Запазеният богат на цистеин секреторен протеин MaCFEM85 взаимодейства с MsWAK16, за да активира защитата на растенията
Oct 26, 2023
Резюме: Metarhizium anisopliaeе ентомопатогенна гъба, която може да подобри растежа и устойчивостта на растенията, когато действа като ендофит в растенията гостоприемници. Въпреки това, малко се знае за протеиновите взаимодействия или техните активиращи механизми. Често срещани в гъбичните екстрацелуларни мембранни (CFEM) протеини са идентифицирани като растителни имунни регулатори, които потискат или активират реакциите на резистентност на растенията. Тук идентифицирахме протеин, съдържащ CFEM домен, MaCFEM85, който беше локализиран главно в плазмената мембрана. Дрождеви двухибридни (Y2H), глутатион-S-трансфераза (GST) падащи анализи и бимолекулни флуоресцентни комплементарни анализи показват, че MaCFEM85 взаимодейства с извънклетъчния домен наMedicago sativa(люцерна) мембранен протеин, MsWAK16. Анализите на генната експресия показват, че MaCFEM85 и MsWAK16 са значително повишени вM. anisopliaeиМ. сатива, съответно, от 12 до 60 часа след коинокулацията. Допълнителни двухибридни анализи на дрожди и специфична за мястото на аминокиселина мутация показват, че CFEM домейнът и 52-ият цистеин специално са необходими за взаимодействието на MaCFEM85 с MsWAK16. Анализите на защитната функция показват, че JA е регулиран нагоре, но размерът на лезията на Botrytis cinerea и възпроизвеждането на Myzus persicae са потиснати от преходна експресия на MaCFEM85 и MsWAK16 в моделното растение гостоприемник Nicotiana benthamiana. Взети заедно, тези резултати предоставят нови прозрения за молекулярните механизми, които са в основата на взаимодействията на M. anisopliae с растенията гостоприемници.
ползи от добавката Cistanche - повишава имунитета
Ключови думи: стено-асоциирана киназа; CFEMs; Metahizium anisopliae; растителен имунитет; Medicago sativa
1. Въведение
Взаимодействията между растенията и микробите са широко разпространени и са резултат от минала и продължаваща съвместна еволюция. Тези взаимодействия могат да имат или полезни, неутрални или неблагоприятни резултати за всеки участник [1–3]. Полезната ризосферна микробиота може да подобри растежа на растенията и да подобри цялостното здраве чрез защита срещу болести, пренасяни от почвата, или чрез подобряване на усвояването на хранителни вещества [4,5]. Широка гама от полезни микроби може да подобри способностите на растенията като усвояване на хранителни вещества, растеж и защита срещу патогени и насекоми [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın е важен род ентомопатогенни гъби със способността да колонизират растения [8], но също така има доказателства, които предполагат, че членовете на рода могат да повишат устойчивостта на растителни патогени. Например, лабораторно изследване установи 60% инхибиране на Fusarium solani (Mart.) Sacc. в присъствието на Metarhizium robertsii (известен преди като M. anisopliae) в сравнение с контролите без M. robertsii [9]. Някои щамове на Metarhizium имат потенциала да подобрят устойчивостта на растенията към насекоми вредители и болести чрез промяна на експресията на защитни гени на растенията. Ендофитната колонизация с M. Roberts активира експресията както на защитните пътища на жасмоновата киселина (JA), така и на салициловата киселина (SA) в листата на царевицата; освен това такава колонизация е свързана с насърчаване на растежа на растенията и потискане на развитието на ларвите на Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense активира -1,3-глюканазата и хитиназата в плодовата кора на Lansium parasiticum, което води до инхибиране на растежа на Botrytis sp. и Fusarium sp. върху плодовете на Aglaia dookkoo Griff [11]. Освен това, когато M. anisopliae се прилага върху разсад от фъстъци, се активират различни транскрипционни фактори, включително WRKYs, MYCs, TGAs и чувствителни към етилен транскрипционни фактори, докато нитратните транспортери и протеините, свързващи чувствителните към дехидратация елементи, също се експресират диференциално [12] . Това предполага, че M. anisopliae регулира гените за защита на растенията, докато колонизира растението. Въпреки това, сравнително малко се знае за механизмите, които са в основата на защитните реакции на растенията след инфекция с Metarhizium. Ефекторите са обичайно средство, чрез което микроорганизмите регулират устойчивостта на растенията [13]. Активирането на устойчивостта на растенията обикновено се характеризира с окислителен взрив и индуциране на хормони, метаболити и други сигнали [13]. Растителните хормони SA и JA играят важна роля в индуцирането на резистентност на растенията, като медиират два отделни защитни сигнални пътя [14]. Сигналната пътека на SA функционира основно в алергичния отговор на растенията и в системната придобита резистентност към патогени, но може също да бъде включена в индиректни защитни реакции на растенията, предизвикани от хранене с жилещи насекоми [15]. Натрупването на SA е свързано с повишена експресия на гени, кодиращи протеини за пренос на липиди (LTP) и фенилаланин амонячна лиаза (PAL) [16], които медиират синтеза и натрупването на специализирани метаболити надолу по веригата като флавоноиди и лигнин [17]. JA сигнализиращият път функционира при директни и индиректни отговори на механични повреди, гъбични патогени и насекоми вредители. Проучванията показват, че JA сигнализирането има регулаторен ефект върху синтеза на специализирани метаболити като терпеноиди, фенилпропаноиди и алкалоиди, които имат широк спектър от биологични функции [18]. Доказано е, че някои специализирани метаболити се натрупват в растителните клетки след третиране с methylJA (MeJA), включително паклитаксел във видовете Taxus [19,20], терпеноиди в Centella Asiatica (L.) Urban [21] и сапонини в женшен [22] . Прилагането на SA и хитозан (CHT) като елиситори индуцира натрупване на лигнин и защитни ензимни реакции в домати, което намалява честотата на инфекция с Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. В допълнение, нивата на JA и SA в пшеницата бяха значително натрупани чрез прилагане на елиситора PeaT, повишавайки защитния отговор на овесената листна въшка Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Това показва, че имунитетът на растенията може да се регулира от тези ефектори чрез растителни хормони и метаболити.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Често срещани в гъбичната екстрацелуларна мембрана (CFEM) протеини присъстват в широк спектър от гъбички. Те кодират домейни, които обикновено са с дължина 60 аминокиселини (aa) и съдържат осем характерно разположени цистеина [25]. CFEM домейните са подобни на домейните, подобни на епидермалния растежен фактор (EGF), които функционират като извънклетъчни рецептори, сигнални преобразуватели или адхезионни молекули при взаимодействия гостоприемник-патоген [26]. Протеините, съдържащи CFEM домени, могат да манипулират реакцията на резистентност на растенията, като действат като ефектори. В гъбата от ръжда по листата на пшеницата Puccinia triticina Erikas, CFEM ефекторният кандидат PTTG_08198 ускорява прогреса на клетъчната смърт и насърчава натрупването на реактивни кислородни видове (ROS) [27]. Гъбата антракноза Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils съдържа пет ефектора (CgCFEM6, 7, 8, 9 и 15), за които е доказано, че потискат BAX-индуцираната програмирана клетъчна смърт в Nicotiana benthamiana Domin [28]. Съобщава се, че фитосимбиотичната микоризна гъба Laccaria bicolor (Maire) PDOrton секретира няколко CFEM протеина, като Lac310796, Lac296573 и Lac296572, в симбиотични тъкани [29]. Въпреки че сложните функции на тези протеини не са изследвани допълнително в микоризната симбиоза, предишни резултати предполагат, че CFEM протеините могат да функционират при сигнализиране между гъбички и растения. M. anisopliae може да функционира като ентомопатогенна или ендофитна гъба в растение гостоприемник [30]. Въпреки това, ролите на CFEM протеините все още не са докладвани. По-рано идентифицирахме протеин, съдържащ CFEM домен в M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Тук докладваме за връзката между MaCFEM85 и киназата MsWAK16, свързана със стената на Medicago sativa. Ние анализирахме последователността MaCFEM85 и проведохме експерименти, за да определим кои остатъци са критични за взаимодействието с MsWAK16. И накрая, използвайки N. benthamiana като наш модел на растение, ние оценихме защитните реакции на растенията към Botrytis cinerea и листната въшка Myzus persicae със и без преходна експресия на MaCFEM85 и MsWAK16.
Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2. Резултати
2.1. MaCFEM85 е най-тясно свързан с непатогенни гъбични CFEM и е локализиран в плазмената мембрана
Изградено е филогенетично дърво за анализиране на връзките между MaCFEM85 и други CFEM протеини от патогенни и непатогенни моделни гъбички. Те включват Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl.), Neurospora crassa Shear & BODodge и Beauveria bassiana (Bals.) (вижте раздел 4). MaCFEM85 е най-тясно свързан с CFEM протеините в B. bassiana и следователно еволюционно по-близо до непатогенните, отколкото до патогенните гъби (Фигура 1а).
Фигура 1а
2.2. MaCFEM85 беше регулиран нагоре по време на взаимодействия с M. sativa
Свързани със стена рецептор-подобни кинази (WAKs) представляват подгрупа в суперсемейството на рецептор-подобни протеин кинази (RLKs) и включват извънклетъчен домен, трансмембранна спирала и вътреклетъчен киназен домен. Те играят важна роля в регулирането на растежа, развитието на растенията, реакцията на стрес и сигналните пътища за устойчивост на патогени [32]. РНК се екстрахира от хифи на M. anisopliae и корени на M. sativa след съвместна инкубация, за да се изследват моделите на експресия на MaCFEM85 и MsWAK16. Както MaCFEM85, така и MsWAK16 бяха експресирани при значително по-високи нива по време на съвместна инкубация от 12 до 6 0 h (Фигура 1c, d). От 0 до 36 часа, експресията на MaCFEM85 постепенно се увеличава, достигайки пик на 36 часа. Той е × 593 пъти по-силно изразен в комбинацията от M. anisopliae и M. sativa в сравнение с M. anisopliae, отгледан самостоятелно. Въпреки че експресията на MaCFEM85 е леко намалена в периода 48-60 h, тя все още се експресира на значително по-високи нива, отколкото в M. anisopliae, отглеждан самостоятелно. MsWAK16 също беше значително регулиран нагоре, с пик на експресията на 36 h. В M. sativa, заразен с M. anisopliae, MsWAK16 е × 89, 06 пъти по-силно експресиран, отколкото в M. sativa без M. anisopliae. От 36 до 60 часа нивата на MsWAK16 леко намаляват, но неговата експресия все още е значително по-висока, отколкото в неинокулираните растения.
2.3. MaCFEM85 взаимодейства с MsWAK16 In Vitro и In Vivo
За да се изследва потенциалният функционален механизъм на MaCFEM85 в отговор на лечение с M. anisopliae, беше извършен двухибриден (Y2H) скрининг на дрожди за предварително идентифициране на протеини на гостоприемник, които взаимодействат с MaCFEM85. Взаимодействието между извънклетъчния домен на MsWAK16 (MsWAK16-ED) и MaCFEM85 беше изследвано с двухибриден анализ с дрожди едно към едно, използвайки MaCFEM85 в pGBKT7 като BD вектор и MsWAK16 в pGADT7 като AD вектор. Всички трансформирани дрожди се развиват добре в среда с дефицит на SD-T/L, а положителната контролна група и експерименталната група се развиват успешно в среда с дефицит на SD-T/L/H/A + X- -gal. Това показва, че MaCFEM85 може да взаимодейства с MsWAK16-ED (Фигура 2а).
Фигура 2. Валидиране на взаимодействието между MaCFEM85 и MsWAK16.
За in vitro валидиране, глутатион-S-трансфераза (GST)-маркиран MsWAK16-ED (кодиращ продукт от 60 kDa) беше вмъкнат в pGEX6-P2 и полихистидин (His)-маркиран MaCFEM85 ( кодиращ продукт от 17 kDa) беше вмъкнат в pET-21b. Имуноблотинг с His и GST антитела показа, че рекомбинантният протеин MaCFEM85-His взаимодейства с плячката GST-MsWAK16-ED, но не само с GST и че GST-MsWAK16- ED взаимодейства с His -MaCFEM85 (Фигура 2b). За по-нататъшно потвърждаване на взаимодействието между MaCFEM85 и MsWAK16, ние проведохме анализ на бимолекулна флуоресцентна комплементация (BiFC) с MaCFEM85-YFPN и MsWAK16-YFPC конструкции. Ко-експресията на MaCFEM85-YFPN и MsWAK16-YFPC в тютюневи листа генерира жълт флуоресцентен сигнал, което показва, че MaCFEM85 взаимодейства с MsWAK16 (Фигура 2в).
2.4. Ключови сайтове за взаимодействия на MaCFEM85 и MsWAK16
За да се определи регионът на MaCFEM85, който е необходим за взаимодействие с MsWAK16-ED, протеиновите домейни бяха предсказани с онлайн софтуера SMART (Фигура 3а). MaCFEM85 съдържа CFEM домейн в 19-86 aa региона. Предсказана е и третичната структура (Фигура 3b). Осемте цистеина в този домейн доведоха до четири дисулфидни връзки (CYS26 и CYS69, CYS30 и CYS64, CYS43 и CYS50 и CYS52 и CYS85), поддържайки стабилността на протеина (Фигура 3b). За валидиране на предполагаемото(ите) място(а) на взаимодействие в MaCFEM85 бяха генерирани седем мутирали версии на протеина и вмъкнати в pGBKT7 като протеини на примамка. Всеки рекомбинантен вектор беше котрансфектиран с AD-MsWAK16-ED в щама Y2H Gold. Щамът с мутиран CYS52 не расте върху селективна среда (Фигура 3c, очертана в червено), което показва, че CYS52 е необходим за взаимодействието на MaCFEM85 с MsWAK16-ED.
2.5. Взаимодействието на MaCFEM85 с MsWAK16 активира имунния отговор на растенията
2.5.1. Оценяване на ролята на MaCFEM85 и MsWAK16 в резистентността към болести срещу B. cinerea
За да проучим възможното участие на MaCFEM85 и MsWAK16 в отговорите на защитата на патогените, ние проучихме дали свръхекспресията на MaCFEM85, MsWAK16 или MaCFEM85 и MsWAK16 може да доведе до повишена резистентност към B. cinerea. Ние временно експресирахме тези вектори в листата на N. benthamiana. Western blot анализ показа, че MaCFEM85 и MsWAK16 са експресирани на сравними нива, когато са били експресирани самостоятелно или заедно, което показва, че MaCFEM85 и MsWAK16 са били успешно експресирани в тютюн (Фигура 4а). Анализите на заболяването също бяха извършени с помощта на N. benthamiana, инфилтрирана с MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 или GFP контрола. Лезиите са значително по-малки (с ~30% на 2 дни след инокулацията) върху листа, инфилтрирани с MaCFEM85, MsWAK16 или MaCFEM85+MsWAK16 в сравнение с контролните растения (Фигура 4b). Тези данни показват, че преходната експресия на MaCFEM85 в N. benthamiana дава повишена резистентност към B. cinerea и че MaCFEM85 и MsWAK16 положително регулират защитния отговор срещу B. cinerea.
Фигура 3. Идентифициране на мястото на взаимодействие между MaCFEM5 и MsWAK16.
Фигура 4. Индуциране на резистентност на растенията чрез преходна експресия на MaCFEM85 и MsWAK16.
2.5.2. Оценяване на ролята на MaCFEM85 и MsWAK16 в защитата на листните въшки в N. benthamiana
За по-нататъшно изследване на ролята на MaCFEM85 и MsWAK16, растенията N. benthamiana, временно експресиращи MaCFEM85 и MsWAK16, бяха заразени с M. persicae и популациите бяха оценени. За този експеримент, голяма площ от всеки лист на N. benthamiana беше агроинфилтрирана с рекомбинантния бинарен вектор pYBA1132, съдържащ MaCFEM85 и MsWAK16. GFP беше използван като контрола. На 12-ия час след инфилтрацията, 20 възрастни M. persicae бяха поставени в клетки на всеки лист, излагайки инфилтрираната област на листни въшки. През следващите три дни бяха записани смъртността на възрастни листни въшки и броят на нимфите; след това нимфите бяха отстранени. Няма значителна разлика в риска от смъртност сред популациите на M. persicae, хранещи се с растения, експресиращи MaCFEM85, MsWAK16 или MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081 ) (Фигура 4в). Въпреки това, на 24, 48 и 72 h средният брой потомство, произведено от всяка възрастна листна въшка, е значително по-висок при N. benthamiana, експресиращ GFP контрола, в сравнение с тези, експресиращи MaCFEM85, MsWAK16 или MaCFEM85+MsWAK16 (Фигура 4d).
2.5.3. Оценяване на ролята на MaCFEM85 и MsWAK16 в натрупването на хормони и свързаната с хормоните генна експресия
За да анализираме разликите между защитните реакции на растения N. benthamiana, експресиращи eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 и MaCFEM85+MsWAK16, ние измерихме нивата на JA, SA и общите флавоноиди и експресията на свързани гени. Резултатите показват, че нивата на JA и SA се различават между растенията, експресиращи eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 и MaCFEM85+MsWAK16 (Фигура 5а). В сравнение с тези, експресиращи eGFP, нивата на JA са значително по-ниски в растенията, експресиращи MaCFEM85; Нивата на SA са леко повишени, но разликите не са значими. Обратно, растенията, експресиращи MsWAK16, не показват значителни разлики в нивата на JA в сравнение с eGFP контролата, докато нивата на SA са значително по-ниски, отколкото в контролата (Фигура 5а). Нивата на JA и SA бяха значително увеличени и съответно намалени в растения, експресиращи MaCFEM85+MsWAK16 в сравнение с eGFP.
Фигура 5. Хормонални нива и генна експресия на хормоналния отговор
Общото съдържание на флавоноиди е значително по-високо в растенията, експресиращи MaCFEM85+MsWAK16, в сравнение с всички други третирани групи (Фигура 5а). Нивата на биосинтетична генна експресия са подобни в растения, експресиращи MsWAK16 и MaCFEM85+MsWAK16. Например, гени, свързани с отговора на JA, а именно COI1, MYC2 и PDF1.2, бяха значително повишени в сравнение с растенията, експресиращи GFP (Фигура 5b). По подобен начин, свързаните със SA гени NPR1, WRKY70 и PR1 са значително различно експресирани в растения, експресиращи MsWAK16 и MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 беше регулиран нагоре, докато WRKY70 и PR1 бяха регулирани надолу в сравнение с контролата (Фигура 5b). Ние също така изследвахме експресията на ключови гени в пътищата на синтез на шикимова киселина и фенилпропаноид, които са свързани със синтеза на флавоноиди. Като цяло, експресията на MaCFEM85 самостоятелно не индуцира значително по-висока експресия на тези гени в тютюна. Въпреки това, тези гени бяха регулирани нагоре в тютюн, експресиращ MsWAK16 или MsWAK16+MaCFEM85 в сравнение с GFP контролата (Фигура 5в).
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
3. Дискусия
3.1. Запазеният CFEM протеинов мотив изпълнява множество функции в гъбични видове
CFEM домейнът е уникален за гъбичките и обикновено се среща в гъбични извънклетъчни мембранни протеини. Домейнът произхожда от най-новия общ прародител на Ascomycota и Basidiomycota [33]. Последните изследвания показват, че CFEM протеините в гъбичните патогени могат да действат като растителни имунни регулатори, причинявайки имунна супресия или активиране на растението гостоприемник в зависимост от вида на инфекцията [28,34,35]. Има няколко съобщения за протеини, съдържащи CFEM домейн в M. anisopliae, само в контекста на еволюционно сравнение с други гъби [36]. В това проучване ние сравнихме протеините на M. anisopliae CFEM с други известни CFEM протеини както в патогенни, така и в непатогенни гъбички. Ние потвърдихме, че най-близкият хомолог на MaCFEM85 е Cfem5, открит в Beauveria bassiana, един от 12 CFEM протеина в този вид (допълнителна фигура S1). BbCfem5 е от съществено значение за придобиването на желязо [37]. Освен това, въз основа на прогнозираната третична структура, CFEM домейнът в MaCFEM85 е много подобен на повърхностния антиген протеин 2 (CSA2), намерен в Candida albicans (CPRobin) Berkhout, в който 65 остатъка (96% от последователността) са моделирани с 99.8 % увереност [31]. Candida albicans е животински патоген; CSA2 играе важна роля в растежа и патогенността чрез извличане на хема от хемоглобина и транспортиране на хема от клетъчната стена към плазмата [38–40]. Ние предполагаме, че MaCFEM85 може да участва във вирулентността на M. anisopliae на гостоприемници от насекоми. Тези комбинирани функции на MaCFEM85 при животински патогенни инфекции и активиране на имунитета на растенията правят протеина вълнуващ бъдещ изследователски фокус.
3.2. Дисулфидните връзки са важни структури за функцията на протеина
Конформационната цялост на протеиновата структура е пряко свързана с нейната способност да функционира. Дисулфидните връзки, образувани от цистеинови двойки, насърчават нагъването на протеините и конформационната стабилност и се считат, че образуват ключови места за разпознаване и свързване на специфични рецептори или лиганди [41]. Например, разрушаването на която и да е от трите запазени дисулфидни връзки в ефекторния протеин AVR4 на растителния патоген Cladosporium fulvum води до чувствителност към протеаза и намалена способност за свързване с хитин [42]. В три други протеина на C. fulvum (ECP1, ECP2 и ECP5), единични замествания на аланини за цистеини потискат доматения свръхчувствителен отговор, което показва, че цистеините са критични за поддържане на стабилност и активност, предизвикваща свръхчувствителен отговор [43]. Освен това, в зрелия протеин MC69 на Magnaporthe oryzae, мутагенезата на два запазени цистеинови остатъка (Cys36 и Cys46) може да наруши функцията на MC69, без да повлиява секрецията, което предполага важността на дисулфидната връзка конкретно в патогенността на MC69 [44]. Домейнът CFEM изглежда подобен по размер и в модела на цистеиновите остатъци на EGF-подобните домени, които съдържат три или четири двойки дисулфидни връзки. EGF протеините могат да функционират като рецептори на клетъчната повърхност, сигнални преобразуватели или адхезионни молекули при взаимодействия гостоприемник-патоген [45]. В това проучване ние не само открихме, че CFEM домейнът на MaCFEM85 съдържа осем запазени цистеина, които образуват четири двойки дисулфидни връзки (Фигура 3b), но също така потвърдихме, че CFEM е критичният домейн за взаимодействието между MaCFEM85 и MsWAK16. Освен това, чрез сайт-насочена мутация на цистеинови остатъци до аланин, ние открихме, че цистеиновият остатък в позиция 52 е основното място, необходимо за взаимодействието (Фигура 3с). Тези резултати осигуряват основа за по-нататъшни изследвания на физиологичните функции на взаимодействието CFEM85-WAK16.
3.3. Взаимодействието на MaCFEM85 с MsWAK16 активирана растителна защита
При взаимодействията между микроби и растения, защитните реакции на растенията обикновено се активират от микробни ефекторни протеини. Индуцираната защита се превръща във важен инструмент в биологичния контрол на вредителите за насърчаване на резистентност. CFEM протеините са идентифицирани като ефектори, участващи в регулирането на растителното имунно активиране или инхибиране [28,46]. Въпреки това, има малко публикувани изследвания, свързващи регулирането на тези имунни фактори с тяхната специфична роля при болести по растенията и устойчивост на насекоми. В това изследване използвахме ентомопатогенна и ендофитна гъбичка, M. anisopliae, за да идентифицираме взаимодействие между MaCFEM85 и киназа, свързана с клетъчната стена, MsWAK16, в M. sativa. Резултатите показват, че това взаимодействие намалява съотношението на лезиите след инокулация с B. cinerea (Фигура 4b) и намалява скоростта на растеж на популацията на M. persicae (Фигура 4d), което показва, че взаимодействието между MaCFEM85 и MsWAK16 повишава устойчивостта на M. sativa към листни въшки. Промените в нивата на JA, SA и етилен (ET) могат да се използват като маркери за оценка на индукцията на резистентност на растенията [47,48]. Тук демонстрирахме, че MaCFEM85 взаимодейства с MsWAK16, за да повлияе на устойчивостта на растенията чрез хормонална регулация и да инхибира репродуктивната скорост на M. persicae (Фигура 4d). Подобни проучвания са докладвани и преди. Например ефекторният протеин PeBL1 на Brevibacillus laterosporus индуцира натрупването на JA и SA в доматите и намалява скоростта на растеж на популациите от второ и трето поколение на M. persicae, които се хранят с тези растения. Освен това доматените растения, напръскани с ефектори, имат репелентен ефект върху M. persicae [49]. Прилагането на елиситорния протеин PeBC1 върху обикновен фасул (Phaseolus vulgaris L.) води до изразени и значими сублетални ефекти върху зелената прасковена листна въшка. Растенията, третирани с PeBC1, показват значителна регулация на гени, свързани с JA и SA [50]. Елиситорът PeBb1 на Beauveria bassiana намалява плодовитостта на M. persicae върху тютюна и индуцира експресията на гени, свързани с JA и ET [51]. В настоящото проучване, преходната експресия на MaCFEM85 и MsWAK16 в тютюна значително повишава JA гените, свързани с реакцията COI1, MYC2 и PDF1.2 (Фигура 5b) и повишава JA и общото флавоноидно съдържание (Фигура 5a), което е сравнимо с резултатите в литературата, както е описано по-горе. Въпреки това, ние не открихме високи нива на SA в тютюна 12 часа след инфилтрацията и растенията, временно експресиращи MsWAK16 или MaCFEM85+MsWAK16, показаха значително намалени нива на SA и регулиране надолу на гени, участващи в отговора на SA (Фигура 5a,b) . Това демонстрира, че стимулирането на различни растителни хормони може да доведе не само до синергични дейности, но също и до кръстосани разговори и обратна връзка, което позволява на растенията да реагират по подходящ начин на различни стимули. По-рано са докладвани повишени нива на JA, но ниски нива на SA в растенията. Например, в A. thaliana, дефектна за натрупване на SA, нивата на JA са били 25-кратно по-високи, отколкото в дивия тип A. thaliana, и JA-реагиращите гени са били активирани [52]. Също така е съобщено, че някои бактерии могат да повишат нивата на JA в растенията, за да инхибират натрупването на SA, избягвайки вредата, причинена от SA. Например, Pseudomonas syringae се насочва към COI1 рецептора чрез токсин, коронатин, който регулира отрицателно пътя на JA [53]. Това насърчава MYC2-индуцираната регулация на транскрипционните фактори ANAC019, ANAC055 и ANAC072 [54], инхибирайки транскрипцията на ICS1 (ключов ген за синтеза на SA) и по този начин намалявайки производството на SA и сигналната трансдукция. В настоящото изследване взаимодействието между MaCFEM85 и MsWAK16 доведе до повишено натрупване на JA и регулиране на JA-реагиращи гени, но инхибиране на натрупване на SA и транскрипция на свързани с SA гени. Това показва, че взаимодействието между MaCFEM85 и MsWAK16 индуцира JA, като по този начин подобрява устойчивостта на растенията към листни въшки.
В N. benthamiana, временно експресираща MaCFEM85 и MsWAK16, нивата на JA бяха повишени и размерите на лезиите на B. cinerea бяха намалени (Фигура 4b), в съответствие с предишни проучвания. JA участва в устойчивостта на растенията към насекоми и некротрофни патогени [52,55]. Като некротрофен патоген, B. cinerea се инхибира от натрупването на JA и ET [56]. В A. thaliana ET-дефицитен мутант ein2-1 и JA-отговор мутант coi1-1, нивата на защитния ген надолу по веригата PDF1.2 бяха значително намалени и чувствителността към B.cinerea беше повишена [ 57]. Тук открихме, че натрупването на JA и транскрипцията на гени, свързани с JA, са значително увеличени в N. benthamiana, временно експресиращи MaCFEM85 и MsWAK16, докато натрупването на SA и транскрипцията на гени, свързани с SA, са инхибирани. Експресията на MaCFEM85 и MsWAK16 също показва инхибиторен ефект върху B. cinerea. Това показва, че JA се активира от MaCFEM85 и MsWAK16 и играе водеща роля в устойчивостта на растенията към B. cinerea.
4. Материали и методи
4.1. Гъбични щамове, растителни материали и методи на култивиране
Metarhizium anisopliae изолатни щамове Ma 9 се култивират върху среда от картофено-захарен агар (PSA) (200 g обелен картофен екстракт, сварен във вода, 20 g захароза и 15 g агар/L). Пресен прах от спорангий се събира след 10 d. Растенията от Nicotiana benthamiana се отглеждат в изкуствена климатична камера с 14/10 h цикъл светлина/тъмнина (27/25 ◦C). За преходна генна експресия чрез Agrobacterium-медиирана трансформация, Agrobacterium tumefaciens щам GV3101 се култивира в среда Luria Broth (LB) (10 g триптон, 5 g екстракт от дрожди и 10 g NaCl/L). Дрождев щам Gold (OE Biotech Co., Ltd., Шанхай, Китай) се култивира върху среда с пептон декстроза (YPDA) на екстракт от дрожди (10 g екстракт от дрожди, 20 g пептон, 20 g глюкоза и 0,03 g аденин хемисулфат/L). За всеки вектор и щам бяха използвани подходящи антибиотици, а именно рифампин, канамицин или ампицилин (съответно 25, 50 или 50 µg/mL). Щамовете и плазмидите, използвани в това изследване, са изброени в допълнителна таблица S1. Семената на Medicago sativa бяха повърхностно стерилизирани със 75% етанол за 1 минута, последвано от 50% NaClO (5, 5%) за 15 минути. Семената се смесват старателно и след това се измиват в стерилна вода три пъти за 5 минути всеки. Семената се инкубират при 4 ◦C на тъмно за повече от 24 часа, след което покълват върху 1% водни агарови плаки при стайна температура за една нощ. Три дни след покълването, развиващите се разсад се прехвърлят върху филтърна хартия върху 9- cm стерилни петриеви панички, с 20 разсада на паничка. Обработките и контролата бяха разпределени съответно на 15 блюда. След това разсадът се напоява с 10 mL суспензия от спори на M. anisopliae, съдържаща 107/mL, а контролата се напоява с 10 mL стерилна вода. На 0, 12, 24, 48 и 60 часа произволна селекция от разсад беше взета от три петриеви панички за всеки интервал от време. Пробите се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80 ◦C.
4.2. qRT-PCR и конструиране на плазмид
Общата РНК се екстрахира от M. anisopliae (хифи) и M. sativa (корени) с TRIzol реагент (Invitrogen, СА, САЩ), следвайки инструкциите на производителя. Качеството и изобилието на получената РНК бяха измерени с NanoPhotometer® (Implen, Мюнхен, Германия). Синтезът на cDNA на първа верига (до 2ug РНК) се извършва с помощта на 5 × All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Ванкувър, Британска Колумбия, Канада), следвайки инструкциите на производителя. qRT-PCR се извършва с помощта на 2×SYBR Green qPCR Master Mix от US EVER BRIGHT® INC. и системата ABI QuantStudio 5, следвайки инструкциите на производителя. Праймерите, използвани за всеки ген, са изброени в допълнителна таблица S2. Maury [58], Msactin [59] и Nbactin [60] бяха използвани като вътрешни референтни гени за нормализиране на данните за експресията. Реакцията се провежда при следните условия: 5 минути при 95 ◦C, последвани от 40 цикъла при 95 ◦C за 15 s и при 60 ◦C за 40 s. Имаше три технически повторения за всяка проба. Относителната експресия беше изчислена с помощта на метода 2−∆∆Ct [61]. Статистическата значимост беше определена с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) и многообхватен тест на Дънкан в SPSS v20.0 (SPSS).
4.3. Преходна експресия на протеини в N. benthamiana
MaCFEM85 кодираща последователност (CDS) беше амплифицирана с ултрапрецизна ДНК полимераза, използвайки сДНК като шаблон. За анализите за субклетъчна локализация, PCR продуктите, съдържащи CDS за MaCFEM85, бяха клонирани съответно в pYBA1132-eGFP (усвоен с EcoRI и SalI) и pcambia1300-череша (EcoRI и SacI). Всички конструкции бяха валидирани със секвениране (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Пекин, Китай). Праймерите, използвани в това изследване, са изброени в допълнителна таблица S2. За преходна експресия на MaCFEM85-eGFP и MaCFEM85-mCherry в N. benthamiana, A. tumefaciens щам GV3101 беше трансформиран с всеки плазмид и потвърден с PCR. Agrobacterium се култивира за една нощ при 28 ◦C с разклащане. Клетките бяха събрани чрез 5 min 5000 rpm центрофугиране при стайна температура, промити три пъти със стерилна двойно дестилирана вода и ресуспендирани в 10 mM MgCl2 буфер (съдържащ 10 mM MES и 10 mM ацетосирингон, рН 5.7). Клетъчната суспензия се коригира до OD600 от 0,5, след което се инфилтрира в долната страна на 4- до 5-седмични листа на N. benthamiana с 1-mL спринцовка. Всеки лист се инфилтрира с 50 uL A. tumefaciens; три листа бяха третирани на растение и три растения бяха във всяка третирана група. Третираните листа се събират след 30 часа и се визуализират с конфокален микроскоп Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Германия), за да се определи субклетъчната локализация.
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
4.4. Филогенетичен анализ
Филогенетично дърво беше конструирано с помощта на метода за свързване на съседи в MEGA X. 1000 реплики на начален етап използваха модела на P-дистанция. Аминокиселинните последователности, използвани за генериране на дървото, са получени с BLASTP търсения в базата данни на NCBI за свързани гъби (напр. Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasiodiplodia theobromae, Gliocladium roseum , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana и Paecilomyces lilacinus), използвайки MaCFEM85 като заявка.
4.5. Дрождеви двухибридни анализи
Двухибридната система Matchmaker Gold Yeast (Clontech Laboratories, Inc.; сега Takara Bio USA, Inc.) беше използвана за проверка на взаимодействието между MaCFEM85 и MsWAK16. MaCFEM85 без сигналния пептид беше въведен в pGBKT7 като примамка и извънклетъчният домен на MsWAK16 (MsWAK16-ED) беше вмъкнат в pGADT7 като плячка. Подготовка и трансформации на клетки, компетентни за дрожди, се извършват с помощта на Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, USA), следвайки инструкциите на производителя. Плазмидите на стръвта и плячката бяха ко-трансформирани в дрождения щам Gold. Взаимодействията протеин-протеин бяха анализирани въз основа на растеж върху SD двойна отпадаща среда (DDO, SD/-Trp-Leu) и SD четворна отпадаща среда (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade) плаки.
4.6. BiFC анализ
За генериране на BiFC конструкциите, векторите pUC-SPYNE и pUC-SPYCE бяха линеаризирани чрез смилане с BamHI. Всеки от CDSs с пълна дължина на MaCFEM85 и MsWAK16 беше клониран и вмъкнат в линеаризираните плазмиди, използвайки рекомбинантен ензим, за да се получат конструкциите MaCFEM85-YFPN и MsWAK16-YFPC. Плазмидите, съдържащи MaCFEM85 и MsWAK16, бяха ко-трансформирани с празни вектори като отрицателни контроли (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE и pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Всички вектори бяха въведени в N. benthamiana чрез Agrobacterium-медиирана трансформация, както е описано по-горе. Флуоресцентни сигнали се наблюдават в епидермални клетки на листа с помощта на конфокален микроскоп Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Германия). Праймерите, използвани за векторна конструкция, са изброени в допълнителна таблица S2.
4.7. Тест за изтегляне на GST
За GST падащите анализи, MsWAK16-ED беше вмъкнат във вектора pGEX-6P-2 и MaCFEM85 беше вмъкнат в pET-21b. Пречистените слети протеини (GST- MsWAK16- ED) и pGEX-6P-2 протеин без натоварване (GST) бяха използвани като протеин на примамка и пречистен pET-21 b-MaCFEM85 слят протеин (His-MaCFEM85) беше използван като плячка. Тестовете за падане на GST бяха извършени със системата за пречистване на протеин Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech, Шанхай, Китай), следвайки инструкциите на производителя. Накратко, Mag-Beads се промиват пет пъти с 1 × фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS, pH 7,4), за да се освободи алкохолният протектор и след това се добавят 10 mL GST или GST-MsWAK16-ED. Перлите се смесват чрез обръщане при стайна температура в продължение на 30 минути. След отстраняване на супернатанта, Mag-Beads се промиват пет пъти с 1 × PBS. His-MaCFEM85 беше добавен към Mag-Beads, вече свързан с GST, и сместа беше инкубирана за една нощ при 4 ◦C с въртене. След това зърната се промиват пет пъти с 1 × PBS за отстраняване на несвързани протеини. Впоследствие протеините, имобилизирани върху перлите, се разделят чрез SDS-PAGE, прехвърлят се в нитроцелулозна мембрана (100 V, 1 h) и се анализират чрез Western blot. Мембраните се промиват три пъти за 10 минути всеки с PBS + Tween (PBST). Мембраните се блокират за 2 часа при стайна температура с 5% обезмаслено мляко, след което се инкубират с ProteinFind анти-His мише моноклонално антитяло (TransGen Biotech, Пекин, Китай) (разредено 1:3000) или ProteinFind анти-GST мише моноклонално антитяло за 2 h при 4 ◦C. След това мембраните се потапят в ProteinFind козе анти-заешко IgG (H+L) (HRP) антитяло (TransGen Biotech, Пекин, Китай) (разредено 1: 5000) за 1 час при стайна температура. Мембраните се визуализират с EasySee® Western Blot Kit (TransGen Biotech, Пекин, Китай), следвайки инструкциите на производителя.
4.8. Идентифициране на ключовия сайт в MaCFEM85
За да се определи размерът, необходим за взаимодействието на MaCFEM85 с MsWAK16, беше извършена PCR амплификация за генериране на множество съкратени форми на MaCFEM85. CFEM домейнът (MaCFEM85-CFEM; aa остатъци 19–86) и C терминалът без CFEM домейн (MaCFEM85-C, aa остатъци 87–170) бяха вмъкнати във вектора pGBKT7 като протеин на стръв (допълнителна таблица S1). Други пет варианта бяха конструирани с помощта на полипептиден синтез за мутиране на цистеин до аланин на позиции 26, 30, 43, 52 и 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8543, ∆ CFEM8552 и ∆CFEM858 всички, съответно). Тези варианти бяха използвани за извършване на Y2H експерименти с MsWAK16-ED. Трансформираните дрождеви клетки бяха анализирани за растеж върху синтетични отпадащи SD/-Trp-Leu плочи и SD/-Trp-Leu-His-Ade плочи, съдържащи X- -галактозидаза (X- -Gal).
4.9. Тестове за устойчивост на растения
Myzus persicae бяха получени от Henan Quanying Biological Co., Ltd. Една седмица преди началото на биотестовете, 150 възрастни листни въшки бяха поставени върху три растения N. benthamiana (50 листни въшки на растение). След 72 часа всички възрастни бяха отстранени с мека четка на художника и нимфите бяха оставени да се хранят още четири дни, преди да бъдат прехвърлени в N. benthamiana за тестове за ефективност на листни въшки.
4.10. Тестове за ефективност на листни въшки
Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) се използва за оценка на ефективността на M. persicae, устойчивостта на болести по растенията срещу B. cinerea и експресията на свързани с хормони гени. Агробактерии, носещи pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 или pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16, се отглеждат в LB, допълнен с подходящи антибиотици за 36 часа при 28 ◦C. Клетките се промиват три пъти, след което се ресуспендират в буфер за инфилтрация (10 mM MgCl2, 10 mM MES и 100 цМ ацетосирингон, рН 5.6) до OD600 от 0.6. За коинфекция, бактериите, носещи MaCFEM85 и MsWAK16, се коригират до OD600 от 1,2 и след това се смесват в равни обеми. Напълно разширените листа бяха инфилтрирани с бактерии с помощта на 1-mL спринцовки без игла. Във всяко растение бяха инфилтрирани три листа и всяко третиране беше приложено към три растения за общо 12 растения на експеримент.
За анализите на ефективността на листните въшки, 20 възрастни листни въшки бяха приложени към инфилтрираната област на всеки лист 12 часа след прилагането на Agrobacterium. Листните въшки бяха ограничени с помощта на клетки с клипс с диаметър 5 mm. Всяко лечение се повтаря пет пъти. Смъртността на възрастни листни въшки и броят на новозасадените нимфи се записват ежедневно в продължение на три дни. B. cinerea се култивира в продължение на пет дни на PDAY. На 12-ия час след инфилтрацията на Agrobacterium, новокултивираният B. cinerea се пробива в 5- mm гъбена торта и повърхността на растеж на мицела се прикрепя към зоната на инфилтрация на повърхността на листата. За да се улесни развитието на заболяването, растенията се поддържат влажни, като се покриват с пластмасов филм в тави при 22 ◦C, за да се улесни прогресирането на заболяването. След 48 часа се оценява развитието на заболяването в инокулираните листа чрез измерване на размерите на лезиите. За количествено определяне на относителната експресия на съответните гени, трите инфилтрирани листа се събират от всяко растение 12 часа след инфилтрацията, след това се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80 градуса. Общата РНК екстракция, cDNA синтеза и qRT-PCR бяха проведени, както е описано в раздел 3.2. Нивата на салицилова киселина (SA), жасмонова киселина (JA) и флавоноиди са измерени в 15 инфилтрирани листа на N. benthamiana на третиране. Листата се събират, замразяват се в течен азот, след което се съхраняват при -80 градуса. Растителните хормони бяха количествено определени с помощта на комплектите ELISA за растителна салициклична киселина и растителна жасмонова киселина (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), а флавоноидите бяха количествено определени с помощта на комплекта за анализ на микрорастителни флавоноиди (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), следвайки инструкциите на производителя.
4.11. Статистически анализ
Данните бяха анализирани в SPSS v20.0. Значителни разлики в нивата на експресия на MaCFEM85 и MsWAK16 бяха определени с помощта на t-тест на Student. Значителни разлики в нивата на SA, JA и флавоноиди бяха определени с помощта на еднопосочна ANOVA и многообхватен тест на Duncan с праг p <0,05.
5. Изводи
В това проучване ние идентифицирахме и характеризирахме нов секретиран протеин, MaCFEM85, в M. anisopliae. Установено е, че е запазен ефектор, който може да взаимодейства с MsWAK16 и да активира защитния отговор на N. benthamiana. Ние показахме, че CFEM домейнът и цистеиновият остатък в позиция 52 в MaCFEM85 са критични за взаимодействието. Това взаимодействие може да активира свързаните с JA имунни отговори и устойчиви на болести и насекоми механизми в растението.
Препратки
1. Paulucci, NS; Анта, GG; Галарато, Луизиана; Викарио, JC; Чезари, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Буено, Масачузетс; Гарсия, MB; Dardanelli, MS Партньорства между растения и микроби: Последици за растежа и здравето на растенията. В растителна микробна симбиоза: основи и напредък; Springer: Берлин/Хайделберг, Германия, 2013 г.; стр. 105–117. [CrossRef]
2. Шенк, П.М.; Carvalhais, LC; Kazan, K. Разкриване на взаимодействията растение-микроб: Може ли многовидовата транскриптомика да помогне? Тенденции в биотехнологията. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]
3. Sasse, J.; Мартиноя, Е.; Нортен, Т. Нахранете приятелите си: растителните ексудати оформят ли микробиома на корените? Тенденции Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]
4. Лугтенберг, Б.; Камилова, Ф. Ризобактерии, стимулиращи растежа на растенията. Annu. Rev. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]
5. Шореш, М.; Harman, GE; Mastouri, F. Индуцирана системна резистентност и реакции на растенията към гъбични биоконтролни агенти. Annu. Фитопатол. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]
6. van de Mortel, JE; де Вос, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Дике, М.; Raaijmakers, JM Метаболитни и транскриптомни промени, предизвикани в Arabidopsis от rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101. Физиология на растенията. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]
7. Ларийн, А.; Бъртън, Ф.; Schafer, P. Комуникация корен-микроб на растение при оформяне на коренови микробиоми. Plant Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]
8. Сасан, РК; Bidochka, MJ. Насекомопатогенната гъба Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) също е ендофит, който стимулира развитието на корените на растенията. Am. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]
9. Сасан, РК; Bidochka, MJ Антагонизъм на ендофитната патогенна гъба Metarhizium robertsii срещу насекоми срещу патогена на бобовите растения Fusarium solanif. sp. фазеоли. Мога. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]
10. Ахмад, И.; Хименес-Гаско, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Ендофитният Metarhizium robertsii насърчава растежа на царевицата, потиска растежа на насекомите и променя генната експресия на защитните растения. Biol. Контрол 2020, 144, 104167. [CrossRef]
11. Чайрин, Т.; Petcharat, V. Индуциране на защитни реакции в хонконгски плодове (Aglaia dookkoo Griff.) срещу гъбички от плодово гниене от Metarhizium guizhouense. Biol. Контрол 2017, 111, 40–44. [CrossRef]
12. Хао, К.; Wang, F.; Нонг, X.; McNeill, MR; Лиу, С.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Отговор на корените на фъстъци Arachis hypogaea към присъствието на полезни и патогенни гъбички чрез анализ на транскриптоми. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]
13. Пател, ЗМ; Махапатра, Р.; Jampala, SSM Глава 11 - Роля на гъбичните елиситори в защитния механизъм на растенията. В Молекулярни аспекти на полезните за растенията микроби в селското стопанство; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., Eds.; Academic Press: Кеймбридж, Масачузетс, САЩ, 2020 г.; стр. 143–158. [CrossRef]
14. Донг, X.; Sa, JA Етилен и устойчивост на болести в растенията. Curr. мнение Plant Biol. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]
15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Фогелсанг, Р.; Cammue, BP; Broekaert, WF. Отделните пътища на защитна реакция, зависими от жасмонат и салицилат, в Arabidopsis са от съществено значение за резистентност към отделни микробни патогени. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]
16. Пант, SR; Иригойен, С.; Liu, J.; Бедре, Р.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Шолтхоф, К.-БГ; Mandadi, KK Brachypodium Фенилаланин амонячна лиаза (PAL) Насърчава антивирусната защита срещу мозаечния вирус Panicum и неговите сателити. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]
17. Лиу, Р.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Експресионен профил на PAL ген от Astragalus membranaceus var. Mongholicus и неговата решаваща роля в потока в биосинтеза на флавоноиди. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [CrossRef]
18. Де Гейтер, Н.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Транскрипционни машини във вторичния метаболизъм на растенията, предизвикан от жасмонат. Тенденции Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]
19. Мирджалили, Н.; Linden, JC Ефекти на състава на газовата фаза върху суспензионните култури на Taxus cuspidata. Биотехнология. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]
20. Li, ST; Джан, П.; Джан, М.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Гуо, AY; Yu, LJ Транскрипционен профил на клетки на taxus chinensis в отговор на метил жасмонат. BMC геном. 2012, 13, 295. [CrossRef]
21. Тугизимана, Ф.; Ncube, EN; Steenkamp, PA; Dubery, IA Получени от Metabolomics прозрения за манипулирането на терпеноидния синтез в клетките на Centella asiatica от метил жасмонат. Растителна биотехнология. Rep. 2015, 9, 125–136. [CrossRef]
22. Лу, М.; Wong, H.; Teng, W. Ефекти от предизвикване върху производството на сапонин в клетъчна култура на Panax ginseng. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674–677. [CrossRef]
23. Мандал, С.; Кар, И.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Elicitor-индуцирани защитни реакции в Solanum lycopersicum срещу Ralstonia solanacearum. Sci. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]
24. Ли, Л.; Уанг, С.; Янг, X.; Франсис, Ф.; Qiu, D. Protein elicitor PeaT1 повишена устойчивост срещу листни въшки (Sitobion avenae) в пшеница. Борба с вредителите Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]
25. Bujalowski, W. Разширяване на физиологичната роля на хексамерната DnaB хеликаза. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]
26. Вакнин, Й.; Shadkchan, Y.; Левдански, Е.; Морозов, М.; Романо, Дж.; Osherov, N. Трите Aspergillus fumigatus CFEM-домейн GPI-закотвени протеини (CfmA-C) влияят на стабилността на клетъчната стена, но не играят роля в гъбичната вирулентност. Гъбични. Женет. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]
27. Джао, С.; Shang, X.; Bi, W.; Ю, X.; Лиу, Д.; Канг, З.; Уанг, X.; Wang, X. Геномна идентификация на ефекторни кандидати със запазени мотиви от гъбата ръжда по житните листа Puccinia triticina. Преден. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]
28. Гонг, А.; Jing, Z.; Джан, К.; Тан, Q.; Wang, G.; Liu, W. Биоинформационен анализ и функционална характеристика на CFEM протеините в царевичната антракнозна гъба Colletotrichum graminicola. J. Integr. Agric. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]
29. Мартин, Ф.; Aerts, A.; Ahren, D.; Брун, А.; Данчин, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Переда, В.; et al. Геномът на Laccaria bicolor дава представа за микоризната симбиоза. Nature 2008, 452, 88–92. [CrossRef]
30. Стефан, В.; Lara, RJ Ентомопатогенни гъби като ендофити: взаимодействия растения-ендофит-тревопасни животни и перспективи за използване в биологичния контрол. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.
31. Cai, N.; Лиу, Р.; Ян, Д.; Джан, Н.; Жу, К.; Джан, Д.; Нонг, X.; Ту, X.; Джан, З.; Wang, G. Биоинформатичен анализ и функционална характеристика на CFEM протеините на Metarhizium anisopliae. J. Гъбички. 2022, 8, 661. [CrossRef]
32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; и Kanyuka, K. WAKsing растителен имунитет, намаляващи болести. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]
33. Джан, ZN; Wu, QY; Джан, GZ; Жу, YY; Мърфи, RW; Лиу, З.; Zou, CG Систематичните анализи разкриват уникалността и произхода на CFEM домейна в гъбите. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]
34. Фанг, А.; Гао, Х.; Джан, Н.; Джън, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Джоу, С.; Cui, F.; Sun, W. Нов ефекторен ген SCRE2 допринася за пълната вирулентност на Ustilaginoidea virens към ориза. Преден. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]
35. Жу, В.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Джан, С.; Чен, П.; Xu, X. BcCFEM1, протеин, съдържащ CFEM домейн с предполагаем GPI-закотвен сайт, участва в патогенността, производството на конидии и устойчивостта на стрес в Botrytis cinerea. Преден. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]
36. Сю, X.; Li, G.; Li, L.; Су, З.; Chen, C. Геномен сравнителен анализ на предполагаеми Pth11-свързани G протеин-свързани рецептори в гъбички, принадлежащи към Pezizomycotina. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]
37. Peng, YJ; Hou, J.; Джан, Х.; Lei, JH; Лин, HY; Динг, JL; Feng, MG; Ying, SH Систематичният принос на протеини, съдържащи домейн CFEM, за придобиването на желязо е от съществено значение за междувидовото взаимодействие на нишковидната патогенна гъба Beauveria bassiana. Environ. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]
38. Рой, Ю.; Kornitzer, D. Придобиване на хем-желязо в гъбички. Curr. мнение Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]
39. Окамото-Шибаяма, К.; Kikuchi, Y.; Кокубу, Е.; Сато, Й.; Ishihara, K. Csa2, член на семейството на протеини Rbt5, участва в използването на желязо от човешки хемоглобин по време на растежа на хифите на Candida albicans. FEMS Yeast Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]
40. Перес, А.; Педрос, Б.; Murgui, A.; Казанова, М.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Образуване на биофилм от мутанти на Candida albicans за гени, кодиращи гъбични протеини, показващи осем-цистеин-съдържащ CFEM домейн. FEMS Yeast Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]
41. Hogg, PJ Дисулфидни връзки като превключватели за протеинова функция. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]
42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Рот, Р.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Мутанти с нарушена естествена дисулфидна връзка на AVR4 на доматения патоген Cladosporium fulvum са чувствителни към протеолиза, заобикалят Cf-4-медиирана резистентност, но запазват своята способност за свързване с хитин. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Джан, Дж.; Xia, F.; Ke, Y.; Джан, Х.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; et al. Подобряване на множество агрономични характеристики чрез ген за устойчивост на болести чрез укрепване на клетъчната стена. Нац. Растения 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]
44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ито, А.; Хирабучи, А.; Икеда, К.; Irieda, H.; Йошино, К.; Йошида, К.; Matsumura, H.; et al. Мащабно разрушаване на ген в Magnaporthe oryzae идентифицира MC69, секретиран протеин, необходим за инфекция от едносемеделни и двусемеделни гъбични патогени. PLoS Pathog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]
45. Кулкарни, РД; Kelkar, HS; Dean, R. CFEM домейн, съдържащ осем цистеина, уникален за група гъбични мембранни протеини. Trends Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]
46. Peng, J.; Wu, L.; Джан, В.; Джан, К.; Xing, Q.; Уанг, X.; Ли, X.; Yan, J. Системна идентификация и функционална характеристика на често срещаните в гъбичните извънклетъчни мембранни протеини в Lasiodiplodia theobromae. Преден. Plant Sci. 2021, 12, 804696. [CrossRef]
47. Бари, Р.; Jones, JD Роля на растителните хормони в защитните реакции на растенията. Plant Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]
48. Верма, В.; Равиндран, П.; Kumar, PP Медиирана от растителни хормони регулация на реакциите на стрес. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]
49. Джавед, К.; Qiu, D. Протеинов елиситор PeBL1 на Brevibacillus laterosporus повишава устойчивостта срещу Myzus persicae в домати. Патогени 2020, 9, 57. [CrossRef]
50. Базит, А.; Ханан, А.; Назир, Т.; Majeed, MZ; Qiu, D. Молекулярна и функционална характеристика на елиситор PeBC1, извлечен от Botrytis cinerea, участващ в индуцирането на резистентност срещу зелена прасковена листна въшка (Myzus persicae) в обикновен боб (Phaseolus vulgaris L.). Насекоми 2019, 10, 35. [CrossRef]
51. Назир, Т.; Ханан, А.; Базит, А.; Majeed, MZ; Ануар, Т.; Наваз, И.; Qiu, D. Предполагаема роля на все още нехарактеризиран протеинов елиситор PeBb1, получен от щам Beauveria bassiana ARSEF 2860 срещу Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) в Brassica rapa ssp. pekinensis. Патогени 2020, 9, 111. [CrossRef]
52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Ван Пелт, JA; Мюлер, MJ; Бучала, AJ; Metraux, JP; Браун, Р.; Казан, К.; et al. NPR1 модулира кръстосаните разговори между салицилат- и жасмонат-зависимите защитни пътища чрез нова функция в цитозола. Растителна клетка 2003, 15, 760–770. [CrossRef]
53. Xin, XF; He, SY Pseudomonas syringae pv. домат DC3000: модел на патоген за изследване на чувствителността към болести и хормонално сигнализиране в растенията. Annu. Фитопатол. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]
54. Джан, X.; Wang, C.; Джан, Й.; Sun, Y.; Mou, Z. Субединицата на медиаторния комплекс Arabidopsis16 регулира положително медиираната от салицилат системна придобита резистентност и индуцирани от жасмонат/етилен защитни пътища. Растителна клетка 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]
55. Доарес, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Конкони, А.; Ryan, CA Салициловата киселина инхибира синтеза на протеиназни инхибитори в доматени листа, индуцирани от системин и жасмонова киселина. Физиология на растенията. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]
56. Pieterse, CM; Леон-Рейес, А.; Ван дер Ент, С.; Van Wees, SC Мрежа от хормони с малки молекули в растителния имунитет. Нац. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]
57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Бучала, А.; Métraux, JP; Broekaert, WF Съпътстващото активиране на пътищата на отговор на жасмонат и етилен е необходимо за индукция на ген на растителен дефензин в Arabidopsis. Растителна клетка 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]
58. Fang, W.; Bidochka, MJ Експресия на гени, участващи в покълването, конидиогенезата и патогенезата в Metarhizium anisopliae с помощта на количествена RT-PCR в реално време. Mycol. Рез. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]
59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Люцернова целулозна синтазна генна експресия при абиотичен стрес: Ръководство на стопаджия за нормализиране на RT-qPCR. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]
60. Янг, Й.; Джан, Й.; Li, B.; Янг, X.; Dong, Y.; Qiu, D. Verticillium dahliae pectate lyase индуцира имунните реакции на растенията и допринася за вирулентността. Преден. Plant Sci. 2018, 9, 1271. [CrossRef]
61. Ливак, KJ; Schmittgen, TD Анализ на данните за относителната генна експресия с помощта на количествена PCR в реално време и 2(-Delta Delta C(T)) метод. Методи 2001, 25, 402–408. [CrossRef]
