Текущото състояние на неврозащитата при вродени сърдечни заболявания, част 2

След това микроскопичните изображения бяха подложени на изчисление на изображението с помощта на софтуер ImageJ (Национални институти по здравеопазване, Бетезда, MD, САЩ). Сигналът на Hsp60 беше умножен по "x".

Hsp60 е важна протеинова молекула, която играе важна биологична роля в човешкото тяло. Изследвания през последните години показват, че наличието на Hsp60 е тясно свързано с човешката памет.

Hsp60 е молекулярен протеин-шаперон, който участва главно в сгъването, разгъването, стабилизирането и разграждането на протеина. Тези процеси са много важни за нормалния метаболизъм и клетъчната функция на човешкото тяло. В същото време Hsp60 има и антиоксидантни, противовъзпалителни и имуномодулиращи ефекти и играе голяма роля за поддържане на човешкото здраве и баланса на имунната система.

Изследванията са установили, че Hsp60 играе решаваща роля при формирането и поддържането на паметта. По време на процеса на учене и памет мозъчните клетки произвеждат голям брой молекули Hsp60. Тези молекули могат да предпазят клетките от намеса и увреждане от външната среда, за да осигурят плавния напредък на ученето и паметта. В допълнение, Hsp60 може също да повлияе на човешкото мислене и поведение чрез промяна на сигналната трансдукция на мозъчните клетки и развитието на невроните и има положително въздействие върху когнитивните способности и устойчивостта на стрес.

Въпреки че ролята на Hsp60 е показала положителни ефекти върху човешкото тяло, хората също трябва да осъзнаят, че както излишъкът, така и дефицитът на Hsp60 може да има отрицателни ефекти върху човешкото здраве. Следователно трябва активно да изследваме и изучаваме механизма на Hsp60 при различни физиологични и патологични състояния на човешкото тяло, за да разберем по-добре позицията и ролята на Hsp60 в човешкото здраве. Може да се види, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola има антиоксидантни, противовъзпалителни и анти-стареене ефекти, които могат да помогнат за намаляване на окисляването и възпалителните реакции в мозъка, като по този начин предпазват здраве на нервната система. В допълнение, Cistanche deserticola може също така да стимулира растежа и възстановяването на нервните клетки, като по този начин подобрява свързаността и функцията на невронните мрежи. Тези ефекти могат да помогнат за подобряване на паметта, способността за учене и скоростта на мислене и могат също така да предотвратят развитието на когнитивна дисфункция и невродегенеративни заболявания.

Кликнете върху Know, за да подобрите краткосрочната памет

Стойността "x" се определя, както следва: изваждането на "x"-сгънатия Hsp60 сигнал от митохондриалния ДНК сигнал в контролната група прави стойността на митохондриалната ДНК по-малка или равна на нула. Сигналът на хистон H2B се умножава по "y".

Стойността "y" се определя, както следва: изваждането на "y"-сгънатия хистон-H2B сигнал от ядрено-ДНК сигнала в контролната група прави стойността на ядрената ДНК по-малка или равна на нула. Ако фоновият сигнал стане висок от умножението, контрастът на умноженото изображение може да се регулира за едни и същи условия във всички проби.

Изображението на оцветяване с dsDNA, минус коригираното изображение на умножен Hsp60 и хистон H2B, беше използвано за последващ анализ. Използвайки функцията "Adjust-Threshold", тези изображения бяха бинаризирани. Избрахме dsDNA puncta с размери от 2 до 2 0 µm2 (кръгове 0,1–1,0) и те бяха преброени с помощта на функцията „Анализиране-Анализиране на частици“.

2.3. Електронна микроскопия

Един ден преди трансфекцията, HeLa клетките се посяват при плътност от 600 клетки/µL. Експресията на интересните гени се заглушава в HeLa клетки с помощта на Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) в реагент за трансфекция Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) съгласно инструкциите на производителя (с крайна концентрация на РНК от 10 nM).

Четири дни след нокдаун на siRNA, клетките бяха подложени на фиксиране. Пробите от клетъчни култури бяха фиксирани с 2% PFA и 2% глутаралдехид в 0.1 М фосфатен буфер, рН 7,4, при 37 ◦C, след това поставени в 4 ◦C хладилник за 30 мин. Пробите бяха фиксирани в 2% глутаралдехид в 0.1 М фосфатен буфер за една нощ при 4 ◦C. Пробите се промиват три пъти с 0.1 М фосфатен буфер за 30 минути и след това се фиксират с 2% осмиев тетроксид в 0,1 М фосфатен буфер при 4 ◦C за 1 час.

Пробите бяха дехидратирани етанолови разтвори, прехвърлени в смола (Quetol-812, Nisshin EM Co., Токио, Япония) и полимеризирани при 60 ◦C за 48 часа. Полимеризираните смоли бяха нарязани на ултратънки 70-nmсекции с диамантен нож с помощта на ултрамикротом (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Германия) и след това бяха монтирани върху медни решетки.

Срезовете се оцветяват с 2% уранил ацетат при стайна температура за 15 минути и се промиват с дестилирана вода, последвано от вторично оцветяване с разтвор за оцветяване с олово (Sigma-Aldrich, Токио, Япония) при стайна температура за 3 минути.

Мрежите бяха наблюдавани под трансмисионен електронен микроскоп (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Токио, Япония) при ускоряващо напрежение от 80 kV (мозък на рибка зебра) или 100 kV (клетка), и изображенията са записани с помощта на камера със свързано зарядно устройство (CCD) (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Имуноелектронна микроскопия

Пробите върху златните дискове бяха замразени в течен пропан при -175 ◦C. След като пробите бяха замразени, те бяха заменени със замразяване с 1% танинова киселина в етанол и 2% дестилирана вода при -80 ◦C за 24 часа.

След това пробите се държат при -20 ◦C за 4 часа, последвано от инкубиране при 4 ◦C за 1 час. След това пробите се дехидратират в безводен етанол 3 пъти за 30 минути. всеки път, последвано от инфилтрация със смес 50:50 от етанол и смола (LR бяла: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) при 4 ◦C за 1 час. Пробите се прехвърлят в прясна 100% смола и се инкубират при 4 ◦C за 30 минути и този процес се повтаря три пъти.

Пробите се прехвърлят в прясна 100% смола и се полимеризират при 50 ◦CO/N. Полимеризираните смоли бяха ултра-тънки срезове при 90 nm с диамантен нож, използвайки ултрамикротом (Ultracut UCT; Leica), и срезовете бяха поставени върху никелови решетки. Решетките се инкубират с анти-dsDNA антитяло (35I9 ДНК) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) в 1% BSA/PBS при 4 ◦CO/N, последвано от три изплаквания с 1% BSA/PBS за 1 минута всеки.

След това те бяха инкубирани с тези вторични антитела, конюгирани с {{0}}nm златни частици (козе анти-мише IgG поликлонално антитяло) в продължение на 2 часа при RT. След изплакване с PBS, решетките се поставят в 2% глутаралдехид 0.1 М какодилатен буфер.

След това решетките се изсушават и след това се оцветяват с 2% уранил ацетат за 15 минути и с разтвор на оловно оцветяване (Sigma-Aldrich) при стайна температура за 3 минути. Решетките се наблюдават през трансмисионен електронен микроскоп (JEM-1400 плюс; JEOLLtd.) при ускорително напрежение 100 kV. Цифровите изображения бяха получени с CCD камера (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Резултати

3.1. Намаленият TFAM или GBA предизвиква увеличаване на ектопичната митохондриална ДНК

Първо, ние показахме пример за откриване на получена от митохондриите цитоплазмена ДНК в HeLa клетки, в които TFAM протеинът е повален от siRNA (Фигура 1A). TFAM е ключов митохондриален транскрипционен фактор и също така функционира в репликацията и възстановяването на митохондриална ДНК [20] .

Съобщава се, че полиморфизмите на последователностите в този ген са свързани с болестта на Паркинсон [21,22]. След 3 дни нокдаун на TFAM протеин, много двойноверижни ДНК точки бяха открити в цитоплазмата на HeLa клетките.

Хистоните са положителни маркери за ДНК с ядрен произход в цитоплазмата и отрицателни маркери за митохондриална ДНК и ДНК с митохондриален произход в цитоплазмата [23]. Тези точки не се локализират съвместно с хистони, което предполага, че не са ДНК с ядрен произход. Освен това, някои от тези цитоплазмени, ектопични ДНК точки не се локализират съвместно с Hsp60, маркер за митохондриалната матрица, което показва, че те се намират извън митохондриите (Фигура 1B, C).

Електронната микроскопия също показа, че ектопичната ДНК е изтекла от митохондриите (Фигура 2A, B). В обобщение, увеличаването на ектопичните ДНК точки в цитоплазмата чрез нокдаун на TFAM се дължи на изтичане на митохондриална ДНК от митохондриите. Второ, ние показахме друг пример за откриване на получена от митохондриите цитоплазмена ДНК в HeLa клетки, в които GBA протеинът е повален от siRNA (Фигура 1А).

GBA е причинният ген за болестта на Гоше, но хетерозиготна мутация на GBA също е рисков фактор за болестта на Паркинсон [24]. Много двойноверижни ДНК точки бяха открити в цитоплазмата на HeLa клетките след 3 дни нокдаун на GBA протеин. Някои ДНК точки са локализирани съвместно с хистони, което предполага, че те са ДНК, получена от ядро.

Други ДНК точки не са локализирани съвместно с хистони, което предполага, че те не са ДНК, получена от ядро, а ДНК, получена от митохондрии (Фигура 1D). В обобщение, увеличаването на ектопичните ДНК точки в цитоплазмата чрез нокдаун на GBA се дължи поне отчасти на изтичане на митохондриална ДНК от митохондриите.

For more information:1950477648nn@gmail.com