Ефектът на Трописетрон върху оксидативния стрес, SIRT1, FOXO3a и Claudin-1 в бъбречната тъкан на диабетни плъхове, предизвикани от STZ

edmund.chen@wecistanche.com

Резюме

Трописетрон е 5-HT3 рецепторен антагонист, който упражнява защитен ефект срещу DN. Целта на това проучване беше да се изследват възможните молекулярни механизми, свързани с ренопротективните ефекти на трописетрон при диабетни плъхове, предизвикани от STZ. Животните бяха разделени на 5 равни групи; контрол, трописетрон, диабет, трописетрон плюс диабет и глибенкламид плюс диабет (n=7). За индукция на диабет тип 1, на животните се прилага единична инжекция STZ (55 mg/kg, ip). Плъхове с диабет са третирани с трописетрон (3 mg/kg) и глибенкламид (1 mg/kg) в продължение на 2 седмици. Според направения анализ диабетът е довел добъбречна дисфункция (намаляване на скоростта на гломерулна филтрация и урея и креатинин в урината, както и повишаване на плазмената урея и креатинин) и аномалии в антиоксидантната защитна система (намаляване на TAC и повишаване на MDA), в сравнение с контролната група, което е предотвратено от трописетрон лечение. Количествената полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция и Western blotting анализът показаха, че генната експресия на SIRT1 намалява, докато генната експресия на FOXO3a и NF-κB, както и съотношенията фосфорилиран FOXO3a/общ FOXO3a протеин и нивото на протеина claudin-1 се увеличават вбъбрекна плъхове с диабет в сравнение с контролната група. Тук резултатите от това изследване показват, че лечението с трописетрон обръща тези промени. Освен това, всички тези промени бяха сравнени с тези, причинени от глибенкламид като положителна контрола. Следователно трописетронът се подобрибъбречно уврежданепоради диабетна нефропатия, вероятно чрез потискане на оксидативния стрес и промяна на нивата на SIRT1, FOXO3a и клаудин-1.

Ключови думи:увреждане на бъбреците; бъбречна функция; бъбречно заболяване; бъбрек; бъбречни тъкани

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ

Въведение

Диабетната нефропатия (DN) е микроваскуларно заболяване, което се характеризира с прекомерна протеинурия с заболеваемост от 25–40 процента (Chen et al. 2011; Ritz et al. 2010). Морфологични и функционални промени, включително гломерулна хипертрофия, прекомерно натрупване на извънклетъчен матрикс и гломерулосклероза и в крайна сметка загуба набъбречна функциявбъбрекса свързани с хипергликемия и впоследствие нарушение на метаболизма на глюкозата (Kanwar et al. 2008; Vikram et al. 2014). Поради това е отделено специално внимание на ефективното управление или лечение, което може да е необходимо за борба с болестта в ранен стадий. Натрупващите се доказателства показват, че производството на реактивни кислородни видове (ROS) като пряк проблем с хипергликемията и впоследствие производството на възпалителни цитокини са основни механизми в развитието на диабетни усложнения (Beckman and Ames 1998; Giacco and Brownlee 2010; Jaimes et al. 2010). ; Киритоши и др., 2003 г.). Очевидно е, че дисбалансът между прооксидантния и антиоксидантния защитен капацитет води до натрупване на свободни радикали, което може да увреди клетъчните макромолекули, включително ДНК, както и протеинова модификация и липидна пероксидация (Peluso and Raguzzini 2016).

Сиртуините на бозайниците са семейство от NAD плюс -зависими деацетилази, включително седем члена (SIRT1-7). Сред тях SIRT1, първият член на семейството, е най-задълбочено проучен (Dong et al. 2014). Скорошни проучвания разкриха, че SIRT1 играе важна роля в регулирането на клетъчната смърт/дълголетието, както и реакцията на остър и хроничен стрес при бозайници чрез намаляване на увреждането на ДНК, възпалението и апоптозата (Hasegawa et al. 2013; Yun et al. 2012). ). Няколко проучвания посочват по-високи нива на ROS-индуцирано понижено регулиране на активността на SIRT1 при диабетицибъбреци,както in vivo, така и in vitro (Akhtar and Siragy 2019; Du et al. 2016; Kumar et al. 2014; Papadimitriou et al. 2015; Park et al. 2016; Shi and Huang 2018).

SIRT1 може да упражнява своето действие чрез регулиране на няколко протеини, като транскрипционните фактори на ядрен фактор-kappaB (NF-κB) и семейството на FOXO (Brunet et al. 2004; Langley et al. 2002; Motta et al. 2004; Yeung et al. 2004). Наскоро беше съобщено, че SIRT1 регулира метаболизма на глюкозата, като допринася за FOXOs (Kobayashi et al. 2005). FOXO3a е подгрупа от семейството на FOXO транскрипционни фактори, които имат важна роля по време на оксидативен стрес (Accili and Arden 2004). Модификациите на FOXO3a възникват чрез фосфорилиране и ацетилиране, които могат да се появят едновременно при различни условия. Според литературата SIRT1 може да деацетилира FOXO3a, като по този начин повишава неговото ниво на убиквитиниране и предпазва от стресори (Wang et al. 2017a). Има малко информация за механизма на взаимодействията между SIRT1 и FOXO по време на хипергликемични състояния (Yun et al. 2012). Въпреки това се предполага, че SIRT1 модулира активността на FOXO вероятно чрез тяхната ядрена транслокация (Brunet et al. 2004) и също така контролира ген-специфичната транскрипция (Kobayashi et al. 2005). Следователно, транслокацията на FOXO3a от цитоплазмата към ядрото се причинява главно от деацетилиращата активност на SIRT1, особено при статус на оксидативен стрес (Yun et al. 2012).

Wang и др. съобщават, че лечението с висока глюкоза модулира експресията на протеини SIRT1 и FOXO3a при хорабъбрекепителни клетки (Wang et al. 2017b). Освен това, FOXO3a функционира като положителен регулатор на NF-κB сигнализиране, в което може да се използва за повлияване на стратегиите за оцеляване на клетките при условия на стрес (Li et al. 2012). Claudin-1 е предполагаем специфичен маркер за париетални епителни клетки (PEC) (Huby et al. 2009; Ohse et al. 2009; Rincon-Choles et al. 2006), който е отрицателно свързан с експресията на SIRT1 в двете проксимални тубули и гломерулна област. Беше показано, че понижаването на SIRT1 при диабет се потвърждава от регулирането нагоре на протеина с плътна връзка claudin-1 в подоцитите, допринасящи за албуминурия (Gong et al. 2017; Hasegawa et al. 2013). Тъй като оксидативният стрес, възпалителен цитокин и техните молекулярни медиатори са основни теми във вредния ефект на диабета, антиоксидантните и противовъзпалителните агенти могат да осигурят нови терапии срещу DN (Elmarakby and Sullivan 2012).

Трописетрон е наскоро появил се 5-HT3 рецепторен антагонист, който е идентифициран като антиеметично лекарство по време на химиотерапия (Barzegar-Fallah et al. 2015). Няколко доклада показват, че трописетрон може да предложи антиапоптотични, антидиабетни, противоракови, антилипидемични, невропротективни и кардиопротективни ефекти, които вероятно са медиирани чрез антиоксидантни и противовъзпалителни механизми (Aminzadeh 2017; Asadi et al. 2016; Barzegar-Fallah et al. 2015; Barzegar-Fallah и др. 2014; Gholizadeh-Ghaleh Aziz и др. 2019; Rashidi и Bazi 2020). Има някои проучвания, които доказват антиоксидантния ефект на трописетрон, както in vitro, така и in vivo, като например защитния ефект на трописетрон върху индуцираното от хипергликемия окислително смущение в PC12 клетки (Aminzadeh 2017), подобряване на митохондриалното увреждане чрез понижаване на нитрергичните активността на системата в мозъка (Haj Mirzaian et al. 2016) или намаляване на оксидативния стрес срещу стареенето на мозъка при мишки (Mirshafa et al. 2020).

Наскоро Barzegar Fallah et al. разкрива, че трописетронът подобрява кръвната глюкоза и същобъбречна функциякакто се вижда от намаляването на серумния уреен азот (BUN), нивата на серумния креатинин и отделянето на албумин в урината. В допълнение, съдържанието на малондиалдехид (MDA), нивата на глутатион (GSH), активността на супероксид дисмутаза (SOD) и каталаза (CAT) бяха подобрение при животни с диабет, лекувани с трописетрон (Barzegar-Fallah et al. 2015). Въпреки това, няма други убедителни доказателства за модулирането на DN от трописетрон и неговия молекулярен механизъм. Ето защо това проучване има за цел да оцени първо: ефектите на трописетрон върху молекулярните медиатори, включително SIRT1, NF-κB и FOXO3a, както и клаудин-1, който е протеин, участващ в тесни епителни връзки и играе основна роля вбъбречнадиабетна нефропатия; второ, да се сравни ефектът на трописетрон със стандартното предлагано на пазара антидиабетно лекарство, глибенкламид, за да се намери по-полезен и безопасен агент като златен стандарт антидиабетно лекарство.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ

Материали и методиТова проучване е проведено в съответствие с Принципите за грижа за лабораторни животни в Университета по медицински науки на Урмия. Постигнато е етично одобрение от Директива 2010/63/ЕС на ЕС за експерименти с животни съгласно насоките на Комитета по медицинска етика, Министерство на здравеопазването, Иран (IR.UMSU.REC.1397.291). Тридесет и пет мъжки плъха Wistar (230–270 g тегло, 3–4 месечна възраст) бяха разпределени в 5 групи (седем плъха във всяка група): 1. Контролна група: Плъховете получиха нормален физиологичен разтвор интраперитонеално в продължение на 2 седмици. 2. Група на трописетрон: Плъховете получават трописетрон интраперитонеално в продължение на 2 седмици. 3. Диабетна група: Диабетът е индуциран чрез инжектиране на стрептозотоцин (STZ) при плъхове. 4. Трописетрон плюс диабетна група: Плъховете са получили 3 mg/kg трописетрон (Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019) интраперитонеално в продължение на 2 седмици след предизвикване на диабет. 5. Глибенкламид плюс диабетна група: Плъховете са получили 1 mg/kg глибенкламид (Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019) интраперитонеално в продължение на 2 седмици след индукция на диабет.

Индуциране на диабетСтрептозотоцин (50 mg/kg) се инжектира интраперитонеално в единична доза за индуциране на диабет при плъхове. Въз основа на този метод, диабет тип I се индуцира при плъхове 72 часа след инжектирането. Диабетът е диагностициран и потвърден чрез създаване на леко нараняване с помощта на ланцет в опашката на гладни плъхове и след това капка кръв е поставена върху лента на глюкометър. След това се измерва с глюкомер (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN) и нивата на кръвната захар над 300 mg/dl се считат за индикатор за предизвикване на диабет. След 2 седмици и 24 часа преди анестезиране, плъховете се поставят в метаболитни клетки един по един и се събира урина. След това пробите от урина се центрофугират веднага с прозрачна повърхност на пробите, съхранявани при -20 градуса за анализ на урея и креатинин. След това плъховете се претеглят и се анестезират чрез интраперитонеално инжектиране на смес от кетамин (60 mg/kg) и ксилазин (4 mg/kg). След това се отваря коремната кухина; кръвта се взема от сърцето с тясна спринцовка и се смесва с етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) и се центрофугира при 4000 × g за 20 минути. След това получената плазма се съхранява при -80 градуса за по-късно измерване на урея, креатинин и общ антиоксидантен капацитет (TAC). И дветебъбрециот животните бяха изрязани, промити със студен физиологичен серум и претеглени. Ляватабъбректъканите се хомогенизират от Ultra Turrax (T10B, IKA и Германия) в разтвор, съдържащ РНКаза, за да се тестват нивата на експресия на SIRT1, NF-κB и FOXO3a, като се използва PCR методът в реално време. вярнобъбрекбеше замразен при -80 градуса за измерване на MDA и Western blot анализ (общ и фосфорилиран FOXO3a и клаудин-1).

Кръвна захар на гладноВ края на протокола, след нощно гладуване (14 до 18 часа), бяха взети кръвни проби от върха на опашката и след това нивата на глюкозата бяха измерени с помощта на цифров глюкомер (Elegance, CT-X10, Frankenberg, Германия).Урея и креатинин в урината и плазматаЗа тази цел нивата на урея и креатинин в урината и плазмата ще бъдат измерени чрез икономически комплекти, специфични за измерване на урея и креатинин (Biotechnical; Varginha, Minas Gerais, Бразилия).Скорост на гломерулна филтрацияСкоростта на гломерулна филтрация (GFR) е най-добрият общ индекс набъбречни функции, което беше оценено чрез изчисляване на креатининов клирънс (GFR=[UCr × V]/SCr) и използване на концентрациите на креатинин в плазмата и урината и скоростта или обема на потока на урината.

Малонов диалдехид и общ антиоксидантен капацитетMDA като краен продукт на липидната пероксидация беше оценен чрез реакция с тиобарбитурова киселина (Sigma-Aldrich; САЩ) вбъбрекпроби съгласно протокола на производителя (Esterbauer и Cheeseman 1990). Накратко, 0.3–0,4 g отбъбречна тъкансе хомогенизира в ледено студен KCl (15 0 mM) и след това се центрофугира при 3000 × g за 10 минути. След това, 0,5 ml от супернатантата се комбинира с 3 ml фосфорна киселина (1 процент, v/v) и след смесване на вортекс, 2 ml от 6,7 g/l TBA се присъединява към пробите. Пробите се нагряват при 100 градуса за 45 минути. След охлаждане върху лед, n-бутанол (3 ml) се комбинира и продуктите се центрофугират допълнително при 3000 × g за още 10 минути. След това абсорбцията на продуктите се разглежда при 532 nm чрез спектрофотометрия. Нивото на абсорбция се сравнява със стандартната крива. TAC беше измерен с комплект за общо антиоксидантно състояние Randox, в който ABTS 2,2'-азино-бис(3-етилбензотиазолин-6-сулфонат) се инкубира с пероксидаза и H2O2, което води до производството на радикален катион ABTS плюс . Той има стабилен синьо-зелен цвят, който се оценява с 600-nm автоматичен анализатор (Amini et al. 2020).

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА

Дизайн на праймер и PCR в реално времеРНК първо беше извлечена от съответния комплект (GENALL) и кондензираната РНК беше качествено (електрофореза) и количествено (нанокапка) оценена, за да се осигури екстракция на РНК и приложение в следващите молекулярни техники. След това съответната сДНК се синтезира от всички екстрахирани РНК проби. Праймерите на целевите гени и гена на глицералдехид дехидрогеназата (GAPDH) като домакински ген бяха изследвани на сайта на NCBI с помощта на софтуера Generunner (допълнителна таблица). След това генната експресия се анализира с помощта на синтезираните праймери чрез PCR комплект, последвано от статистически анализ на данните.

Western blotМетодът Western blot беше използван за определяне на нивата на FOXO3a (общ и фосфорилиран) и клаудин-1 протеин вбъбрек.За направата на гела за електрофореза се използват два разделящи и подреждащи гела. След приготвянето на разтворимия гел и изливането му във формата, след един час и след натрупването се добавя гел за подреждане. Пробите се зареждат в ямки, направени със специален гребен. След това те бяха разделени от SDS-PAGE. В рамките на един час всички заредени образци бяха прехвърлени върху PVDF мембраната. Впоследствие пробите бяха блокирани с 5 процента обезмаслен млечен буфер, включително 0.1 процента Tween 20 и след това бяха инкубирани с първични антитела за една нощ при 4 градуса в шейкър инкубатор. След това мембраните се инкубират с вторично антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян. Накрая, бета-актинът беше използван като вътрешен стандарт за Western blot анализа. Накрая, ефектите от блотираните проби, в зависимост от нивото на целевия протеин, бяха оценени върху радиографския филм в тъмна стая. За да се определят количествено целевите протеини, резултатите от сканирането на филма се изчисляват чрез денситометър спрямо нивото на актин. Антителата, използвани в Western blotting анализи, са показани в допълнителната таблица (каталожни номера и компании).

Статистически анализРезултатите бяха представени като средна стойност ± SEM. Статистическият анализ беше извършен с помощта на SPSS 16.0. Сравнението между групите беше оценено чрез теста ANOVA, последван от post hoc теста на Tukey. Разликите се приемат за статистически значими при P <>

Резултати

Трописетрон намалява кръвната глюкоза на гладно (mg/dl), теглото на бъбреците (g) и бъбречния индекс (mg/g), докато повишава телесното тегло (g) при диабетни плъхове, предизвикани от STZПодобно на предишни проучвания в тази работа, групите с диабет показват тежка (P < {{0}}.001)="" хипергликемия="" в="" сравнение="" с="" контролната="" група.="" консумацията="" на="" трописетрон="" (p=""><{10}}.01) и="" глибенкламид="" (p=""><0.05) в="" продължение="" на="" 2="" седмици="" значително="" намалява="" кръвната="" глюкоза="" в="" групите="" с="" индуциран="" от="" stz="" диабет,="" но="" все="" още="" е="" значително="" по-висока="" от="" тази="" в="" контролната="" група="" (p=""><0.001 ).="" няма="" значителна="" разлика="" в="" телесното="" тегло="" (тт)="" между="" групите="" в="" началото="" на="" това="" проучване="" (данните="" не="" са="" показани).="" индукцията="" на="" диабет="" от="" stz="" значително="" намалява="" (p=""><0,001) накрая="" (bw)="" при="" плъхове="" с="">Бъбректеглото (KW) не е значимо сред групите в началото; въпреки това, той е повишен в групата с диабет и е намалял след интервенции.Бъбрекиндекс (KW/BW) е значително повишен (P < {{0}}.001)="" при="" t1dm="" в="" сравнение="" с="" контролната="" група.="" интересно="" е,="" че="" след="" 2="" седмици="" приложение="" на="" трописетрон="" и="" глибенкламид,="" модулирани="" kw/bw="" (p=""><0,05) (таблица="">

Трописетрон подобрява биохимичния анализ при STZ-индуцирани диабетни плъховеКакто и в предишни проучвания, нивата на урея в плазмата и урината на групата с диабет са значително по-високи от тези в контролната група (P < {{0}}.001)="" .="" в="" групата="" на="" трописетрон="" плюс="" диабет,="" плазма="" (p="">< 0.{{10}}01)="" и="" урина="" (p="">< 0.0="" 5)="" нивата="" на="" урея="" са="" намалели="" значително="" в="" сравнение="" с="" тези="" в="" групите="" с="" диабет.="" въпреки="" това,="" уреята="" в="" урината="" все="" още="" е="" значително="" по-ниска="" от="" тази="" в="" контролната="" група="" (p=""><0,01). няма="" значима="" разлика="" в="" плазменото="" ниво="" на="" урея="" между="" трописетрон="" плюс="" диабет="" и="" контролните="" групи.="" нивото="" на="" креатинин="" в="" плазмата="" (p=""><0,001) и="" урината="" (p=""><0,05) показва="" значително="" увеличение="" при="" плъховете="" с="" диабет="" в="" сравнение="" с="" това="" в="" контролната="" група.="" прилагането="" на="" тропизетрон="" значително="" намалява="" нивата="" на="" креатинин="" в="" урината="" и="" плазмата="" (p=""><0,001) в="" сравнение="" с="" групата="" с="" диабет.="" при="" животни="" с="" диабет="" креатининовият="" клирънс,="" като="" индикатор="" за="" скоростта="" на="" гломерулна="" филтрация,="" е="" значително="" по-нисък="" от="" този="" в="" контролната="" група="" (p=""><0.05). лечението="" с="" тропизетрон="" значително="" повишава="" креатининовия="" клирънс="" в="" сравнение="" с="" този="" в="" групата="" с="" диабет="" (p=""><0,001). същите="" резултати="" са="" получени="" в="" групата,="" лекувана="" с="" глибенкламид.="" въпреки="" това,="" плазмената="" урея="" е="" много="" по-ниска="" в="" групата,="" лекувана="" с="" трописетрон,="" в="" сравнение="" с="" тази="" в="" групата="" на="" глибенкламид="" плюс="" диабет="" (p=""><0,01) (таблица="">

Трописетрон повишава плазменото съдържание на TAC и намалява нивото на MDA при диабетни плъхове, предизвикани от STZНивото на MDA в групите контрола, трописетрон, захарен диабет, трописетрон плюс диабет и глибенкламид плюс диабет е 8,65 ± 1.01, 10.89 ± 1.6 35.54 ± 7.1, 18.76 ± 3.6 и 16.89 ± 4.1 nmol/mg протеин, съответно. Нашето проучване, заедно с тези на други, демонстрира най-високото ниво на MDA в групата с диабет, което показва значително увеличение в сравнение с контролната група (P < 0.00="" 1).="" нивото="" на="" mda="" в="" групите="" с="" трописетрон="" плюс="" диабет="" и="" глибенкламид="" плюс="" диабет="" показва="" значително="" намаление="" (p="">< {{30}}.01)="" в="" сравнение="" с="" групата="" с="" диабет="" (фиг.="" 1а).="" нивата="" на="" tac="" в="" контролната="" група,="" трописетрон,="" диабет,="" трописетрон="" плюс="" диабет="" и="" глибенкламид="" плюс="" диабет="" групи="" бяха="" 0.65="" ±="" 0.{{40}}3,="" {{44}="" }.76="" ±="" 0.06,="" 0,26="" ±="" 0,08,="" 0,45="" ±="" 0,06="" и="" 0,57="" ±="" 0,08="" nmol/ml,="" съответно.="" нивата="" на="" tac="" намаляват="" в="" групата="" с="" диабет="" в="" сравнение="" с="" тези="" на="" контролната="" група="" (p=""><0,001), както="" е="" показано="" по-рано.="" прилагането="" както="" на="" трописетрон,="" така="" и="" на="" глибенкламид="" значително="" (р=""><0,01) повишава="" плазмените="" нива="" на="" tac="" при="" животни="" с="" диабет="" в="" сравнение="" с="" групата="" с="" диабет="" (фиг.="">

Трописетрон повишава SIRT1 и намалява генните експресии на FOXO3a и NF-κB. Генните експресии са оценени чрез PCR в реално време, което предоставя важно доказателство за разликата между групите. Съответно диабетът се свързва със значително намаление (0.65 ± 0.08) в експресията на SIRT1 ген (P < 0.01="" )="" и="" значително="" увеличение="" (p="">< 0.001)="" във="" foxo3a="" (1,98="" ±="" 0.08)="" и="" nf-κb="" (1,71="" ±="" 0.14)="" генна="" експресия="" в="" сравнение="" с="" контролната="" група.="" лечението="" с="" трописетрон="" повишава="" sirt1="" (0.88="" ±="" 0.3)="" и="" намалява="" значително="" нивата="" на="" mrna="" на="" foxo3a="" (1.53="" ±="" 0.08)="" (p="">< 0.05)="" и="" nf-κb="" (1.27="" ±="" 0.03)="" (p="">< 0.01)="" при="" плъхове="" с="" диабет="" (фиг.="" 2a–c).="" подобни="" резултати="" са="" получени="" при="" животните,="" третирани="" със="" стандартното="" лекарство,="">

Трописетрон намалява експресията на протеини FOXO3a и claudin-1За да се оцени експресията на FOXO3a (общо и фосфорилирано) и клаудин- 1 протеин след лечение с трописетрон и глибенкламид, беше използвано Western blotting вбъбрекна различни групи. Анализът на данните показва значително увеличение на съотношенията фосфорилиран FOXO3a/общ FOXO3a протеин (4,6 ± 0.17) и клаудин-1 (3.02 ± 0.16 ) протеинови нива в групата с диабет в сравнение с контролата (P < 0.001).="" прилагането="" на="" трописетрон="" значително="" намалява="" съотношенията="" фосфорилиран="" foxo3a/общ="" протеин="" foxo3a="" (2,14="" ±="" 0,31)="" и="" нивата="" на="" клаудин-1="" (2,4="" ±="" 0,12)="">бъбрекна плъхове с диабет (P < {{0}}.01).="" лечението="" с="" глибенкламид="" значително="" намалява="" съотношенията="" фосфорилиран="" foxo3a/общ="" foxo3a="" протеин="" (2,57="" ±="" 0.5)="" (p="">< 0.001)="" и="" клаудин-1="" (2,2="" ±="" 0,11)="" (p="">< 0,05="" )="" нива="" на="" протеин="" в="" stz-индуцираните="" диабетни="" плъхове="" (фиг.="">

Дискусия Резултатите от настоящото проучване са дадени в следните раздели: еднократно инжектиране на STZ-индуциран T1DM е свързано с тежка хипергликемия, загуба на тегло ибъбрекдисфункция, която се проявява чрез значително повишаване на плазмения креатинин и урея и значително намаляване на креатининовия клирънс като индекс на GFR в сравнение с този в контролната група. STZ нарушава окислителния баланс вбъбректъкан, което беше доказано чрез увеличаване на MDA и намаляване на съдържанието на TAC. Допълнителен молекулярен анализ показа, че диабетът намалява SIRT1 иРНК и повишава NF-κB иРНК, както и съотношенията фосфорилиран FOXO3a/общ FOXO3a протеин и нивото на протеина claudin-1 вбъбрекна мъжки плъхове. Значително подобрение на уреята, креатинина, креатинина

клирънс, както и SIRT1 иРНК, NF-кВ иРНК, съотношения фосфорилиран FOXO3a/общ протеин FOXO3a и протеин клаудин-1, подобни на тези на контролните животни, са наблюдавани в групата на трописетрон плюс диабет. DN, който се характеризира с няколко характеристики, като прекъсване набъбречнаструктурна и функционална цялост, увеличаване набъбрекразмера, както и гломерулната и тубулната хипертрофия, е водеща причина за крайния стадийбъбречно заболяване(Singh et al. 2018; Yaribeygi et al. 2018). Прогресивната албуминурия, намалената GFR и повишаването на артериалното кръвно налягане са най-изразените функционални симптоми, наблюдавани при пациенти с диабет (Alzahrani et al. 2020). Най-ранният маркер на DN е албуминурията, която се причинява от прогресивно гломерулно увреждане като централна характеристика при започване наувреждане на бъбреците(Elsherbiny et al. 2018). В съответствие с нашите открития, предишни проучвания подчертават, че DN е придружено от повишения на серумния креатинин и урея, което предполага дисфункция набъбречна тъкан(Sharma et al. 2006; Tang et al. 2018).

Натрупващите се доказателства показват, че генерирането на свободни радикали, дължащо се на хипергликемия, е ключово събитие в началото и прогресията на диабетните микроваскуларни усложнения, включително DN. Прекомерното производство на ROS допринася за оксидативно увреждане чрез засягане на макромолекули, клетки и тъкани и води до необратимо увреждане или функционални смущения (Kiritoshi et al. 2003).

MDA като маркер за липидна пероксидация се задейства от атаката на свободните радикали върху мембранните ненаситени мастни киселини, които са допринесли за диабетни усложнения (Pieme et al. 2017). Общият антиоксидантен статус беше оценен чрез TAC, който е биомаркер за определяне на оксидативния стрес при много патологични състояния. По този начин уврежданията на MDA и TAC при пациенти с диабет отразяват производството на свободни радикали, които предизвикват състояние на оксидативен стрес (Peluso and Raguzzini 2016). Последователно, резултатите от това проучване показват повишени нива на MDA и понижени нива на TAC при плъхове с диабетбъбрек. Като се има предвид този факт, отслабването на оксидативния стрес облекчава диабетните усложнения, включителнобъбречно увреждане(Alzahrani et al. 2020; Barzegar-Fallah et al. 2015).

Трописетрон, като 5-HT3 антагонист с антиоксидантна и противовъзпалителна активност, показва защитни ефекти при няколко патологични състояния като диабет (Barzegar-Fallah et al. 2015; Rashidi and Bazi 2020). Нефропротективният ефект на трописетрон е описан по-рано при експерименти с животни. В рамките на тази гледна точка трописетронът подобрява DN по 5-HT3 рецептор-независим начин, като предотвратява повишаване на кръвната глюкоза,бъбречнаНива на MDA, CAT, SOD, Gpx и TNF- и намалена екскреция на цитокини в урината и албуминурия (Barzegar-Fallah et al. 2015).

В съответствие с този проблем, в настоящото разследване са предоставени доказателства, които показват, че трописетрон модулира хипергликемия, загуба на тегло и състояние на оксидативен стрес, което се проявява чрез намаляване на MDA и увеличаване на съдържанието на TAC и подобренобъбрекдисфункция (значително намаляване на плазмената урея и креатинин). Глибенкламид се прилага като стандартно лекарство според предишни проучвания (Amini et al. 2020). Интересно е, че не се наблюдава значима разлика в споменатите параметри в групите, прилагани с глибенкламид и с трописетрон, вбъбрекна плъхове с диабет. Въпреки това, точните механизми зад защитния ефект на трописетрон при DN все още не са известни. Доколкото ни е известно, това е първото проучване, което демонстрира, че трописетрон повишава генната експресия на SIRT1 и намалява съотношенията фосфорилиран FOXO3a/общ протеин FOXO3a, нивата на NF-κB и клаудин- 1 протеин вбъбрекна животни с диабет.

SIRT1 е протеинова деацетилаза от клас III, която участва в оцеляването на клетките при стресови условия чрез активиране на няколко ключови протеина. Това е съществен фактор за модулиране на генната експресия в отговор на генерирането на ROS като NF-κB и foxo транскрипционни фактори (Brunet et al. 2004; Sengupta et al. 2011). Сред семейството на foxo се приема, че FOXO3a има важна роля по време на оксидативен стрес чрез регулиране на няколко антиоксиданта, включително SOD и CAT

(Hasegawa et al. 2008; Kops et al. 2002). По-специално, инактивирането на FOXO3a е свързано с понижаване на CAT-индуцирания оксидативен стрес по време на състояния на хипергликемия (Wang et al. 2017b). SIRT1 управлява активирането на FOXO3a чрез деацетилиране и модулира клетъчния отговор към оксидативен стрес директно или индиректно (Hori et al. 2013). Беше декларирано, че има функционална връзка между SIRT1 и FOXO3 регулиране на MnSOD-медиирана антиоксидантна защитна система (Tanaka et al. 2009; Zhang et al. 2015). Съответно Zhang et al. (2015) демонстрира, че икариинът предпазва острото белодробно увреждане, причинено от чревна исхемия/реперфузионно-медииран SIRT1/FOXO3 сигнален път чрез регулиране нагоре на експресията на MnSOD. Предишни доклади също предполагат, че регулирането нагоре на SIRT1 облекчава индуцираната от цисплатин нефропатия,бъбречнаисхемично/реперфузионно увреждане и диабетна нефропатия (Funk и Schnellmann 2013; Gu et al. 2016; Kim et al. 2011). По-специално, индуцираното от диабет регулиране надолу на SIRT1, което води до патофизиологични промени, води добъбречнатоксичност (Wang et al. 2017b). Хасегава и др. (2013) демонстрира, че намаленият SIRT1 в проксималните тубули задейства инициирането на DN и води до албуминурия. В съответствие с това резултатите от това изследване са намалелибъбречнаЕкспресия на SIRT1 ген в групата с диабет. Следователно, активирането на SIRT1 предизвика резистентност набъбречнатубулните клетки към клетъчния стрес (Kume et al. 2013). Като цяло активаторите на SIRT1 са спечелили забележително внимание като интересни кандидати за лечение на диабет (Song et al. 2018)

Освен това, настоящото изследване също показа подчертан възпалителен отговор при диабетбъбрецикакто се вижда от повишението на NF-κB. Това е основен регулиращ фактор, свързан с имунния отговор и възпалението (Hayden and Ghosh 2012). В съответствие с констатациите от това изследване, няколко проучвания съобщават, че активирането на NF-κB и неговата ядрена транслокация се увеличава както в експерименталната, така и в човешката DN (Alzahrani et al. 2020; Kuhad and Chopra 2009). В допълнение, повишаването на SIRT1 допринася за инактивиране на NF-κB за спасяване на подоцитите от нараняване при диабетицибъбрек(Liu et al. 2014). Интересно е, че свръхекспресията на SIRT1 намалява експресията на протеин в тесни епителни връзки, а именно клаудин-1, при хипергликемични плъхове, което е в корелация с нивото на протеинурия. Активираният клаудин-1 в подоцитите влошава функцията на гломерулната бариера чрез намаляване на експресията на синаптоподин или подоцин, което води до албуминурия (Hasegawa et al. 2013). Тези констатации са одобрени и в бъбреците на плъхове с диабет.

Тук беше демонстрирано за първи път, че при диабетни състояния приложението на трописетрон води до повишена експресия на SIRT1 ген и съпътстващо намалени съотношения на фосфорилиран FOXO3a/общ протеин FOXO3a, нива на NF-κB и клаудин-1 протеин. Следователно е много логично такова активиране в SIRT1 и последващото намаляване на съотношенията на фосфорилиран FOXO3a/общ FOXO3a протеин, NF-κB и клаудин-1 да бъдат отчасти отговорни за подобряването на диабетикбъбречна функция. Изследователите съобщават, че защитните ефекти на трописетрон при DN изглеждат 5-независими от HT3 рецептора, тъй като гранисетрон, друг селективен 5-блокер на HT3 рецептори, не успява да защити DN. Беше декларирано, че антиоксидантните и противовъзпалителните механизми на трописетрон може да имат критична роля вбъбречна тъканзащита при диабет (Barzegar-Fallah et al. 2015). Наскоро нашата лаборатория наблюдава, че лечението с трописетрон повишава секрецията на инсулин и намалява нивото на кръвната захар чрез повишаване на експресията на GLUT2 ген, както и UCP2/ZnT8 пътя (Naderi et al. 2020). Трописетрон като блокер на 5-HT3 рецептора повишава освобождаването на инсулин от бета-клетъчната линия на панкреаса, произвеждаща инсулин, което води до хипогликемия (Heimes et al. 2009). Следователно изглежда, че модулирането на освобождаването на инсулин и впоследствие глюкозната хомеостаза може да включва антиоксидантни и противовъзпалителни реакции, допринасящи забъбрекзащита.

В съответствие с настоящите открития, трописетрон обърна окислителното увреждане чрез увеличаване на експресията на SIRT1 ген при стареене при мишки (Mirshafa et al. 2020). В допълнение, отслабване на чернодробно увреждане, нива на TNF- и IL-6 протеин се наблюдава в черния дроб на плъхове с диабет след съвместно лечение с трописетрон (Amini et al. 2020; Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019). Също така, в настоящото изследване, трописетрон показа подобен отговор на стандартно лекарство, глибенкламид. Съответно експозицията на глибенкламид повишава SIRT1 и намалява съотношенията фосфорилиран FOXO3a/общ протеин FOXO3a, нивата на NF-κB и клаудин-1 при диабетицитебъбрецив настоящото изследване. Глибенкламидът е утвърдено лекарство, което е широко използвано при лечението на пациенти с диабет чрез инхибиране на ATP-чувствителните К плюс канали. Тъй като има някои противоречиви резултати по отношение на ефекта на глибенкламид при DN (Akbar et al. 2013; Elmalí et al. 2004; Nakamura et al. 2000), вероятно поради дозировката или продължителността на лечението, това събитие даде мотивация за въвеждане на ново лекарство за пациенти с диабет като безопасно и ефективно средство с по-малко странични ефекти

Като цяло трописетронът ефективно подобрявабъбречна функцияв DN вероятно чрез промяна на експресията на SIRT1, съотношенията фосфорилиран FOXO3a/общ FOXO3a протеин, NF-κB и клаудин-1. Това проучване имаше някои ограничения в подкрепа на тази тема. Например, морфологичните изследвания трябва да се опитат да предоставят допълнителни доказателства за валидиране на настоящото изследване. Освен това изследователите не са използвали молекулни инхибитори, за да потвърдят точния механизъм на сигналния път.

Заключение

В заключение, резултатите от това проучване показват нефропротективния ефект на трописетрон при STZ-индуциран T1DM. Забележителните констатации от това изследване показват, че нефропротективният ефект на трописетрон вероятно включва промени в експресията на SIRT1, FOXO3a, NF-κB и клаудин-1. Тези данни могат да бъдат стимул за по-нататъшни изследвания в тази област.