележка 320536). Напречните криосекции на 10- mm среден бъбрек бяха оцветени с С1 сонда срещу DapB (отрицателна контрола; ACD; № 310043) или Epo (ACD; № 315501). Стъпките на хибридизация с използване на Amp 4-6 и откриване на червените сигнали бяха пропуснати. Двама независими, заслепени изследователи преброиха Epo положителни клетки при 200 първоначално увеличение, върху 3 до 8 криосекции на животно в система за изображения Axioplan 2 (Zeiss).

Представителни Epo количествени изображения и двойно флуоресцентно оцветяване бяха извършени с помощта на RNAscope Multiplex FluorescentDetection Reagent V2 Kit (ACD; № 323110), съгласно протоколите на производителя. 15- mm средни напречни парасрезове на бъбрека бяха оцветени с С1 сонда срещу Bmal1 (ACD; No. 438741) и C2 сонда срещу Epo (ACD; No. 315501-C2). Opaleye 520 (Akoya BioSciences; No. FP1487001KT) се използва със сондата C1, а опалово багрило 650 (Akoya BioSciences; No. FP1496001KT) се използва със сондата C2. При - 400 първоначално увеличение, Epo положителните клетки бяха изобразени за Bmal1 колокализация в система Eclipse Ti2imaging (Nikon). 40,6-диамидино-2-фенилиндолът се използва като противооцветяване.

EPO серумни концентрации

Кръвните проби се оставят да се съсирят в продължение на 1 час при стайна температура, преди да се центрофугират в продължение на 20 минути при 2000 - g. Серумът беше отстранен и незабавно замразен при –80 °C до извършване на ензимно-свързан имуносорбентен анализ за Epo (Quantikine; R&D Systems; № MEP006) с неразредени проби. Абсорбцията беше отчетена с iMARK Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad) при 450 nm, с корекция на дължината на вълната при 570 nm и 4-стандартна крива за напасване на параметър, както е описано по-горе.³³

Кръвни клетки

общият и диференцираният брой клетки от EDTA-антикоагулирана кръв бяха измерени от Synlab. ветеринар Берлин с ADVIA2120i (Siemens) автоматизиран клетъчен брояч за миша кръв.

Анализи на репортерни гени

Човешки ембрионални бъбречни клетки 293 (DSMZ; No. ACC305; номера на пасажи 3–10; mycoplasma negative) бяха отгледани в модифицирана на Dulbecco среда на Eagle/Ham F12 (Biochrom; No. FG4815), допълнена с 10 процента фетален волски серум (Merck; No. F7524). Клетъчната трансфекция се извършва в 12-плаки с ямки, съдържащи 1.67 - 105 клетки/ямка. Всяка ямка беше трансфектирана с 333 ng плазмидна ДНК (1 от 10 от които беше ванилов конструкт) и 1 ml Fugene 6 трансфекционен реагент (Promega; № E2691), както е описано.34 Всички използвани конструкции са изброени в допълнителна таблица S3. Клетките се лизират 48 часа след трансфекцията с пасивен лизисен буфер (Promega; No. E1941). Луциферазната активност се определя с комплектите Beetle-Juice и Renilla-Juice (и двата pjk GmbH; номера 102511/102531, съответно), на луминометър Lumat LB9501. Всеки експеримент беше извършен в технически дубликати и средните стойности бяха използвани за изчисления.

Статистически анализ

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1.5-сгъване на интерквартилния диапазон) в 4 от 6 циркадни експресирани гена. Данните са анализирани с помощта на IBM SPSS Statistics 27 и са представени като отделни точки с медианата или като ленти със средната стойност и SD. Извършен е тест на Mann-Whitney U или Kruskal-Wallis с Bonferroni като post hoc тест.

РЕЗУЛТАТИ

Аблация на циркадната Epo експресия в Cry-null мишки

За да изясним молекулярния механизъм на циркадната Epo регулация, ние анализирахме Epo mRNA и експресията на протеин в WT и Cry-null мутантни мишки. В WT бъбрек каноничните часовникови гени показват експресия, зависима от времето на деня, докато това е премахнато при Cry-null мишки, както се очаква (допълнителна фигура S1). По-рано докладвахме циркадни колебания на експресията на Epo mRNA за 24 часа за бъбреците на възрастни WT мишки. 24 Фокусирайки се сега върху минималните и максималните стойности, наблюдавахме значителна, w9-кратна разлика между CT06 (период на сън на мишка; очакван минимум ) и CT18 (фаза на активност; очакван максимум; Фигура 1а). В бъбреците на Cry-null мишки, обаче, не е открита значителна разлика в експресията на бъбречна Epo mRNA. Трябва да се отбележи, че при Cry-null мишки, абсолютните количества на бъбречните нива на Epo транскрипт и в двата момента са били между средните нива на WT Epo mRNA при CT06 и CT18 (Фигура 1а). EPO иРНК в съответните черни дробове е под границата на откриване (данните не са показани).

Дневни промени в Epo серумните концентрации

За да оценим транслацията на циркадната Epo mRNA експресия в циркулиращия Epo протеин, ние анализирахме серумни проби чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ. Взети са кръвни проби преди органни проби. Серумният Epo увеличава w2.3- пъти между CT06 и CT18 при WT мишки, но тази разлика е премахната при Cry-null мишки (Фигура 1b). Трябва да се отбележи, че средните концентрации на S-Epo, осреднени във времето (CT06 и CT18), са сходни при WT и Cry-null мишки (22 mU/ml [диапазон, 3–59 mU/ml] спрямо 21 mU/ml [диапазон, 7 –50 mU/ml]).

Експресия на циркадния Epo във връзка с газовите параметри на артериалната кръв и пулсовата оксиметрия

За да се изследва дали потенциалните дневни промени в нивата на кислород в кръвта и тъканите могат да причинят циркадни колебания на експресията на Epo, бяха взети проби от артериална кръв и бяха извършени газови анализи на кръвта в анестезирани, трахеотомизирани и механично вентилирани Cry-null и WT мишки при CT06 или CT18, които съответстват съответно на най-ниските и най-високите циркадни нива на Epo mRNA (Фигура 1а). Не открихме нито значителни разлики в артериалното рН, парциалното налягане на CO2 или парциалното налягане на O2, нито в стандартния базов излишък или концентрации на лактат (Фигура 2a–e) между CT06 и CT18 или WT и Cry-null мишки. Нивата на насищане с кислород, измерени чрез пулсова оксиметрия, също не показват разлики (Фигура 2f). Генната експресия на EPO главния регулатор хипоксия-индуцируем фактор (HIF) 2a не се различава между CT06 и CT18, нито при WT, нито при Cry-null мишки (Фигура 3). По този начин, при нормоксични условия, циркадната Epo регулация не се причинява от промени в напрежението на кислорода.

Циркадно включване-изключване на експресия на Epo в бъбречни Epo-продуциращи клетки

За да се проучи дали циркадната експресия на Epo mRNA се медиира чрез включване на допълнителни бъбречни Epo-продуциращи клетки (REPCs) или единствено чрез увеличаване на експресията на Epo на клетка, RNAscope in situ хибридизация се използва върху средни напречни секции на бъбрека (пример в допълнителна фигура S2). При WT мишки, броят на REPC значително се увеличава между CT06 (медиана, 5; диапазон, 0–25) и CT18 (медиана, 22; диапазон, 5–82; 4.{{ 11}} пъти; P=0,010). За разлика от това, Cry-null бъбреците показват подобен брой REPC при CT06 (медиана, 18; диапазон, 2–33) и CT18 (медиана, 15; диапазон, 4–87; незначително; Фигура 1в). Считахме, че Cry-null мишките проявяват ограничение на растежа поради нарушено сигнализиране на инсулиноподобен растежен фактор 1 (IGF1), което води до непрекъснато нарастваща разлика в телесното тегло и размера на органа между Cry-null и WT мишки.30 Както използвахме относително млади животни, абсолютното тегло на бъбреците на Cry-null мишки е само малко по-ниско, отколкото при WT мишки (–12 процента при Cry-null мишки), но относителното съотношение бъбрек към телесно тегло не се различава (допълнителна фигура S3) . По този начин, циркадното увеличение на експресията на Epo mRNA изглежда се регулира от превключване на допълнителни REPC.

Активиране на минималния EPO промотор от CLOCK/BMAL1

За идентифициране на регулаторните последователности, отговорни за циркадната експресия на Epo (Фигура 4а), бяха проведени анализи на луциферазен репортерен ген в човешки ембрионални бъбречни 293 клетки. Клетъчната линия 293 на човешкия ембрионален бъбрек е избрана не заради нейния бъбречен произход, а поради липсата на ендогенен циркаден часовник. По този начин, стимулиращият ефект на CLOCK/BMAL1 може да бъде тестван в нисък, неколебащ се фон CLOCK/BMAL1. Свръхекспресията на CLOCK/BMAL1 значително стимулира активността на минималния човешки ЕРО промотор (Фигура 4b, I срещу II). Ако мотивът на E-box (–36 до –31 bp спрямо началното място на транскрипция) е мутиран,35 този ефект се притъпява (Фигура 4b, III).

За да проучим дали наблюдаваната циркадна регулация е зависима от клетъчния тип, ние скринирахме няколко ЕРО-експресиращи клетъчни линии за ендогенна часовникова активност чрез наблюдение на Bmal1 промотор-медиирани колебания на луциферазен репортер. Тези с ендогенен ритъм включват HEP3B клетки, получени от човешки хепатом, KELLY клетки, получени от човешки невробластом, и PDGFRbþ миши бъбречни клетки (по-рано EPO експресираща миша клетъчна линия FAIK1-10).36,37 Сред 3-те клетъчни линии, само Клетките KELLY показват луциферазни осцилации, управлявани от EPO промотор (допълнителна фигура S4A). Въпреки че PDGFRb клетките показват силен циркаден ритъм на Bmal1 промоторна активност, ние не открихме колебания, медиирани от EPO промотор, което предполага по-ниска амплитуда на репортерната конструкция, управлявана от EPO промотор (допълнителна фигура S4B).

Колокализация на Bmal1 и Epo в бъбреците на Cry-null срещу WT мишки

За по-нататъшно изясняване (i) циркадната регулация на производството на Epo в бъбреците чрез набиране на бъбречни Epo-продуциращи клетки и (ii) колокализацията на експресията на Bmal1 и Epo, ние извършихме RNAscope in situ хибридизация. Epo и Bmal1 са колокализирани, а микроскопията при ниско увеличение представлява разлики в набирането на REPCs (Фигура 5), както е количествено определено на Фигура 1в.

Хематологични находки при дефицит на Cry1/Cry2 За да се оценят (i) хемопоетичните ефекти от липсата на циркадианна Epo експресия и (ii) възможни други хематологични аномалии при мишки без функционален часовник, се анализира броя на кръвните клетки. Разликите по време на деня на експресията на Epo mRNA и концентрацията на S-Epo не се отразяват от значителни разлики в броя на периферните ретикулоцити при CT06 спрямо CT18 при WT мишки. Броят на ретикулоцитите обаче е значително по-нисък както при CT06, така и при CT18 при Cry-null животни в сравнение с WT мишки (Фигура 6а). Няма значителна разлика в броя на еритроцитите или стойностите на хематокрита при WT спрямо Cry-нулеви мишки. И двата параметъра обаче не варират между CT06 и CT18 и в двата щама (Фигура 6b и c) и не съответстват на по-ниския периферен брой ретикулоцити в Cry-null мишки (Фигура 6а). За да се тества дали хранителните дефицити (напр. желязо и фолиева киселина), дължащи се на нарушено сигнализиране на IGF1, участват в несъответствието между намаления брой ретикулоцити и нормалния брой на еритроцитите при Cry-null мишки, размерът и формата на червените кръвни клетки бяха анализирани, но не показаха значителни разлики между Cry-null и WT мишки (допълнителна фигура S5).

Трябва да се отбележи, че средният брой на тромбоцитите при Cry-null мишки има тенденция да бъде по-висок, отколкото при WT мишки, но броят на тромбоцитите не се различава значително между CT06 и CT18 и в двата щама (Фигура 6d). Обратно, броят на белите кръвни клетки (WBC) се различава значително между CT06 и CT18 при WT, но не и при Cry-null мишки. Средният брой на WBC при Cry-null мишки беше подобно висок, както при WT мишки при CT06 (Фигура 6е).

ДИСКУСИЯ

Тук ние демонстрираме, че циркадната Epo експресия се регулира на транскрипционно ниво. Анализът на концентрациите на Epo mRNA и S-Epo в аритмични мишки с дефицит на Cry1 и Cry2 пренасочи нашето търсене на "часовника на Epo" към техните низходящи целеви транскрипционни фактори CLOCK и BMAL1, които са потиснати от CRY1 и CRY2.26 Аблация на Cry1/Cry2 води до загубата на ритмично потискане на CLOCK/BMAL1, което води до постоянни нива на Epo транскрипт, които са били между средните нива при CT06 и CT18 при WT мишки (Фигура 1а). In situ хибридизация чрез RNAscope показва, че циркадните колебания се постигат чрез включване на експресията на Epo mRNA в интерстициални клетки (Фигура 1с), а in situ хибридизацията чрез RNAscope също разкри експресията на Bmal1 в REPCs (Фигура 5).

По-важното е, че значително по-високите нива на S-Epo при CT18 потвърждават, че циркадната, транскрипционна Epo регулация се превръща в циркадни колебания на циркулиращия Epo протеин при нормоксични условия (Фигура 1b). Реалният максимум на нивата на S-Epo се очаква малко по-късно от CT18, тъй като de novo синтезът на EPO протеин изисква w80 до 120 минути, 38 и циркадните времена са избрани на базата на максималните нива на Epo mRNA. 24 Открихме, че циркадната Epo регулация вероятно се медиира от транскрипционно активиране на E-box мотив в 5' EPO промотора от CLOCK/BMAL1 (Фигура 4 и допълнителна фигура S4), което е в съответствие с описаната положителна корелация между BMAL1 протеин и Нива на S-Epo в модел на плъх на остър кръвоизлив.²⁵

Има доказателства за двупосочна регулация между пътищата CLOCK/BMAL1 и HIF чрез директно взаимодействие протеин-протеин.^39,40Повишената регулация на HIF2a, основният активатор на ЕРО промотора, 41, 42 води до променени нива на експресия на часовникови гени в човешки хепатомни клетки. 43 Освен това, BMAL1 димеризира с HIF1a и HIF2a протеини,^44,45,и контролът на циркадния часовник на активността на HIF се регулират по тъканно-специфичен начин.39 При мишки, изложени на остра хипоксия (4 часа при 6 процента срещу 21 процента O2), EPO mRNA беше прекомерно повишена, но вече не показваше циркадни разлики .46 По този начин нормоксичните условия вероятно са най-подходящи за дисекция на молекулярния механизъм на циркадната Epo регулация. При гризачи обаче се съобщава за дневни промени в нивата на кислород в кръвта и тъканите.39,47 При плъхове има нисък диапазон на ритмични ежедневни промени в оксигенацията на бъбреците от zD3 процента, с пик на тъмно (¼ активност на гризачи) .47 Такива разлики не могат да бъдат открити в нашите експерименти, в които само анестезирани, трахеотомизирани и механично вентилирани мишки могат да бъдат изследвани поради регулаторни причини за животните. Въпреки това, анализът на артериалното рН, парциалното налягане на CO2 и парциалното налягане на O2, излишъкът на стандартна база или лактат, както и насищането с кислород не показват големи разлики между WT и Cry-null мишки при двете CTs (Фигура 2). Освен това, нивата на транскрипт на Hif2a в бъбрека също са сходни при всички условия (Фигура 3). По този начин, при нормоксични условия, циркадната Epo регулация изглежда независима от дневните промени в напрежението на кислорода. Въпреки това, въпросът до каква степен високата надморска височина или хипоксията (нисък pO2) влияе върху циркадните колебания на производството на Epo заслужава допълнително внимание. Човешките нива на S-Epo обикновено са по-високи на голяма надморска височина, докато фазата и амплитудата са непроменени, 17, 22 и при здрави доброволци, изложени на нормобарна хипоксия, концентрациите на S-Epo показват изразени колебания.⁴⁸

Circadian Epo регулацията вероятно е най-подходяща за клиничната нефрология и хематология, но също и по отношение на лабораторната диагностика, като кръвен тест за допинг с агенти, стимулиращи еритропоезата. За оценка на циркулиращите концентрации на Epo при допинг анализи трябва да се вземат предвид времето от деня (външно време) при вземането на кръвта и хронотипът на човека (вътрешно време).49,50

В еритропоезата образуващите спукване единици – еритроидните са първите клетки, специфични за линията, последвани от образуващите колонии единици – еритроидните, които показват обилна експресия на Epo рецептор. След 2 дни в култура с Epo, миши образуващи колонии единици – еритроиди произвеждат еритробластни колонии. След като стадият на ортохроматичните еритробласти бъде достигнат след 7 дни, клетките екструдират ядрата си, за да се превърнат в ретикулоцити, лишени от експресия на Epo рецептор.51 Като се има предвид времето, което е необходимо на единиците, образуващи колонии – еритроид, за да узреят до ретикулоцити или дори до напълно зрели еритроцити, вероятно не е изненадващо, че не са наблюдавани разлики между CT06 и CT18 при WT мишки (Фигура 6a-c). Трябва да се отбележи, че общият брой на ретикулоцитите е значително по-висок при WT, отколкото при Cry-null мишки (Фигура 6а), което предполага, че диференциацията в ретикулоцити е нарушена при Cry-null мишки. Предишни данни показват, че ранните еритроидни прогениторни клетки също показват циркаден модел на синтез на ДНК. In vivo прилагането на rhEpo подобрява циркадните ритми на броя на еритроидните колонии.52 По-ниските ретикулоцитни числа, въпреки относително високите общи концентрации на S-Epo в Cry-null мишките, могат да бъдат резултат от премахване на циркадния синтез на ДНК на ниво еритроидни предшественици. Такова съзвездие от висок S-Epo и намалена еритропоеза е наблюдавано при мишки с генетична аблация на производството на мелатонин в епифизата (C3H/HeN мишки, които нямат ограничаваща скоростта N-ацетил трансфераза),53 аргументирайки присъщите циркадни активности на еритроидната прогениторна клетка ниво.

Трябва да се отбележи, че Cry-null мишките показват приблизително 80% намаление на нивата на IGF1, което води до намалено IGF1 сигнализиране и 30% намаление на телесното тегло и размера на органа в сравнение с WT, ефект, който се влошава през целия живот.30 Въпреки че животни, използвани в нашите експериментите са сравнително млади (средна възраст,^21–29 седмици), те показаха умерен ефект върху общото телесно тегло и абсолютните бъбречни тегла при Cry-null мишки, но съотношението бъбречно към телесно тегло беше нормално (допълнителна фигура S3). Последният факт може да е от значение за капацитета на синтеза на Epo протеин (Фигура 1b).

Въпреки това, анализът на размера или формата на червените кръвни клетки (MCV, MCH и MCHC; допълнителна фигура S5) не предполага хранителни дефицити (напр. желязо и фолиева киселина) като обяснение за несъответствието между намаления брой на ретикулоцитите и нормалния брой на еритроцитите в Cry- нулеви мишки (Фигура 6а и b). По-специално, Epo и IGF1 сигнализирането синхронизира клетъчната пролиферация и диференциация по време на еритропоезата чрез взаимодействие с GATA-1/приятел на GATA-1 транскрипционния комплекс.54 В този процес Epo активира клетъчния AKT път и по този начин увеличава афинитета на GATA-1, основният транскрипционен регулатор на еритропоезата, към неговия кофактор приятел на GATA-1. Този механизъм обаче се инхибира, ако IGF1 сигнализирането бъде премахнато. 54 По този начин положителният ефект на относително по-висок Epo при Cry-нулеви мишки върху диференциацията на червените кръвни клетки може да надделее над намалената активност на IGF1 в относително младите Cry-нулеви мишки, изследвани тук.

Общото значение на пълната циркадианна аритмичност върху хемопоезата е допълнително изяснено от нашия анализ на броя на тромбоцитите и WBC. Предишни резултати от мишки, експресиращи доминантно-отрицателна форма на Clock (ClockD19/D19), показват, че нарушаването на експресията на тромбопоетин (първичния регулатор на мегакариопоезата) и неговия рецептор Mpl води до увеличен брой зрели мегакариоцити от костния мозък и броя на циркулиращите тромбоцити. 55 Описаното значително циркадно колебание на броя на тромбоцитите с пик при zeitgeber time (ZT) 20 при WT мишки, както и по-висок брой тромбоцити при ZT08 при ClockD19/D19 мишки, 55 което води до липса на циркадно колебание на броя на тромбоцитите, не може да бъде потвърдено в нашия модел на мишка (Фигура 6d). Друга важна констатация е загубата на разликите във времето на деня на циркулиращите бели кръвни клетки в Cry-null мишки за разлика от WT мишки (Фигура 6e), което е в съответствие с докладваната активност на CLOCK/BMAL1 върху производството на зрели бели кръвни клетки.^56,57

За тълкуването на нашите данни трябва да се вземат предвид разликите в дневните и нощните дейности при мишки и хора: Времето CT06 при хората приблизително съответства на полунощ (фаза на сън), докато CT18 приблизително съответства на обяд (фаза на активност). Обратното е вярно за нощните мишки, но и двата организма показват същия циркаден модел на експресия на Epo (нисък при CT/ZT06, висок при CT/ZT18). Това показва, че допълнителни механизми (напр. метаболитни фактори) могат да променят ритмите на експресията на Epo и в двата организма. Синхронизирането между пиковите нива на Epo и експресията на Epo рецептор в ранните еритроидни предшественици (единици, образуващи спукване – еритроидни и дори единици, образуващи колонии – еритроидни клетки)⁵² предполага, че пациентите, получаващи лечение с rhEpo (напр. при краен стадий на бъбречна анемия или хематологични нарушения), биха имали полза от имитирането на нормалната циркадна физиология чрез прилагане на хипо през нощта. Все още не са докладвани хематопоетични нарушения при хора с мутации на загуба на функции CRY1 (Онлайн Менделово наследяване при човека *601933) или CRY2 (Онлайн Менделово наследяване при човека *603732). Клиничните доклади свързват вариантите на CRY1 предимно с разстройства с дефицит на вниманието/хиперактивност, често придружени от безсъние, тревожност, депресия или разстройство във фазата на забавен сън.^58,59Това заслужава допълнително изследване, тъй като такива заболявания могат да се влошат от анемия или хемопоетични нарушения.

В заключение, това проучване предоставя първото доказателство, че циркадната експресия на Epo в нормоксичен бъбрек на възрастна мишка се регулира на транскрипционно ниво чрез CLOCK/BMAL1-медиирано активиране на E-box елемент в 5'EPO промотора. Тъй като ЕРО действа по различен начин в рамките на сложната регулаторна мрежа на еритропоезата, оптималното използване на репо при пациенти с бъбречна недостатъчност може да включва прилагането му точно преди неговия физиологичен циркаден максимум през нощта.