Пътят към прогреса на предклиничните проучвания на невродегенеративните заболявания, свързани с възрастта: гледна точка върху моделите на гризачи и HiPSC, част 3

Подобни вирусни векторни подходи са оценени в различни модели на PD, като най-ранните предавания използват AAV2/2 или LVs.123-126 Тези вектори, инжектирани в мозъци на възрастни плъхове, са използвани за доставяне на WT, A30P или A53T мутанти на човешки a-syn за заболяване индукция.

Връзката между вирусите и паметта може да изглежда негативна за много хора, тъй като вирусите често причиняват физически дискомфорт и заболяване. Въпреки това, вирусите също могат да имат положителен ефект върху подобряването на паметта, главно защото вирусните атаки могат да стимулират активността на имунната система.

Проучванията показват, че вирусните атаки могат да накарат имунната система на тялото да реагира, като по този начин подобри устойчивостта на организма към вируси. Този отговор на имунната система включва увеличаване на броя на произведените бели кръвни клетки и други имунни клетки, както и производството на антитела. Тези реакции не само помагат на тялото да устои на вирусната инвазия, но също така помагат за укрепване на функцията на имунната система и подобряване на цялостното здраве на тялото.

Вирусните атаки активират и имунните клетки в мозъка. Тези имунни клетки могат да премахнат отпадъците и повредените клетки от мозъка, да подобрят функцията на нервната система и да насърчат предаването на информация и обработката на паметта. Проучванията показват също, че хората с определени вирусни инфекции могат да се представят по-добре, когато се справят със задачи за паметта.

В допълнение, някои проучвания са установили, че някои вируси могат да стимулират тялото да произвежда мозъчен невротрофичен фактор (BDNF), вещество, което насърчава растежа и развитието на невроните. Това вещество има положителен ефект върху мозъчната функция и може да насърчи физическото възстановяване и подобряване на паметта.

Разбира се, в битката с вируса трябва да възприемем правилния подход и стратегия, да поддържаме добри хигиенни навици, да спим достатъчно и да се движим, за да бъде имунната ни система в най-добро състояние. Накратко, въпреки че вирусът може да ни причини физически дискомфорт, има все повече доказателства, че той може също да стимулира дейността на имунната система и да има положително въздействие върху нашето здраве и памет. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си и Cistanche може значително да подобри нашата памет, тъй като Cistanche може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори, които са много важни за паметта и ученето. В допълнение, Cistanche може също така да подобри притока на кръв и да насърчи доставянето на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно храна и енергия, като по този начин подобрява жизнеността и издръжливостта на мозъка.

Щракнете върху познайте добавките за подобряване на паметта

Авторите демонстрират ефективна експресия на a-syn в нигрални DA неврони, придружени от молекулярни и клетъчни патологии и дегенерация на нигралДА, които се развиват постепенно с течение на времето.

Независимо от това, първото поколение rAAV2/2 вектори, използвани в тези проучвания, показва прогресивна загуба на неврони, въпреки че невродегенерацията на положителните за тирозин-хидроксилаза неврони, както и времевият курс, е доста променлив (25%–80% и 6 седмици до 1 година , съответно).123,124

Обратно, LVs, кодиращи WT-, A30P- или A53T-мутиран a-syn, са способни да индуцират загуба на невронни клетки при плъхове по-забавен и по-последователен начин (съответно 25%–40% и 5 месеца).126 И двете проучвания демонстрират прогресивна загуба на дължина на неврит и подута перикария в останалите DA неврони.

Освен това, масивни цитоплазмени натрупвания на a-syn бяха открити както в клетъчните тела, така и в невритите. Тези резултати са възпроизведени наскоро в множество проучвания, които са използвали и двете вирусни платформи.127–131

LVs също са били използвани в различни мишки PD модели. Например, Lauwers и колеги125 показаха, че инжектирането на LV, носещ WT или A30P мутант на a-syn в стриатума, амигдалата или SNof мишки, е способно да индуцира невродегенеративни промени, свързани с PD по зависим от времето начин и включва a-независимо невритно разширяване и цитоплазмени включвания.

Освен това, това проучване демонстрира, че нигралната свръхекспресия на A30P-a-syn води до около 25% загуба на клетки на 10-12 месеца.125 Доставянето на A30P, E57K и E35K до SN на плъх, използвайки LV, демонстрира подобна степен в DA неврон загуба (около 50%) в сравнение с WT (30%), докато по-бързо образуващият фибрил мутант A53T, използван в същото проучване, не показва значително намаляване на броя на DA клетките.

Интересното е, че общите невропатологични характеристики, наблюдавани при мишки (т.е. начало и тежест), изглеждат по-малко тежки в сравнение с плъховете, въпреки че тези разлики може да са артефакт на вирусна чистота или производствени титри на инжектирания вирус и/или други свързани технически несъответствия.

Важни съображения за AD и PD вирусни векторни модели

Разработването на нови серотипове, включително AAV2/1, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8, AAVrh10, DJ и DJ8, разшири клетъчните цели и подобри ефективността на AAV трансдукция.

AAVs, серотипирани с тези нови капсиди, са тествани при плъхове и нечовекоподобни примати за свръхекспресия на a-syn.132-137 Свръхекспресията на S129Aform, доставена чрез AAV2/5 и AAV2/6, постоянно показва повишена токсичност в процеса на невродегенерация.134,138

Тези експерименти също демонстрират, че внимателното дозиране на свръхекспресиращия трансген е от решаващо значение, тъй като дори контролни вектори, носещи само флуоресцентни репортери, доставени при високи титри, могат да демонстрират неспецифични токсични ефекти.135

Това предупреждение трябва да се вземе под внимание, когато се проектират спасителни експерименти, базирани на AAV. Например, доказано е, че терапевтичният AAV, съдържащ малка интерферираща РНК (siRNA), насочена към SNCA, води до високо ниво на токсичност и причинява значителна загуба на нигростриатални DA неврони. Това проучване допълнително подчертава ограниченията на приложенията на AAV в изследванията върху животни.

Въпреки това, не може да се изключи, че невротоксичността е била причинена от силното намаляване на нивата на SNCA в модели на плъхове, asa-syn играе решаваща биохимична роля в DA невроните и неговата стабилна редукция може да намали клетъчната жизнеспособност.139 Взети заедно, това подчертава важността на разработване на инструмент за фина настройка на експресията на гени, свързани със заболяването, за проектиране на подходи за генна терапия.

В това отношение по-новата система, базирана на CRISPR-dCas9-, може да представлява по-изгодна система за модулиране на генната експресия по прецизен и фино настроен начин.

По тази линия наскоро разработихме системата LV-CRISPR-Cas9, за да постигнем прецизна и фино настроена регулация на експресията на SNCA ген. Проучването предостави доказателство за концепцията, че манипулирането на генната експресия (напр. обръщане на свръхекспресията) чрез редактиране на епигенома е ценна терапевтична стратегия за неврологични разстройства, като PD,140 причинени от генна дисрегулация.

Като такива, вирусните векторни PD модели, използващи LV и AAV за свръхекспресия на a-syn протеин, показват PD патология, свързана с DA невродегенерация, и използването на нови AAV серотипове подобрява a-syn експресията в DA неврони в сравнение с AAV2/2.

Като цяло, както AAVs, така и LVs са способни да индуцират трансгенна експресия и демонстрират високо ниво на тропизъм за DA неврони, което води до подобни нива на невродегенерация. Ще е необходимо по-нататъшно подобряване на тези вирусни системи, за да се заобиколи бавното прогресиране на клетъчните PD фенотипове и относително ниски нива на поведенчески увреждания.

In Vitro модели на клетъчни култури Преглед на текущите In Vitro AD и PD модели: Ограничения и възможности

През последните четири десетилетия бяха разработени различни модели на AD и PD in vitro, за да се изследват взаимодействията между ключови аспекти на тяхната относителна патофизиология на заболяването и впоследствие използвани за предклиничен терапевтичен скрининг.

Настоящите AD и PD in vitro модели основно целят рекапитулация на молекулярни и клетъчни отличителни белези на заболяване, като митохондриална дисфункция, оксидативен стрес, клетъчно оцеляване и наличието на вътреклетъчни и/или извънклетъчни протеинови агрегати. Например, най-известните и широко използвани клетъчни модели на AD са базирани на индукция на Ab40 42 агрегати или тау хиперфосфорилиране и агрегация 141, 142 (Таблица 1).

По подобен начин in vitro моделите на PD се основават на гореспоменатата токсин-индуцирана митохондриална дисфункция (напр. MPTP, ротенон, паракват, 6-OHDA) и нарушена протеостаза (напр. тапсигаргин, йономицин, туникомицин), свръхекспресия на a-syn и експресия на мутиралите фамилни гени на PD (напр. a-syn, Parkin, PINK1)92 (Таблица 2).

Въпреки че тези модели на клетъчни култури са били безценни за напредъка в разбирането ни за подходящата невробиология, те все още не са довели до жизнеспособни DMT, насочени към превенция, забавено начало или забавено прогресиране на заболяването, поставяйки под въпрос тяхната уместност и транслационна валидност.

Важно е да се признаят няколко ясни ограничения в тези модели, за да се подобрят текущите предклинични практики.

Например, модели, базирани на свръхекспресия и нокаут/намаляване на съответните гени, свързани със заболяването, са известни с променливи количествени промени в нивата на протеини и методите, използвани за предизвикване на промени в генната експресия (т.е. вирусно-медиирана, базирана на размножаване, конститутивна или преходна експресия) което може да доведе до противоречиви данни и изводи.92

Тази липса на последователност при извличане на фенотипове, свързани със заболяването, въвежда предупреждение към предклиничните проучвания, използващи тези модели за тестване на потенциални DMT. Освен това, вариабилността в клетъчните фенотипове и методологията, наблюдавана в предклинични модели на NDD (напр. кратна промяна на свръхекспресия или нокдаун на протеин) силно предполага по-голяма генетична хетерогенност, която не може да бъде напълно проучена в настоящите клетъчни модели.

Това допълнително се усложнява от разпространението на клетъчни модели, базирани на генетични варианти, идентифицирани в семейни кохорти, въпреки че фамилните варианти представляват малка част от общите случаи на NDD.109,143

Поради разкритите генетични причини, остава трудно да се представят точно спорадични кохорти на NDD или подтипове на заболяване с неменделска генетика в предклинични модели, създавайки значителна бариера при изясняване на съответните механизми на заболяването, идентифициране на потенциални терапевтични цели и разработване на лекарства.

Предвид тези предизвикателства, изследователите са били принудени да оценят тези модели, за да идентифицират областите на подобрение и да оценят възможностите, предоставени с новите техники за клетъчни култури.

През последните години ние надградихме тези модели, като включихме нова технология за редактиране на гени и оценихме важни асоциации на генетични заболявания, получени в GWASs в подобрени модели на тъканни култури.144,145

Увеличеното включване на технологията hiPSC представлява сериозна прогресия в областта на NDD in vitro моделиране и предоставя недостъпни досега възможности за използване на релевантни за заболяването клетъчни типове, получени от пациенти, за изследване на патогенезата на заболяването в контекста на човешкия геном.

Пълният спектър от предимства и ограничения на получените от hiPSC NDD модели, особено тези за AD и PD, са изследвани изцяло в следващия раздел.

Произведени от hiPSC модели на NDD: гъвкави и генетично „верни“

Съвременният напредък в технологията за клетъчни култури представлява един от най-вълнуващите пробиви в изследването на NDDs, предоставяйки възможности за подобрено моделиране на заболявания, скрининг на лекарства и персонализирана медицина.

Доскоро постморталното изследване на мозъка се смяташе за златен стандарт, основан на човешки биологичен материал за получаване на представа за патологичните процеси на човешките невродегенеративни състояния.

Съвременните технологии за стволови клетки обаче, включително анализ на специфични за пациента неврони и глиални клетки, откриха нови пътища за изследване на патологичните механизми на NDDs и все повече се използват в молекулярната дисекция на NDDs с повишена генетична сложност, като AD и PD.

Чрез проста, неинвазивна биопсия на проби от кожа на пациенти, в допълнение към разнообразието от алтернативни биологични проби, генерирането на hiPSC позволява на изследователите да разкрият молекулярни пътища и механизми на заболяването, които са в основата на NDD, по начин, който е невъзможен с предишни методи за клетъчна култура.

Понастоящем най-разпространените донорни клетки са фибробластите, които се използват в над 80% от всички публикувани експерименти за препрограмиране;146 обаче hiPSC могат да бъдат получени от различни източници, включително стволови клетки от ембрионална връв, кръв от пъпна връв, епителни клетки на роговицата, и кръвни клетки, като мононуклеарни клетки на периферната кръв147-149 (Фигура 1).

Следователно, получените от hiPSC модели представляват многостранна алтернатива на съществуващите модели на клетъчни заболявания и са получени от соматични тъкани на пациенти, които са принудени да постигнат плурипотентност чрез използване на различни инструменти за препрограмиране, като плазмиди, вектори (напр. епизомални) и вирусна трансдукция (напр. , аденовирус, вирус Sendai, лентивирус; тези методи са подробно прегледани в Brouweret al.150 и Malik и Rao151).

Тези клетки се самообновяват и предлагат алтернатива на ембрионалните стволови клетки (ESC), които са придружени от етични съображения и социални проблеми. Понастоящем има няколко hiPSC хранилища, които събират и разпространяват hiPSC линии, получени от пациенти с NDDs и контроли, съответстващи на възрастта на здравето, за да централизират пробите и да ги направят лесно достъпни за изследователите (Таблица S2).

Едно от основните приложения на hiPSCs е диференциацията в специфични клетъчни типове, които впоследствие са били използвани в различни биологични контексти, включително изследвания на неврологичното развитие152 и невродегенерация,144 ex vivo трансплантация,153,154 моделиране на заболяване, целево валидиране и откриване на лекарства.155

Към днешна дата са разработени няколко протокола за клетъчна диференциация, които генерират не само генерични неврони, но и специфични популации от тип невронни клетки, включително възбуждащи, холинергични, DAs и инхибиторни GABAergic неврони.156-158 Различни специфични глиални субпопулационни клетки също са получени от hiPSCs, включително астроцити,159–161олигодендроцити,162,163 и микроглия.164–166

Няколко нови техники за редактиране на гени, включително CRISPR-Cas9, нуклеази с цинков пръст (ZFN) и ефекторни нуклеази, подобни на активатор на транскрипция (TALENS), въведоха допълнително измерение в системата, получена от hiPSC - създаването на изогенни модели, които притежават същата генетична основа и се различават само по избраната мутация.167

Разнообразието от протоколи за клетъчна диференциация улесни механистичните изследвания, а наличието на изогенни линии подкрепи генетичните анализи на функцията на гена и неговата патогенна роля в NDDs. Моделите, получени от hiPSC, са подходящи за тези изследвания, тъй като те показват ключови характеристики, свързани със заболяването.

Например, извлечени от fAD и sAD hiPSC невронни модели, носещи PS1 и PS2 мутации (съответно A246E и N14II)168 и мутация на дублиране на АРР169, показват важни биохимични характеристики на AD, включително секреция на Ab, повишено съотношение Ab42:Ab40 и повишен хиперфосфорилиран тау.

Важно е да се отбележи, че използването на hiPSC модели, които генерират фенотипове, свързани с Ab, представлява по-точно средство за изследване на ролята на експресията на Ab в невродегенерацията на AD в сравнение с традиционните модели на ектопична експресия или модели, които изискват допълване и/или индукция на агрегати на Ab, като те приемат "естествените" патологични процеси, свързани с отлаганията на Ab.

For more information:1950477648nn@gmail.com