Инхибиторен ефект на производно на куркумин J147 върху меланогенезата и транспорта на меланозоми чрез улесняване на ERK-медиирано MITF разграждане, част 1

Признато е терапевтичното използване на куркумин и химически модифициран куркумин (CMC) за потискане на меланогенезата и активността на тирозиназата. J147 е модифицирана версия на куркумин с превъзходна бионаличност и стабилност. Въпреки това, няма доклад за ефектите на J147 върху пигментацията in vitro и in vivo. В нашите проучвания ние изследвахме хипопигментните ефекти на лечението с J147 върху меланоцитите и проучихме основния механизъм. Настоящите проучвания предполагат, че J147 потиска както базалната, така и -MSH-индуцираната меланогенеза, както и намалява разширяването на дендритите на меланоцитите и меланозомния транспорт. J147 играе тези роли главно чрез активиране на пътя на извънклетъчната сигнално-регулирана протеин киназа (ERK). Веднъж активиран, той води до разграждане на MITF и допълнително понижава експресията на тирозиназа, TRP-1, TRP-2, миозин Va, Rab27a и Cdc42, като в крайна сметка инхибира синтеза на меланин и транспорта на меланозома. Освен това хипопигментните ефекти на J147 бяха демонстрирани in vivo в модел на рибка зебра и UVB-индуциран модел на хиперпигментация при кафяви морски свинчета. Нашите открития също предполагат, че J147 не проявява цитотоксичност in vitro и in vivo. Взети заедно, тези данни потвърждават, че J147 може да се окаже доста полезен като по-безопасен естествен агент за избелване на кожата.

Цистанчесъщо има функцията нанасърчаване на производството на колаген, което може да увеличи еластичността и блясъка на кожата и да помогне за възстановяването на увредените кожни клетки. ЦистанчеФенилетанол гликозидиимат значителен потискащ ефект върхутирозиназаактивност и е доказано, че ефектът върху тирозиназата е конкурентно и обратимо инхибиране, което може да осигури научна основа за разработване и използване наизбелващи съставкив Систанче. Следователно цистанхата има ключова роля в избелването на кожата. То можеинхибират производството на меланинза намаляване на обезцветяването и матовостта; и насърчаване на производството на колаген заподобряване на еластичността на кожатаи излъчване. Поради широкото признание на тези ефекти на цистанче, многоизбелване на кожатапродуктите започнаха да включват билкови съставки като Cistanche, за да отговорят на потребителското търсене, като по този начин увеличават търговската стойност на Cistanche в продуктите за избелване на кожата. В обобщение, ролята на цистанхата в избелването на кожата е решаваща. Неговият антиоксидантен ефект и ефектът на производство на колаген могат да намалят обезцветяването и матовостта, да подобрят еластичността и блясъка на кожата и по този начин да постигнат избелващ ефект. Освен това широкото приложение на Cistanche в продуктите за избелване на кожата показва, че ролята му в търговската стойност не може да бъде подценявана.

Ключови думи: J147, хипопигментни ефекти, меланозомен транспорт, ERK път, разграждане на MITF

Кликнете върху Cistanche Tubulosa за избелване

За повече информация: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

ВЪВЕДЕНИЕ

Пигментацията на кожата зависи както от синтеза на меланин, така и от разпределението му в слоя на епидермиса. Меланинът се произвежда главно около ядрото на меланоцитите и се съхранява в меланозоми (Tian et al., 2021). След узряване, меланозомите мигрираха по протежение на микротубули и актинови нишки до върховете на дендритите на клетките и накрая до съседните кератиноцити, за да завършат процеса на разпределение (Beaumont et al., 2011; Ohbayashi and Fukuda, 2012). При нормален физиологичен статус меланинът предпазва човешката кожа от ултравиолетово (UV) увреждане, токсични химикали и други фактори на околната среда (Slominski et al., 2004; Yousaf et al., 2020). Въпреки това, прекомерното производство и натрупване предизвикват хиперпигментация и са свързани с кожни заболявания като пост-възпалителна меланодермия, мелазма и слънчеви лентигини, което води до забележително психосоциално бреме (Pillaiyar et al., 2017). Следователно е необходимо да се разработят ефективни и безопасни средства за избелване на кожата.

През последните години меланиновата клетъчна биология се превърна в по-широко изследователско поле и няколко важни протеина, допринасящи за меланогенезата и меланозомния транспорт, бяха изяснени, като по този начин се идентифицират инхибиторите на синтеза на меланин. Тирозиназата е изключително необходима за меланогенезата и инхибирането на каталитичното действие на тирозиназата е най-честият метод за намаляване на производството на меланин (D'Mello et al., 2016). Няколко известни инхибитори на тирозиназата, включително арбутин и коджикова киселина, вече са разработени като козметични добавки (Ding et al., 2020). KIF5b и Rab27A-меланофилин-миозин Va комплексът допринасят за външния меланозомен транспорт (Ohbayashi и Fukuda, 2012; Noguchi et al., 2014). Cdc42 регулира удължаването на дендрита, което е от съществено значение за трансфера на меланозома (Luo, 2000). Инхибирането на тези по-горе протеини може значително да потисне меланозомния транспорт, което е важен механизъм за разработване на агенти за избелване на кожата. Свързаният с микрофталмия транскрипционен фактор (MITF) е главен транскрипционен фактор в меланогенезата. Освен това, MITF също така регулира меланозомния транспорт чрез индуциране на експресията на Rab27a и Cdc42 (Noguchi et al., 2016). Множество сигнални пътища участват в пигментацията чрез регулиране на нивото на експресия на MITF. Активирането на cAMP протеин киназа A (PKA) стимулира пигментацията чрез cAMP отговорен елемент свързващ протеин (CREB) зависима регулация на експресията на MITF (Rodríguez and Setaluri, 2014). Обратно, активирането на извънклетъчна сигнално-регулирана протеин киназа (ERK) инхибира меланогенезата чрез ускоряване на разграждането на MITF (Lv et al., 2020a). Разработени са множество антимеланогенни агенти, които са насочени към активността на тирозиназата, трансфера на меланозома или свързаните с меланогените сигнални пътища. Малко инхибитори обаче са подложени на проучвания in vivo и показват добри резултати (Pillaiyar et al., 2017).

Куркуминът е диарилхептаноидно съединение, изолирано от коренището на Curcuma longa (Zingiberaceae) и използвано като жълт аромат или пигмент в храни (Zheng J. et al., 2018). Проучванията показват неговите различни физиологични функции, включително противовъзпалителни, антиоксидантни, антиамилоидни и антитуморни дейности (Liu et al., 2016; Zheng Y. et al., 2018). Освен това, куркуминът инхибира активността на тирозиназата и потиска меланогенезата в меланоцитите (Lee et al., 2010; Tu et al., 2012). Но лошата бионаличност на куркумин ограничава приложението му (Karthikeyan et al., 2020). За да се реши този проблем, J147 е разработен като мощно съединение на производно на куркумин с по-голяма стабилност и бионаличност (Li et al., 2020). J147 има невропротективен ефект и в момента е във фаза I на клинични изпитвания за болестта на Алцхаймер. Все още обаче няма доклад за ефектите на J147 върху пигментацията in vitro и in vivo.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Реактиви

J147 (J302241), -MSH (M118985) и тирозиназа от гъби (T128536) са получени от Aladdin (Шанхай, Китай). Получихме антитела срещу Myosin Va (sc-365986), KIF5b (sc-133184), GP100 (sc-393094), Cdc42 (sc-8401), Rab27a (sc{{ 13}}), p-JNK (sc-6254), JNK (sc-7345), p-p38 MAPK (sc-166182) и p38 MAPK (sc-398546) от Санта Круз (Калифорния, САЩ). Антителата срещу MITF (97800), p-MEK (2338), MEK (4694), p-ERK (4370) и ERK (4695) бяха получени от Cell Signaling Technology (MA, USA). Антителата срещу тирозиназа (ab180753), TRP-1 (ab235447), TRP-2 (ab221144), цитокератин (ab7753) и S100 (ab133519) са получени от Abcam (Cambridge, UK). p38 инхибитор SB203580 (S1863), ERK инхибитор PD98059 (S1805), комплект за анализ на BCA протеин (P0012), буфер за клетъчен лизис (P0013) и -актин (AF5001) бяха получени от Beyotime (Шанхай, Китай). RT-qPCR комплекти (RR036A) са закупени от Takara Biomedical Technology (Пекин, Китай).

Клетъчна култура

МТТ анализ

Клетъчната жизнеспособност беше изследвана чрез МТТ анализ (Yun et al., 2020). Накратко, клетките се посяват в 96-плаки с ямки и се третират с J147 (1–8 μM) в продължение на 48 часа. След това клетките се промиват с PBS и се заменят с МТТ разтвор (20 μL). След инкубиране за още 4 часа, супернатантният разтвор се отстранява и към всяка ямка се добавя DMSO (200 μL). Накрая се определя оптичната абсорбция при 570 nm.

Измерване на съдържанието на меланин

Клетки с плътност от 2 × 105 клетки/mL се посяват в 6-плаки за култура с ямки. След 24 часа инкубация, клетките се култивират с различни дози J147 (1, 2, 4 μM) и със или без -MSH (60 nM) стимулация. След 48-часово третиране клетките се събират и общият меланин в клетъчната пелета се разтваря в 100 μL работен разтвор на NaOH (1 mol/L, 10 процента DMSO) при 80 градуса С за 1 час и абсорбцията се измерва при 405 nm (Lv et al., 2015; Lv et al., 2019).

Анализ на тирозиназната активност

Активността на клетъчната тирозиназа беше изследвана, както е описано по-рано (Liao et al., 2017; Lv et al., 2020a). Накратко, клетките се лизират с буфер за клетъчен лизис след трикратно промиване и след това супернатантата за анализ на тирозиназната активност се получава чрез центрофугиране на лизатите. 100 μL PBS (0,1 М, pH 6,5), съдържащ 10 ug протеини, смесени със 100 μL 0,1 процента L-DOPA. Плаката се инкубира при 37 градуса за 1 час и след това се наблюдава оптичната абсорбция при 475 nm.

Директният ефект на J147 върху активността на тирозиназата беше тестван от безклетъчна система, както е описано по-горе (Lv et al., 2020a). Накратко, реакцията за определяне на активността на гъбена тирозиназа се провежда в 96-плака с ямки и реакционната смес съдържа гъбена тирозиназа (10 единици), L-тирозин (0,03 процента, 50 μL) и 100 μL PBS (0.1 М, рН 6.5) добавяне с различни концентрации на J147. След инкубиране при 37 градуса за 10 минути, абсорбцията при 475 nm се измерва с помощта на спектрофотометър за микроплака.

Сребърно оцветяване с амоняк на Masson–Fontana

За откриване на меланинов пигмент парчетата кожа и меланоцитите се фиксират във формалин и се оцветяват, следвайки стандартния протокол (Gu et al., 2018; Lv et al., 2020b). Накратко, слайдовете се промиват 3 пъти с дейонизирана вода и след това се инкубират в разтвор на амонячно сребро при стайна температура в продължение на 12 часа. След добре изплакване в дейонизирана вода, предметните стъкла се инкубират в хипоразтвор за 5 минути. След това предметните стъкла се изплакват отново и се оцветяват с неутрално червено петно ​​за още 5 минути. Накрая, след щателно изплакване, слайдовете се наблюдават под микроскоп Nikon-Eclipse-Ti.

Имунофлуоресценция за меланозомен трансфер

Системата за кокултивиране на B16F10 и HaCaT клетки е установена върху конфокалната чиния, както е описано по-рано (Lee et al., 2015; Lv et al., 2020c). След третирането с J147, клетките бяха имунооцветени с анти-GP100 и анти-цитокератин съгласно стандартния протокол. Изображенията са взети от микроскоп Nikon-Eclipse-Ti.

Имунохистохимия за S-100

Имунохистохимията за S-100 се извършва, както е описано по-горе (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Кратко описание беше както следва: предметните стъкла бяха блокирани с 5 процента BSA при 25 градуса С за 1 час и след това бяха инкубирани с анти-S-100 първично антитяло при 4 градуса С за една нощ. На следващия ден слайдовете се промиват 3 пъти с TBST разтвор и се инкубират с вторичното антитяло. След това предметните стъкла се третират с аминоетилкарбазол, за да се развият срезовете и се наблюдават под микроскоп.

Обратна транскрипция – PCR

Общата клетъчна РНК се екстрахира с TRIzol реагент и се определя количествено спектрофотометрично. След това беше използвана обратна транскриптаза SuperScript II за синтезиране на едноверижнаcDNA, следвайки инструкциите за производство.Олигонуклеотидните праймери са закупени от GenScript(Нанкин, Китай). Последователностите наMITFгенните праймери са 5′- AGAGCAGGGCAGAGAGTGAGTGG -3′, 5′-AACTTGATTCCAGGCTGATGATGTC -3′. Последователностите наGAPDHгенгрундовете са 5′- AGGTCGGTGAACGGATTTG-3′, 5′- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3′. PCR продукти бяхаразделени чрез електрофореза върху 1% агарозни гелове и откритипод ултравиолетова светлина (Лий и др., 2013 г).

Western blotting

Протеините (40 ug) се разделят чрез SDS-PAGE гелове и се прехвърлят към нитроцелулозен филтър (NC) мембрани чрез електрофоретична трансферна система (Bio-Rad). NC мембраните се блокират с 3% BSA в TBST разтвор при стайна температура в продължение на 1, 5 часа. След това мембраните се инкубират с първични антитела при 4 градуса за една нощ. На следващия ден блотовете се промиват 3 пъти с разтвор на TBST и след това се инкубират с пероксидаза-конюгирани вторични антитела при 25 градуса за 1 час и се визуализират чрез използване на подобрена хемилуминесценция (Lv et al., 2020d).

Определяне на съдържанието на меланин в модел на рибка зебра

Накратко, синхронизираните ембриони бяха събрани и подредени с пипета (три до четири ембриона на ямка с 200 μL ембрионална среда в 96-плаки с ямки). След това J147 и PTU се разтварят в 0,1 процента DMSO и се добавят към ембрионалната среда от 35 до 60 часа (25 часа експозиция). Влиянието на J147 върху меланогенезата на рибките зебра се наблюдава под стереомикроскоп (Zheng J. et al., 2018).

Оценка на базата на фенотип и UVB-индуцирана хиперпигментация Модел на морско свинче

8 кафяви морски свинчета (6 седмици, приблизително 250–300 g) бяха закупени от Института по лабораторни животновъдни науки (Пекин, Китай). Тези морски свинчета бяха държани сами в стая с постоянна температура и влажност при 12--часов цикъл светлина/тъмнина. Отделните зони (1 cm диаметърен кръг) на гърба на всяко животно бяха изложени на 500 mJ/cm2 UVB (Sigma SH-4, Шанхай, Китай) веднъж на ден в продължение на 1 седмица, за да се установи моделът на хиперпигментация. След това носителят (PEG400/EtOH=7:3) и J147 (1 процент) се дават на хиперпигментираните зони (20 μL разтвор на кръг) два пъти на ден в продължение на 3 седмици. Степента на пигментация беше оценена чрез изчисляване на ΔL-стойността според L-стойността, измерена от спектрофотометъра (YS3010, 3nh, Шенжен, Китай), както следва: ΔL=L (при всеки измерен ден)-L (на ден 0) (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Всички процедури с животни в това проучване са одобрени от комитета за грижа и използване на животните на университета Чанжу.

Статистически анализ

РЕЗУЛТАТИ

J147 Намалена меланогенеза и броя на дендритите в клетките B16F10

Структурата на J147 е показана на фигура 1A. Първо, беше проведен експеримент за клетъчна жизнеспособност, за да се изследва дали J147 е цитотоксичен за B16F10 клетки. Както е показано на фигура 1B, не са наблюдавани цитотоксични ефекти на J147 при диапазон на дозиране от 1–8 μM след 48 часа. След това изследвахме влиянието на J147 върху синтеза на меланин. Както е показано на фигура 1C, J147 инхибира основния синтез на меланин. -MSH значително насърчава меланогенезата в меланоцитите. Увеличаването на меланогенезата, индуцирана от -MSH, беше обърнато след лечение с J147. Последователно оцветяването с амонячно сребро на Masson–Fontana показва, че J147 забележително намалява съдържанието на меланин в B16F10 клетки с или без -MSH (Фигура 1D). В допълнение, броят и дължината на дендритите и концентрацията на меланин в дендритите също бяха намалени в сравнение с нетретираните клетки (Фигура 1D). Резултатите предполагат, че J147 намалява меланогенезата и образуването на дендрити без цитотоксични ефекти.

J147 Инхибира активността на клетъчната тирозиназа и експресията на тирозиназа, TRP-1, TRP-2

Семейството протеини тирозиназа (тирозиназа, TRP-1 и TRP-2) участва в меланогенезата. Сред тях тирозиназите са ключови ензими, регулиращи биосинтетичния път на меланин (D'Mello et al., 2016). За да определим дали J147 влияе върху активността на тирозиназата, първо използвахме метода на окисление на L-DOPA, за да определим ефектите на J147 върху активността на клетъчната тирозиназа. Показано е, че J147 (1–4 μM) проявява дълбоки инхибиторни ефекти върху активността на клетъчната тирозиназа по дозозависим начин в B16F10 клетки (Фигура 2А). След това беше извършен анализ на активността на гъбна тирозиназа, за да се определят преките ефекти на J147 върху активността на тирозиназата. Както е показано на Фигура 2В, не са наблюдавани инхибиторни ефекти, което показва, че J147 не повлиява ензимните активности на гъбната тирозиназа (Фигура 2В). Както знаем, меланогенезата се контролира от активността и количествата на тези тирозинази. За да се изследва дали антимеланогенните ефекти на J147 са свързани с експресията на тирозиназа, беше проведен Western blot анализ. Както е показано на Фигура 2C, нивата на експресия на тирозиназа бяха значително намалени след лечение с J147 с или без -MSH и същите резултати бяха наблюдавани в експресията на TRP-1 и TRP-2. Тези наблюдения показват, че J147 инхибира активността на клетъчната тирозиназа и меланогенезата чрез намаляване на нивата на експресия на тирозиназа, TRP-1 и TRP-2.

J147 Инхибира меланозомен транспорт чрез регулиране на експресията на миозин Va, Rab27a и Cdc42

Пигментацията на човешката кожа се определя от синтеза на меланин, както и от разпределението на меланина. В меланоцитите на бозайниците меланинът се произвежда главно в клетъчното тяло имигрира по актинови нишкии микротубули до дендрити и накраякъм съседните кератиноцити, за да завърширазпределениетопроцес (Обаяши и Фукуда, 2012 г). Както е показано вФигура 1D, J147 значително намалява образуването на дендрити.Освен това концентрацията на меланин в дендритите също е биланамалява, тъй като пигментът меланин е агрегиран в перинуклеарниярегиони. След това култивирахме B16F10 и HaCaT клетки, за дапроучете дали J147 влияемеланозомен трансфер къмкератиноцити чрез конфокална микроскопия. Разпределението намеланинът се наблюдава в HaCaT клетките в съвместната културамодел (Фигура 3А). За разлика от това, докато моделът на съвместната култура бешетретирани с J147 в продължение на 48 часа, меланозомните гранулирани сигнали вHaCaT клетките бяха значителнонамален (Фигура 3А).

За по-нататъшно изясняване на основния механизъм на ефектите на инхибиране на трансфера на меланозома от J147, ние изследвахме няколко решаващи фактора, участващи в транспорта на меланозома. KIF5b медиира транспорта на меланозома навън по микротубулите, а комплексът Rab27a меланофилин-миозин Va допринася за транспорта на меланозома по протежение на актинови филаменти в меланоцитите (Reiner et al., 2020). В допълнение, Cdc42 стимулира образуването на дендрити в меланоцитите, което също играе съществена роля в меланозомния транспорт. Както е показано на Фигура 3B, експресията на Cdc42, Myosin Va и Rab27a, но не и KIF5b, е значително намалена след лечение с J147 в състояние със или без -MSH. Нашите открития показват, че J147 инхибира транспорта на меланозома чрез намаляване на експресията на миозин Va, Rab27a и Cdc42.

J147 Ускорено разграждане на MITF

MITF е един от ключовите регулатори за меланогенезата и контролира генната транскрипция на тирозиназа, TRP-1, TRP-2, Cdc42 и Rab27a (Noguchi et al., 2016; Kim et al., 2019 ). Първо изследвахме влиянието на J147 върху транскриптите на MITF. Както е показано на Фигура 4А, -MSH забележително повишава транскрипцията на MITF, но не се наблюдава промяна след лечение с J147, което показва, че J147 не понижава MITF експресията. След това проверихме дали J147 влияе върху превода на MITF. Както е показано на Фигура 4В, след лечение с -MSH, нивата на MITF протеин се повишават, достигат пик на 4 часа и започват да намаляват на 8 часа (Фигура 4В). Различно, протеиновите нива на MITF не намаляват на 4 часа след лечението с J147, но на 8 часа нивата на MITF протеин бързо намаляват до неоткриваеми нива, което показва, че J147 не влияе на транслацията на MITF, но значително ускорява разграждането на MITF протеина.

J147 Потисната меланогенеза чрез сигналния път MEK/ERK

Митоген-активирани протеин кинази (MAPK) сигнализиращ път, включително извънклетъчен сигнал-регулирана протеин киназа (ERK), p38 и c-jun N-терминална киназа (JNK), играят решаваща роля в пигментацията (Lee et al., 2013). Известно е, че ERK фосфорилирането улеснява разграждането на MITF и в крайна сметка разсейва меланогенните стимули, което представлява основен механизъм за отрицателна обратна връзка (Kwon et al., 2017). Въпреки това, функцията на p38 и JNK пътя остава спорна. Следователно, ние изследвахме ефекта на J147 върху сигналните пътища на MAPK. Както е показано на Фигура 5А, J147 активира MEK/ERK и p38, докато не е открито влияние във фосфорилирането на JNK сигналния път.

За повече информация: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501