Текущото състояние на неврозащитата при вродени сърдечни заболявания, част 3

3.2. Полуколичествена оценка на ектопична митохондриална ДНК

Изображения на оцветяване с Hsp60 (митохондриалната матрица) и оцветяване с хистон-H2B (ядрен маркер) бяха извадени от изображения на оцветяване с dsDNA. След това, използвайки функцията "AdjustThreshold" на софтуера lmage] (Национални здравни институти), изображенията бяха бинаризирани.

Митохондриите са енергийните фабрики в клетките, отговорни за синтеза на АТФ, за да осигурят енергията, необходима на клетките. Митохондриалната матрица е вътрешната течност на митохондриите, която съдържа различни ензими и йони и е ключово място за различни биохимични реакции на митохондриите. Паметта е една от най-важните когнитивни способности на хората. Въпреки че двете може да изглеждат несвързани, те са тясно свързани.

Изследванията показват взаимодействие между митохондриалната матрица и паметта. Ензимите и йоните в митохондриалната матрица могат директно да повлияят на възбудимостта на невроните чрез регулиране на енергийния метаболизъм и състоянието на йонните канали в невронните клетки, като по този начин повлияват паметта. В допълнение, има различни сигнални молекули в митохондриалната матрица, които могат да бъдат предадени на невроните надолу по веригата през аксоните и синапсите на невроните, засягайки ефективността на сигналната трансдукция на невроните, като по този начин засягат формирането и консолидирането на паметта.

В същото време активността на паметта също влияе пряко върху състоянието на митохондриалната матрица. Дейностите на паметта ще увеличат консумацията на енергия от невроните и ще насърчат окислително-редукционната реакция в митохондриалната матрица, като по този начин ще повлияят на метаболитното ниво на митохондриите и вътреклетъчния йонен баланс, като допълнително ще повлияят на възбудимостта и ефективността на сигналната трансдукция на невроните.

Следователно поддържането на добро здраве на митохондриите е от решаващо значение за поддържането на добра функция на паметта. Като поддържате добри жизнени навици, като редовна диета, умерени упражнения, достатъчен сън и т.н., можете да помогнете за поддържането на здравето на митохондриалната матрица. В допълнение, функцията на паметта може също да бъде подобрена чрез подходяща фармацевтична интервенция за насърчаване на биохимични реакции и сигнализиране в митохондриалната матрица.

В ежедневието можем да упражняваме паметта по много начини, като четене, учене, мислене, игри и т.н. В същото време трябва да обърнем внимание и на поддържането на добро здраве, за да поддържаме по-добре здравето на митохондриалната матрица. Вярвам, че чрез тези усилия със сигурност ще имаме по-добра памет и ще се справяме по-добре с различни предизвикателства в живота и работата. Вижда се, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори. Тези вещества са много важни за паметта и ученето. В допълнение, Cistanche deserticola може също да подобри притока на кръв и да насърчи доставянето на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно хранителни вещества и енергия, като по този начин подобрява мозъчната жизненост и издръжливост.

Щракнете върху познайте добавките за увеличаване на паметта

Избрахме dsDNA puncta с размери от 2 до 20 um' (кръгове 0.1-1.0) с помощта на функцията „Анализиране-Анализиране на частици“. ако е необходимо, оригиналните изображения бяха изследвани за окончателно преброяване. Ако сигналът на хистон H2B беше малък. след това извадените изображения показаха подобни на понички структури.

Те представляват цитозолна dsDNA с ядрен произход и трябва да бъдат елиминирани от количеството цитозолна dsDNA с митохондриален произход. Диапазонът на размера може да бъде модифициран според типа клетка или произхода на хистологичните проби. Фигура lE показва пример за преброяване на ектопична митохондриална ДНК

точки с помощта на 1B D.

Алтернативно, изображения на оцветяване с Hsp60 бяха извадени от изображения на оцветяване с dsDNA. След това броят на dsDNA puncta беше преброен с помощта на функциите "Adjust-Threshold "Analyze-Analyze Particles". Впоследствие, dsDNA puncta без хистон-H2B сигнала бяха преброени чрез директно наблюдение. Последният метод е подходящ, когато изображенията на хистон-H2B показват ниско съотношение сигнал/шум.

Като цяло този метод може ясно да покаже ектопична митохондриална ДНК, изтичаща в цитоплазмата, и позволява обективна и статистическа оценка на такава ектопична митохондриална ДНК в клетките.

4. Дискусия

В нашето изследване разработихме метод, който позволява преброяването на цитоплазмената митохондриална ДНК. Съобщава се за откриване на цитоплазмена митохондриална ДНК чрез използване на имунофлуоресцентни техники, но методите не са количествени за оценка на цитоплазмената митохондриална ДНК в повечето случаи [15,25]. В друго проучване е проведена капкова PCR за количествено определяне на циркулираща митохондриална ДНК [9].

наскоро Sato et al. [26,27] публикува отличен протокол за оценка на цитоплазмената ДНК чрез имунофлуоресцентна микроскопия, използвайки антитела Lamin B1 (LMNB1) като маркер за ядрена структура и субединица 4 на цитохром с оксидаза (COX4) като маркер за митохондриална структура. Този протокол изглежда много полезен за количествено определяне на цитоплазмена dsDNA от ядрен произход.

Въпреки това, когато опитахме COX4 или други маркери на митохондриалната мембрана, включително както вътрешни, така и външни маркери, беше много трудно да се разграничи точно цитоплазмата от митохондриите.

Например, ако наблюдаваме кръгови сигнали с помощта на маркер на митохондриална мембрана и наблюдаваме dsDNA сигнали вътре, тогава тази dsDNA може да представлява или митохондриална ДНК вътре в кръговите митохондрии (нормално), или цитоплазмена митохондриална ДНК извън подобните на поничка митохондрии (ектопична). По този начин използвахме Hsp60 като маркер, маркиращ тяхната митохондриална матрица, за да оценим ектопичната митохондриална ДНК в цитоплазмата.

Както е описано в скорошен преглед [23], има много различни типове цитоплазмена ДНК с ядрен произход и повечето от тях са положителни за хистонови маркери. Поради ограничението на комбинацията от антитела, използвани за тройно оцветяване, ние използвахме хистон H2Bas хистонов маркер.

Въпреки това, ако това ограничение бъде разрешено, H2AX може да бъде по-добър маркер за цитоплазмена dsDNA от ядрен произход. Хистон-H2B-отрицателна цитоплазмена dsDNA рядко се наблюдава в контролните HeLa клетки, използвани в това изследване, но такава dsDNA от ядрен произход може да присъства, ако се използват други клетъчни линии или условия.

Хибридизацията in situ на митохондриална ДНК, използвана в нашата скорошна статия, е подходяща за качествена оценка, но може да е трудно да се използва хибридизация in situ за количествена оценка [8].

In situ хибридизацията излага образеца на високи температури, което може да доведе до деформация или шум на някои части от образеца. От друга страна, имуноцитохимичният метод, представен в тази статия, може да получи сигнали с нисък фонов шум. В нашата неотдавнашна статия, в човешки клетки и риба зебра, използвани като модели на болестта на Паркинсон, ние показахме, че митохондриалната ДНК е изтекла в цитоплазмата, която е токсична за клетки. Ние също така наблюдавахме, че количеството на цитозолната митохондриална ДНК е увеличено в мозъчните тъкани след смъртта на пациенти с болестта на Паркинсон [8].

Тези линии на доказателства предполагат, че увеличеното количество ектопична митохондриална ДНК, изтекла от митохондриите, може да предизвика остро и хронично възпаление, водещо до различни заболявания, включително болестта на Паркинсон и сърдечна недостатъчност; по този начин, регулирането на цитозолно-ДНК разграждането или инхибирането на неговите сензори може да бъде потенциална терапевтична цел за тези заболявания [8,28].

Методът, въведен в тази статия за количествена оценка на ектопична митохондриална ДНК, служи като важен инструмент за по-нататъшни изследвания в тази област.

Авторски принос: HM и MTH формулираха хипотезите, проектираха по-голямата част от експериментите, извършиха експериментите, анализираха данните и написаха ръкописа. NM извърши експериментите, свързани с култивирани клетки. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от AMED (номера на безвъзмездни средства JP21gm6110028 и JP19dm0107154 (HM)), научната фондация Takeda (HM), JSPS KAKENHI (номера на безвъзмездни средства JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) и JP 17925674 (HM) ), JST (Moonshot R&D; номер на грант JPMJMS2024 (HM)) и безвъзмездни средства от TBRF (номер на грант TBRF-RF 21-135 (HM)).

Изявление за наличност на данни: Данните и инструментите, описани в този ръкопис, са достъпни при поискване.

Благодарности: Изказваме благодарност на Шинано Кобаяши за участието в полезни дискусии и предоставянето на постоянна подкрепа. Благодарим на Токийската биохимична изследователска фондация (TBRF) за предоставянето на постдокторантска стипендия на TBRF за чуждестранни изследователи в MH (TBRF-RF 21-135).

Конфликти на интереси: Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Препратки

1. Ли, XD; Wu, J.; Гао, Д.; Wang, H.; Сън, Л.; Chen, ZJ Основни роли на cGAS-cGAMP сигнализиране в антивирусна защита и имуноадювантни ефекти. Наука 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. Ансари, Масачузетс; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Икбал, Дж.; Кумар, Б.; Рой, А.; Чикоти, Л.; Сингх, VV; Chandran, B. Индуцираното от разпознаването на генома на херпес вирус ацетилиране на ядрен IFI16 е от съществено значение за неговата цитоплазмена транслокация, инфламазома и IFN- отговори. PLoS Pathog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Орзали, MH; Broekema, NM; Diner, BA; Ханкс, окръг Колумбия; Елде, Северна Каролина; Кристеа, IM; Knipe, DM cGAS-медиирана стабилизация на IFI16 насърчава вроденото сигнализиране по време на инфекция с вируса на херпес симплекс. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 2015, 112, E1773–E1781 [CrossRef] [PubMed]

4. Удуърд, Джей Джей; Iavarone, AT; Portnoy, DA c-di-AMP, секретиран от вътреклетъчната Listeria monocytogenes, активира интерферонов отговор от тип гостоприемник. Наука 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Ду, З.; Гош, К.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Сен, П.; Wangensteen, KJ; Simithy, J.; Lan, Y.; Лин, Й.; Джоу, З.; и др. Цитоплазменият хроматин предизвиква възпаление при стареене и рак. Nature 2017, 550, 402–406. [CrossRef]

6. Такахаши, А.; Лу, Т.; Окада, Р.; Камачи, Ф.; Watanabe, Y.; Уакита, М.; Watanabe, S.; Кавамото, С.; Мията, К.; Бръснар, GN; et al. Понижаването на цитоплазмените ДНКази е замесено в натрупването на цитоплазмена ДНК и SASP в стареещите клетки. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. МакАртър, К.; Уайтхед, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Падман, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.; Chin, HS; и др. BAK/BAX макропорите улесняват митохондриалната херния и ефлукса на mtDNA по време на апоптоза. Наука 2018,359, eaao6047. [CrossRef]

8. Мацуи, Х.; Ito, J.; Мацуи, Н.; Уечи, Т.; Онодера, О.; Kakita, A. Цитозолна dsDNA от митохондриален произход индуцира цитотоксичност и невродегенерация в клетъчни модели и модели на зебра на болестта на Паркинсон. Нац. Общ. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Слайтър, DA; Martinez, J.; Хао, Л.; Чен, X.; Сън, Н.; Тара, Д.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Джан, З.; и др. Parkin и PINK1 смекчават възпалението, предизвикано от STING. Nature 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Янг, Б.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Матсън, MP; Croteau, DL; Bohr, VA NAD(+) добавка намалява невровъзпалението и клетъчното стареене в трансгенен миши модел на болестта на Алцхаймер чрез cGAS-STING. Proc. Natl.Acad. Sci. САЩ 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com