Терапевтичен ефект на цистанозид А върху костния метаболизъм на овариектомирани мишки

1. Въведение

Остеопорозата, системен скелетен „тих убиец“, се превърна в основна опасност за здравето, засягаща над 2000 милиона души по света през последните години. Характеризира се с ниска плътност на костната маса (BMD) и влошаване на микроархитектурата, които произтичат от прекомерна костна резорбция спрямо образуването на кост и накрая водят до остеопоротична фрактура. В наши дни идентифицирането на средства за блокиране на диференциацията и резорбцията на остеокластите е общата и успешна стратегия за разработване на терапевтични лекарства за остеопорозаи наистина има много синтетични агенти, включително естрадиол валерат и натриев алендронат, които биха моглипредотвратяване и лечение на остеопороза. Въпреки това, лекарствата за болестите далеч не са идеални; някои от тези лекарства могат да увеличат риска от рак на ендометриума и гърдата и също така да имат известна степен на странични ефекти, като хиперкалциемия, хиперкалциурия и др., които ограничават клиничните им приложения. Ето защо, в продължение на повече от хилядолетие, традиционните китайски лекарства (TCM), особено ядливите TCM с изолирани биоактивни съединения и фракции, са широко използвани безопасно и ефективно в азиатските страни за предотвратяване и лечение на различни заболявания, включително остеопороза. 

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ЛЕЧЕНИЕ И ПРОФИЛАКТИКА НА ОСТЕОПОРОЗА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Остеопорозата се характеризира като повишена костна резорбция, дължаща се на повишена остеокластогенеза, и този процес включва ангажирането на хематопоетичните моноцити в прекурсори на остеокластите, които се сливат, за да образуват многоядрени остеокласти, които са насочени към местата на костта, подложени на ремоделиране [4]. Рецепторен активатор за ядрен фактор-κB лиганд (RANKL), ключов фактор, който се секретира от остеобластите, стимулира диференциацията на моноцитите в остеокласти [8,9]. Взаимодействието на RANKL с неговия рецептор RANK води до каскада от вътреклетъчни събития, включително NF-κB, PI3K/Akt и калций/калмодулин-зависима киназа чрез набиране на адапторния сигнален протеин TNF рецептор-асоцииран фактор (TRAF6). В резултат на това няколко свързани с остеокластите маркерни гени, включително TRAP, катепсин К и DPD, се регулират нагоре и процесът на костна резорбция се ускорява.

Фенилетаноидните гликозиди се характеризират с канелена киселина и хидроксил фенил етил части, които са прикрепени към -глюкопираноза (апиоза, галактоза, рамноза, ксилоза и др.) чрез гликозидна връзка, които са широко разпространени в лечебните растения [10]. Цистанозид А (Cis A) е активенфенилетаноиден гликозидв Cistanche deserticola YC Ma. Според записите на китайската фармакопея, C. deserticola традиционно се използва за лечение на бъбречен ин дефицит, мускулна слабост, лумбална слабост и т.н., а фенилетаноидните гликозиди са основните биоактивни съставки в тази билка [11]. Въз основа на теорията за „бъбрека“ на ТКМ, бъбрекът може да управлява костната система, което означава, че развитието и функциите на костите зависят от същността на бъбрека и тази същност на бъбрека може да се трансформира в костен мозък, за да подхранва костите, насърчават растежа и възстановяването на скелета и укрепват скелета [12]. Тъй като C. deserticola може да укрепи бъбреците, ние предположихме, че Cis A може да предотврати и лекува остеопороза. Следователно настоящото проучване е предназначено да потвърди потенциала наCis A за предотвратяване на остеопорозачрез използване на модел на мишка с овариектомия и маркери за образуване на кост и резорбция, както и свързаните потенциални механизми бяха определени за оценка на антиостеопорозната биоактивност на този агент.

2. Резултати и дискусия

2.1. Резултати

2.1.1. Ефекти на Cis A върху теста за триточково огъване на костта

За да анализираме дали лечението с Cis A прави костта по-здрава, ние подложихме бедрените кости на теста за триточково огъване. Както е показано на фигура 1, максималното натоварване, приложено при счупване на костта, е 21,5% и 22.0% по-високо при животните, третирани с 20 mg/kg и 80 mg/ kg Cis A, съответно, в сравнение с животни в групата с овариектомия (OVX) (p < 0.05). Междувременно, лечението с Cis A също повишава сковаността на костите; всички мишки, третирани с Cis A, показват значително повишена скованост с данни съответно от 121.0 ± 12,1 (p <0,05), 124,1 ± 16,2 (p <0,05) и 127,7 ± 9,6 (p <0,01), в сравнение със 102,2 ± 10,7 от OVX мишките. Резултатите показват, че повишената здравина на костите при OVX мишките, третирани с Cis A, се дължи на увеличено количество кост и подобряване на качеството на костите.

2.1.2. Ефекти на Cis A върху костната микроархитектура

Триизмерната трабекуларна костна микроархитектура на мишки, измерена чрез микро-CT (Фигура 2 и Таблица 1), интуитивно показва, че мишките в групата OVX са показали значително намаление на трабекуларната площ и трабекуларния брой в сравнение с фиктивната група, което показва, че овариектомията може да предизвика значително намаляване на плътността на костната маса (BMD, -46%), костното минерално съдържание (BMC, -66%), тъканното минерално съдържание (TMC, -85%), костната обемна фракция (BVF, -82%), трабекуларен брой (Tb. N, -76%) и увеличение на трабекуларното разделяне (Tb. Sp, +80%) без никаква промяна в общата тъканна минерална плътност (TMD) и трабекуларната дебелина (Tb. Th) след операция от 12 седмици. Въпреки това, OVX мишките, третирани с Cis A, доведоха до дозозависимо повишена BMD (+43%~57%), BMC (+65%~73%), TMC (+83%~ 90%), BVF (+80%~88%), по-голямо намаляване на Tb. Sp (-79%~88%) и допълнително подобрен Tb. N (+73%~82%) в сравнение с групата на OVX. Изглежда, че TMD не се повлиява от овариектомията, но се увеличава значително от лечението с естрадиол валерат (EV).

2.1.3. Ефекти на Cis A върху маркерите за костно образуване и резорбция

Ефектите на Cis A върху маркерите за костна резорбция, включително TRAP, DPD, катепсин К индекс на костно образуване ALP и костен Gla-протеин (BGP), са показани на Фигура 3. След 12 седмици операция на овариектомия, активността на TRAP, DPD , и катепсин К в групата на OVX бяха значително увеличени, особено DPD, който се увеличи с близо 55,6%; TRAP и катепсин К бяха повишени съответно с 43,5% и 38,1% в сравнение с фиктивната група. Cis A, прилаган перорално в продължение на 12 седмици, демонстрира значителен потенциал за предотвратяване на всички горепосочени маркери за костна резорбция, особено високата доза (80 mg/kg), проявяваща значителен ефект върху потискането на активността на DPD с 45.0%, TRAP с 49.0% и катепсин К съответно с 44.0% (p < 0.01), в сравнение с OVX група (Фигура 3). Въпреки че в групата на OVX беше демонстрирана нарастваща тенденция на ALP и BGP активности, не бяха наблюдавани статистически значими промени. Въпреки това, значително подобрение в активността на ALP се наблюдава при групите, третирани с нисък и висок Cis A, в сравнение с фиктивната група (р <0,01).

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПРЕДОТВРАЩАВАНЕ НА ЗАБОЛЯВАНИЯ ОТ ОСТЕОПОРОЗА 75% ECH 30% ДЕЙСТВИЕ 12%

2.1.4. Ефекти на Cis A върху нивата на протеинова експресия на TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG и RANKL

Western blot анализът разкри, че в сравнение с фиктивната група, протеиновите нива на TRAF6, NF-κB и RANKL в групата OVX са значително повишени (p < 0.05), докато OPG, PI3K и Akt бяха значително намалени (Фигура 4). Cis A (20 mg/kg или 80 mg/kg) значително намалява експресията на TRAF6 (p <0,05), последвано от намаляване на експресията на RANKL и повишаване на OPG, което означава, че съотношението OPG/RANKL е регулирано нагоре. Следователно, сигналните каскади на NF-κB бяха регулирани надолу и PI3K/Akt бяха регулирани нагоре чрез лечение с Cis A (p <0.05).

2.2. Дискусия

Като се имат предвид ограниченията на настоящите терапевтични възможности за остеопороза, има нужда от алтернативи от храна или естествени ядливи лечебни растения. Като част от нашите продължаващи усилия да открием ефективни антиостеопоротични агенти от TCM, открихме серия от екстракти, фракции и съединения, които притежават ефекта на антиостеопоротични свойства [13,14]. Cistanche deserticola е важен класически TCM, за който е установено, че притежава благоприятен профил на безопасност [15] и широки медицински функции за лечение на бъбречна недостатъчност и др. [16]. Според теорията на TCM, TCM, които притежават ефекта на ободряване на бъбреците, обикновено саизползвани за лечение на остеопороза; фенилетаноидните гликозиди са основните биоактивни съставки в тази билка, което означава, чефенилетаноидни гликозидисъдържащ се в C. deserticola може да притежава антиостеопоротично свойство. Доказано е, че екстрактът от C. deserticola може значително да инхибира намаляването на BMD и да предотврати влошаването на трабекуларната микроархитектура, причинено от OVX [17]. В експеримента in vitro той също значително повишава ALP, костния морфогенетичен протеин -2 и остеопонтин иРНК, както и костната минерализация на култивираните остеобласти [18]. Ехинакозидът, основен биоактивен компонент в C. deserticola, официално записан в китайската фармакопея [11], проявява антиостеопорозна активност с висока доза от 30~270 mg/kg телесно тегло/ден [19], а допълнителни in vitro резултати показват, че може да насърчи костната регенерация чрез увеличаване на съотношението OPG/RANKL в MC3T3-E1 субклон 14 клетки [20]. Cis A е един от фенилетанол гликозидите, изолирани от C. deserticola, и няколко доклада разкриват, че това съединение притежава антиоксидантна активност [21] и противовъзпалителни свойства [22,23]. Наскоро публикувана статия откри, че Cis A проявява защитна активност както върху CCl4, така и върху индуцирана от алкохол хепатотоксичност при мишки, и също така показва защитно свойство върху индуцирано от етанол увреждане в първично култивирани миши хепатоцити in vitro [24]. В нашето настоящо проучване резултатите показват, че Cis A притежава антиостеопоротична активност при ниска доза (20~80 mg/kg телесно тегло/ден) чрез използване на модел на овариектомирана мишка и тази биоактивност се упражнява чрез понижаване на нивото на TRAF6, потискане на експресията на RANKL и NF-κB и стимулиране на OPG, PI3K и Akt, което означава, че терапевтичният ефект на Cis A при OVX мишки е чрез механизма на TRAF6-медиирано NF-kappaB инактивиране и PI3K/Akt активиране.

Добре известно е, че овариектомията може да причини остеопороза с очевидно намаляване на КМП, биомеханична здравина, качество на костите и микроархитектура на трабекуларната кост, а горните промени отчасти се дължат на дефицит на естроген [25]. Сега, в настоящия in vivo експеримент, нашето проучване демонстрира, че индуцираната от овариектомия остеопороза е довела до значително намаляване на биомеханичната сила и трабекуларните структурни параметри, включително BMD, BMC, TMC и Tb. N и увеличаване на Tb. Sp; и лечението с Cis A значително подобри механичните свойства на костта, включително максимално натоварване и твърдост, повиши BMD и подобри повечето от структурните параметри на трабекуларната микроархитектура на костта в сравнение с мишките в OVX групата, което показва, че Cis A е ефективен за подобряване на качеството на костите и трабекуларна микроархитектура в OVX мишки.

Освен общата BMD, триточковият тест за огъване и измерването на микроархитектурата на трабекуларната кост може директно да диагностицира остеопорозата, маркерите за образуване на кост, включително ALP и BGP, и индексът на костна резорбция, включително TRAP, DPD и катепсин К, също бяха използвани за изясняват свързаните антиостеопоротични механизми на Cis A. В нашето проучване активността на ALP при мишки от групата OVX демонстрира незначителна нарастваща тенденция, което показва повишена скорост на костен обмен [26,27] при постменопаузална остеопороза; високата (80 mg/kg телесно тегло/ден) и ниската (20 mg/kg телесно тегло/ден) дозировка на лечението с Cis A показаха значително подобрение на активността на ALP в сравнение с фиктивната група, докато активността на BGP не изглеждаше повлияна от овариектомия във всички лекувани групи; TRAP, DPD и катепсин К бяха значително повишени в групата на OVX, а приложението на Cis A значително намали и трите маркера за костна резорбция. Горните данни предполагат, че Cis A притежава потенциална антиостеопоротична активност и този ефект се упражнява от регулирането на костния метаболизъм, включително както потискане на костната резорбция, така и увеличаване на образуването на кост.

Координацията между остеобласта и остеокластите е критичен фактор за поддържането на целостта на скелета. Остеокластите, експресиращи TRAP, се прикрепят към повърхността на костта чрез образуването на свързани с актин уплътнителни зони, в които се освобождават протеолитични ензими, като катепсин К, което води до образуването на резорбционни ями. Модулирането на остеокластогенезата от незрели клетки от остеобластната линия се медиира от RANKL и OPG [28]. OPG е примамващ рецептор, който инхибира RANKL активирането на остеокластогенезата, като по този начин намалява костната резорбция. RANKL, който осигурява важен сигнал за прогениторите на остеокластите, е свързана с мембрана молекула от фамилията лиганди на фактора на туморната некроза, която насърчава образуването на остеокласти. Смята се, че съотношението на експресията на OPG/RANKL е ключов параметър на остеокластогенната активност, а сигналните каскади, активирани от RANKL, включват NF-κB и PI3K пътищата [29]. Значението на пътя на NF-кВ за остеокластогенезата се доказва от факта, че делецията на NF-кВ при мишки води до липса на зрели остеокласти [30]. TRAF6 е доказано като обещаваща цел за нови антиостеопорозни лекарства. Мишки с дефицит на TRAF6-, проявяващи дефектна остеокластогенеза и тежка остеопетроза, по този начин демонстрират значението на TRAF6 в костния метаболизъм. Появяващите се доказателства сочат критична регулаторна функция за TRAF6 в RANKL/RANK-медиирани сигнални каскади [4,31]. Данните от настоящото проучване показват, че лечението с Cis A на OVX мишки е довело до понижаване на нивата на експресия на TRAF6 протеин, намален RANKL и повишени OPG експресии, като по този начин предотвратява RANKL активирането на NF-κB надолу по веригата и активира PI3K/Akt сигналните пътища, което предполага, че Cis A инхибира диференциацията на остеокластите чрез TRAF6-медиирано NF-kappaB инактивиране и PI3K/Akt активиране и повишава съотношението OPG/RANKL, впоследствие инхибирайки остеокластогенезата и насърчавайки образуването на кост.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗААНТИОСТЕОПОРОТИЧНО ДЕЙСТВИЕPHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Материали и методи

3.1. Растителни материали, подготовка и определяне

Стръкове от Cistanche deserticolaYC Ma, идентифицирани от проф. Xue-yan Fu от Катедрата по фармация, Медицински университет Нинся, бяха събрани през септември 2015 в окръг Йонгнинг, провинция Нинся, Китай. Образец от ваучер (#20150901) е запазен в хербариума на аптечния отдел. Общо 30,0 kg изсушени на въздух стъбла на C. deserticola бяха екстрахирани с обратен хладник със 70% етанол (180 L, 3 × 2 часа) 3 пъти. Филтратите се комбинират и се подлагат на колона с макропореста смола (AB-8) със стъпаловидна градиентна система от разтворители за увеличаване на етанол във вода (0%, 20% и 60%, всеки 60 L), за да се получат три фракции, след което 60% от фракцията се пречиства допълнително чрез Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech Co., Uppsala, Швеция) и полупрепаративна високоефективна течна хроматография (Agilent 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Германия), за да се получи бледожълт цистанозид А 4.5 g (Cis A; добивът е 0.015%). Структурата беше изяснена главно чрез анализи на данни с NMR (Bruker Avance, 400 MHz, Германия) и MS спектри (Agilent 6540, Agilent Technologies), които бяха в съответствие с докладваните данни [19]. Неговата чистота се определя чрез метода за нормализиране на площта HPLC (Фигура 5). При експерименти с животни, въз основа на нашия предварителен експеримент, дозата на Cis A е 20–80 mg/kg/ден.

3.2. Химикали и разтворители

Използвани са следните: комплект за екстракция на общ протеин и комплекти за квантуване на протеин BCA (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, Nanjing, Китай), първични антитела на TRAF6, NF-κB, PI3K, Akt, RANKL, OPG, -актин и тубулин ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), вторични антитела на кози анти-заешки IgG, конюгирани с пероксидаза от хрян (ZSGB-BIO, Пекин, Китай), естрадиол валерат (1 mg, Delpharm Lille SAS, Париж, Франция), костен Gla -протеин и дезоксипиридинолин кръстосани връзки ELISA комплекти (Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Шанхай, Китай) и катепсин К ELISA комплект (Biovision, Mountain View, Калифорния, САЩ). Всички други използвани химикали и биохимични агенти са AR реактиви с аналитичен клас.

3.3. Експерименти с животни

Шестдесет женски мишки от щам Kunming, на възраст 8 седмици с телесно тегло 26.0 ± 1,62 g, бяха закупени от Медицинския университет в Нинся и 10 мишки бяха държани в една клетка със стандартна лабораторна диета и чешмяна вода при условия с контролиран въздух (24.0 ± 0,5 ◦C, 45%–50% влажност и 12 часа/12 часа цикъла светло-тъмно осветяване). След аклиматизация в продължение на 1 седмица, операцията беше извършена при асептични условия и всички мишки бяха анестезирани с хлоралхидрат (100 mg/kg, ip); мишките, които са подложени на хирургично излагане без отстраняване на яйчниците, са фиктивната група (n=10); останалите бяха подложени на двустранна овариектомия като OVX групите (n=50). Горните експерименти с животни са проведени съгласно ръководството за грижа и използване на лабораторни животни и са одобрени от Комитета по биоетика на Медицинския университет в Нинся.

След още {{0}}седмичен период на възстановяване, горните 50 OVX мишки бяха произволно и по равно разделени на 5 групи: третирани перорално с естрадиол валерат (1 mg/kg/ден) като положителна контрола (EV); с 20, 40 и 80 mg/kg/ден Cis A като групи с ниска, умерена и висока доза, съответно; с носител (0,5% карбоксиметилцелулоза()-Na) като моделна група (OVX). Всички мишки бяха приложени орално с еднакъв обем от 1 mL/100 g телесно тегло носител, EV или Cis A, което започна на втората седмица след операцията и продължи 12 седмици. Телесното тегло се измерва на две седмици, като дозата се коригира съответно. След последното перорално приложение, кръвни проби се изтеглят от феморалната артерия на анестезирани мишки, оставят се да се съсирят и се центрофугират при 3000 × g за 10 минути, за да се получи серум; дясната бедрена кост и тибия бяха дисектирани. Всички проби се съхраняват при -80 ◦C за по-нататъшна оценка на костната микроархитектура и свързаните с остеопорозата серумни биохимични параметри.

3.4. Тестване на огъване в три точки

Биомеханичните свойства на дясната бедрена кост на мишката се определят чрез използване на триточково огъване. Приспособлението за огъване има V-образна опора за фиксиране на дисталния и проксималния край на бедрената кост по време на тестване. Бедрената кост беше разположена хоризонтално с предната страна нагоре и натоварването беше приложено надолу в центъра на средната бедрена кост. Разстоянието между опорите е 8 мм. Костите бяха натоварени при постоянна скорост на изместване от 0.02 mm/s до повреда с помощта на BOSE Testing Machine (3220) (Bose Corporation, Endura TEC Systems Group, Minnetonka, MN, USA). Кривите натоварване-преместване бяха получени и използвани за изчисляване на структурните и материалните свойства, включително максимално натоварване, пиково натоварване, модул на еластичност, якост на огъване и др.

3.5. Микрокомпютърен томографски анализ

Десните бедрени кости на всички мишки бяха почистени от прилепналите меки тъкани и микроархитектурата на трабекуларната кост на горната дясна дистална феморална метафизика беше определена с микро-CT скенер (eXplore Locus SP, GE Healthcare, Лондон, Онтарио, Канада) с изотропната разделителна способност, зададена на 8 µm във всичките три пространствени измерения. Областта на интерес (ROI) беше избрана чрез използване на същите координати в растежната плоча на бедрената кост. Костните морфометрични параметри, включително BMD, костно минерално съдържание (BMC), тъканно минерално съдържание (TMC), тъканна минерална плътност (TMD), костна обемна фракция (BVF), трабекуларно отделяне (Tb. Sp), трабекуларен брой (Tb. N ) и трабекуларната дебелина (Tb. Th), бяха оценени чрез анализиране на ROI с помощта на софтуер за анализ на кости ABA.

3.6. Анализ на биохимичните параметри

Активността на серумната алкална фосфатаза (ALP) се измерва на автоматичен анализатор (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, USA)); нивата на серумния DPD, BGP и катепсин К бяха определени чрез съответните комплекти реагенти и устойчивата на тартарат кисела фосфатаза (TRAP) беше анализирана съгласно съответната литература [32].

3.7. Уестърн блот анализ

Нивата на протеинова експресия на TRAF6, NF-кВ PI3K, Akt, OPG и RANKL в различни групи бяха открити чрез Western blot анализ. Накратко, протеинът се екстрахира от дясната тибия на мишки с помощта на лизисен буфер, съдържащ 0.5 mM фенилметилсулфонил флуорид, протеазни и фосфатазни инхибитори. Лизатите се центрофугират в продължение на 10 минути при 12, 000 × g, за да се получат супернатантите за по-нататъшен анализ. Концентрацията на протеин в лизатите се измерва с помощта на анализ за количествено определяне на бицинхонинова киселина. Протеините (50-100 µg) се разделят с помощта на 10% SDS-PAGE, прехвърлят се в поливинилиден дифлуоридна мембрана и се инкубират с моноклонални първични антитела, насочени към TRAF6, NF-кВ RANKL, PI3K, Akt, OPG и -актин (1:500). Същата мембрана беше оголена и повторно изследвана, с хемилуминесцентни сигнали, открити от софтуера Image Lab. -актин или тубулин служи като вътрешен контрол.

3.8. Статистически анализ

Всички данни, получени от експерименти с животни, бяха анализирани чрез използване на еднопосочен анализ на дисперсията с теста на Денет от SPSS (Версия 22.0, IBM SPSS Statistics, IBM Corp., Armonk, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ ) софтуер; стойност на p < 0.05 се счита за статистически значима и всички резултати са представени като средна стойност ± SD.

4. Изводи

В обобщение, Cis A,активни фенилетаноидни гликозидиизолиран от C. deserticola, показва значителна антиостеопоротична активност върху OVX мишки и молекулярният механизъм може да е свързан с TRAF6-медиирана NF-kappaB инактивация и PI3K/Akt активация, като по този начин вероятно е обещаващ агент за лечение на остеопороза заболяване.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗААНТИОСТЕОПОРОТИЧНО ДЕЙСТВИЕPHGS75% ECH 30% ACT 12%