Тромбомодулинът подобрява хроничното бъбречно заболяване, медиирано от трансформиращия растежен фактор-b1, чрез сигналния път на свързания с G-протеин рецептор 15/Akt

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8, Taro Yasuma1,2,8, Kota Nishihama1, Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2, Toshiaki Totoki4, Yuko Okano1,2, Akihiro Uchida1, Ryo Inoue6, Liqiang Qin7, Shujie Wang5, Валерия Фридман Д'Алесандро2, Тецу Кобаяши3, Йошиюки Такей4, Акира Мизогучи5, Ютака Яно1,9 и Естебан С. Габаза2,9

1 Катедра по диабет, метаболизъм и ендокринология, Висше училище по медицина на университета Мие, град Цу, Мие, Япония; 2 Катедра по имунология, Висше училище по медицина на университета Мие, град Цу, Мие, Япония; 3 Катедра по белодробна и интензивна медицина, Висше училище по медицина на университета Мие, град Цу, Мие, Япония; 4 Катедра по гастроентерология и хепатология, Висше училище по медицина на университета Мие, град Цу, Мие, Япония; 5 Катедра по невронна регенерация и клетъчна комуникация, Медицински факултет на Университета Мие, град Цу, Мие, Япония; 6 Централен институт за експериментални животни, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Япония; и 7-мо отделение по нефрология, болница Тайджоу, Медицински университет Уенжоу, Лихай, провинция Жедзян, Китайска народна република.

Kidney International (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Авторско право ª 2020, Международно дружество по нефрология. Публикувано от Elsevier Inc. Това е статия с отворен достъп под лиценз CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Кореспонденция: Esteban C. Gabazza, Катедра по имунология, Медицински факултет на университета Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Япония. Имейл: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; или Ютака Яно, Диабет, Метаболизъм и Ендокринология, Висше училище по медицина на университета Мие, Едобаши 2-174, Цу-сити, Мие 514-8507, Япония. E-mail: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT и TY допринесоха еднакво за тази работа. 9 YY и ECG са съ-старши автори. Получено на 1 септември 2019 г.; ревизиран на 24 април 2020 г.; приет на 7 май 2020 г

КЛЮЧОВИ ДУМИ: апоптоза; хронично бъбречно заболяване; G-протеин свързан рецептор; рекомбинантен човешки тромбомодулин; трансформиращ растежен фактор-b1

Бъбречната фиброза е често срещана последица от хронични бъбречни заболявания, която неумолимо прогресира до краен стадий на бъбречно заболяване с органна недостатъчност, лечима само със заместителна терапия. Тъй като трансформиращият растежен фактор-b1 е основният играч в патогенезата на бъбречната фиброза, ние поставихме хипотезата, че рекомбинантният тромбомодулин може да подобри медиираната от трансформиращ растежен фактор-b1 прогресивна бъбречна фиброза и недостатъчност. За да разпитаме нашата хипотеза, ние генерирахме нова трансгенна мишка с човешки трансформиращ растежен фактор-b1, специфична за гломерул, за да оценим терапевтичния ефект на рекомбинантния тромбомодулин. Тази трансгенна мишка развива прогресивна гломерулна склероза и тубулоинтерстициална фиброза с бъбречна недостатъчност. Терапията с рекомбинантен тромбомодулин в продължение на четири седмици значително инхибира бъбречната фиброза и подобрява функцията на органа в сравнение с нелекувани трансгенни мишки. Лечението с рекомбинантен тромбомодулин значително инхибира апоптозата и мезенхимната диференциация на подоцитите чрез взаимодействие с G-протеин свързания рецептор 15 за активиране на Akt сигналния път и за повишаване на експресията на антиапоптотични протеини, включително сурвивин. По този начин нашето проучване силно предполага потенциалната терапевтична ефикасност на рекомбинантния тромбомодулин за лечение нахронично бъбречно заболяванеи последваща органна недостатъчност.

цистанчемогалекуват бъбречно заболяванеподобряване на бъбречната функция

Преводна декларация

Фиброза и дисфункция набъбрецив момента са големи здравословни проблеми в световен мащаб. Понастоящем няма одобрено антифиброзно лекарство за лечение на бъбречна фиброза. Трансформиращият растежен фактор-b1 е основният и общ двигател на бъбречната фиброгенеза при хронично бъбречно заболяване, причинено от много заболявания. Тук открихме, че рекомбинантният тромбомодулин, лекарство, одобрено в Япония за лечение на дисеминирана интраваскуларна коагулация, потиска прогресирането на гломерулна склероза, тубулоинтерстициална фиброза и бъбречна недостатъчност, причинени от свръхекспресия на човешки трансформиращ растежен фактор-b1, което предполага потенциалната му терапевтична стойност за лечението нахронични бъбречни заболявания.

Хронично бъбречно заболяванее основен проблем за общественото здраве, свързан с висока заболеваемост и смъртност, който засяга около 13 процента от възрастното население в развитите страни.1 Световната здравна организация съобщи, чехронично бъбречно заболяване(ХБН) е причина за 1,5 процента от смъртните случаи в световен мащаб през 2012 г.1 Освен това, последните епидемиологични данни показват глобално стабилно нарастване на броя на пациентите с ХБН.2,3 В повечето случаи патологичният процес прогресивно се развива, водещ в крайна сметка до крайно стадий на бъбречна недостатъчност, който се лекува само с доживотна диализа или бъбречна трансплантация.4,5 Захарният диабет (ЗД) и артериалната хипертония са най-честите причини за ХБН, следвани от исхемия, гломерулосклероза с неизвестна етиология, урологични обструкции и хронични инфекции.6 Независимо от подлежащото разстройство, крайната и често срещана патологична последица от ХБН е фиброзата на бъбреците.7 Бъбречната фиброза е анормално заздравяване и ремоделиране на паренхимните структури на бъбреците, подложени на продължително или повтарящо се увреждане, характеризиращо се с наличието на тубулоинтерстициална фиброза, гломерулосклероза и тубулна атрофия.8 Основният двигател на бъбречната фиброгенеза е фактът на трансформиращия растеж или (TGF)-b1.8,9 TGFb1 може да насърчи фиброзата чрез стимулиране на секрецията на извънклетъчни матрични протеини и хемотактични фактори или пролифериращи фактори на фибробластите, чрез инхибиране на металопротеиназите и чрез насърчаване на епителен-мезенхимален преход.10 Освен лечението на основното заболяване , одобрено лекарство, което е насочено конкретно към бъбречната фиброза, в момента не е налично.6

Тромбомодулин (TM) е трансмембранен гликопротеин с множество биологични функции, включително модулиране на системата за съсирване, имунния отговор, възпалителни реакции и клетъчно оцеляване.11 Молекулярната структура на TM съдържа лектиноподобен домен, 6 домена, подобни на епидермален растежен фактор , богат на серин/треонин домен, трансмембранна част и цитоплазмена опашка.12 Тромбинът, прокоагулантен фактор, генериран по време на активиране на коагулационната система, се превръща в антикоагулант и антифибринолитичен фактор след свързване с ТМ.13 Комплексът ТМ-тромбин увеличава генерирането на активиран протеин С (APC), антикоагулант с противовъзпалителна и цитопротективна активност, чрез активиране на протеин С. В допълнение, само ТМ може директно да понижи възпалителния отговор чрез инхибиране на активността на групата протеин В с висока подвижност-1 (HMGB1), чрез потискане на имуногенни дендритни клетки, еозинофили, мастоцити и системата на комплемента.13-18

Има публикувани резултати, показващи превантивни ефекти на ТМ при диабетна ренопатия и исхемично-реперфузионно бъбречно увреждане.19-21 Въпреки това нито едно проучване не е оценило ефекта на рекомбинантната ТМ върху прогресивната бъбречна фиброза, индуцирана от TGFb1, често срещан двигател на бъбречна фиброза при няколко заболявания, причиняващи ХБН. Поставихме хипотезата, че ТМ може да подобри TGFb1-медиирана бъбречна фиброза и бъбречна недостатъчност. За да разпитаме тази хипотеза, ние оценихме терапевтичния ефект на рекомбинантната ТМ в новоразработена гломерул-специфична TGFb1 трансгенна (TG) мишка, която развива прогресивнобъбречна фиброза и бъбречна недостатъчност.

цистанче за бъбрек

РЕЗУЛТАТИ

Повишените циркулиращи ТМ фрагменти корелират с бъбречна дисфункция

ТМ, гликопротеин, свързан с ендотелна клетъчна мембрана, се разцепва на фрагменти, губейки своите защитни функции по време на ендотелно увреждане.22 Диабетната нефропатия е свързана с ендотелно увреждане.23,24 Пациентите със ЗД с нефропатия, в сравнение с пациентите без нефропатия, показват значително високи циркулиращи нива на ТМ (4,4 спрямо 3,3 pg/ml) и активен TGFb1 (0.28 спрямо 0.24 ng/ml) (допълнителна таблица S1, допълнителна фигура S1A). TM е значително свързан с креатинина, активния TGFb1 и разтворимия подоцин (допълнителна фигура S1B). Тези наблюдения предполагат, че загубата на функционална мембранно свързана ТМ е свързана с повишено освобождаване на активен TGFb1 и бъбречна дисфункция.

TG мишка със специфична за гломерул експресия на човешки TGFb1 ген с пълна дължина

Разработихме TG мишка, свръхекспресираща човешкия TGFb1 ген с пълна дължина в подоцитите. Мишката се генерира чрез поставяне на човешкия TGFb1 под контрола на промотора на подоцин върху конструкт на бактериална изкуствена хромозома (BAC) (допълнителна фигура S2; допълнителна фигура S3). Получихме 5 мишки основатели, експресиращи 3 копия и 3 мишки основатели, експресиращи 1 копие на човешкия TGFb1 трансген. Експресията на трансгена е специфична за бъбреците и потомството на основателите е жизнеспособно (допълнителна фигура S3). Мишките са имали доносени бременности и котилото е с нормален размер. Мишките са родени в очакваното Менделово съотношение.

За да характеризираме TG мишките, ние измерихме няколкобъбречни параметрина всеки 4 седмици за период от 16 седмици (допълнителна фигура S4). Концентрациите на TGFb1 в плазмата и урината са значително повишени при TGFb1- TG мишки в сравнение с мишки от див тип (WT) от ранните седмици след раждането и след това остават стабилни на високо ниво (Фигура 1а). TGFb1-TG мишки показват значително увеличение на съдържанието на хидроксипролин в бъбречната тъкан на 20-та седмица (190.5 срещу 96.0 mg/бъбрек ), мезангиална експанзия от 4-та седмица (1,9 срещу 1,1 резултати) и при отлагане на колаген от 12-та седмица (0.9 процента срещу 0,1 процента) след раждането в сравнение с техните WT двойници (Фигура 1a–f ). Конвенционалната оптична микроскопия показва разширяване на базалната мембрана на капсулата на Bowman, удебеляване на гломерулната базална мембрана, повишено отлагане на колаген в мезангиалните и интерстициалните пространства и тубулна атрофия (Фигура 1bd). Трансмисионната електронна микроскопия показа гломерулосклероза, включително микровилозна трансформация и изтриване на процеса на подоцитите, намалена гломерулна капилярна ендотелна фенестрация, удебеляване на гломерулната базална мембрана и повишено отлагане на мезангиална матрица (Фигура 2a–i). Концентрациите в урината на ранните маркери на нефропатия протеин, свързващ мастни киселини (185,1 срещу 87,0 pg/ml) иувреждане на бъбрецитемолекула 1 (441,9 срещу 256,9 pg/ml) са значително повишени в TGFb1-TG мишки от 4-та и 8-ма седмица на възраст, съответно, в сравнение с техните съвпадащи по възраст WT мишки (допълнителна фигура S5). Общата протеинурия и съотношението общ протеин-креатинин в урината са значително повишени на 4-та, 8-ма, 12-та, 16-та и 20-та седмица при TGFb1-TG мишки в сравнение с техните WT двойници (Фигура 3а) . Плазменото ниво на урейния азот в кръвта е значително повишено от 4-та седмица (5,1 срещу 4,1 mg/dl) и концентрацията на креатинин от 8-та седмица (1,1 срещу 0,4 mg/dl) при TGFb1-TG мишки в сравнение с техните WT колеги (Фигура 3b).

rhTM инхибира гломерулосклерозата и тубулоинтерстициалната фиброза

В сравнение с TGFb{{0}}TG мишки, третирани с физиологичен разтвор (SAL) и WT мишки, третирани с рекомбинантен човешки (RH) TM или SAL, TGFb1-TG мишки, третирани с rhythm, показват значително намален мезангиален експанзия/клетъчност (1,3 срещу 3{{30}} резултат) и значително ниско отлагане на тубулоинтерстициален колаген и гломерулосклероза (121,3 процента срещу 139,7 процента) (Фигура 4a–e). В съответствие с тези наблюдения, съдържанието на хидроксипролин (11,7 срещу 19,9 mg/g), концентрациите в бъбречната тъкан на колаген I (101,3 спрямо 196,7 ng/mg протеин) и периостин (21,7 срещу 40,8 ng/ mg протеин) и относителната mRNA експресия на колаген I беше значително намалена в бъбречните тъкани от TGFb1-TG мишки, третирани с rhTM в сравнение с бъбречните тъкани от контролни мишки (Фигура 4f, Допълнителни таблици S2 и S3). Трансмисионната електронна микроскопия показа значително намаляване на изтриването на процеса на крака на подоцитите и удебеляване на гломерулната базална мембрана при мишки, третирани с rhTM, в сравнение с мишки, третирани само със SAL (допълнителна фигура S6AB и B). В допълнение, концентрациите в бъбречната тъкан на профиброзните цитокини моноцитен хемоатрактантен протеин-1 (45,0 срещу 76,1 pg/mg протеин), интерлевкин-13 (612,1 срещу 1002,0 pg/mg протеин) и активен TGFb1 (131,0 спрямо 151,5 pg/mg протеин) са значително намалени при TGFb1-TG мишки, третирани с rhTM в сравнение с контролните мишки (допълнителна фигура S7). Концентрацията на HMGB1 в бъбречната тъкан също е значително намалена в бъбречните тъкани от TGFb1-TG мишки, третирани с rhTM в сравнение сбъбречни тъканиот контролни мишки (допълнителна фигура S7). Плазмената концентрация на тромбин антитромбиновия комплекс е значително повишена в групата на TGFb1-TG/SAL в сравнение с групата на WT/SAL, но не е открита разлика между групите на TGFb1-TG/rhTM и WT/rhTM (Допълнителна фигура S8A). Както се очакваше, имаше висока концентрация на ТМ в плазмата на TGFb1-TG и WT мишки, третирани с rhTM. Плазмената концентрация на комплекса APC/антитрипсин е значително намалена в групата на TGFb1-TG/SAL в сравнение с групите на WT/SAL и TGFb1-TG/rhTM (280,5 спрямо 384,6 pg/ml) и няма значителна разлика в нивото на инхибитора на плазминогенния активатор -1 (допълнителна фигура S8A). Нивата на C5a в плазмата, урината ибъбречна тъкан(630.1 спрямо 1075.0 pg/mg протеин) и плазменоразтворимият подоцин са значително намалени при TGFb1-TG мишки, третирани с rhTM в сравнение с TGFb1-TG мишки, третирани със SAL (Допълнителна фигура S8B). Нивото на подоцин в урината е по-високо в групата с TGFb1-TG/SAL, отколкото в групите с WT/SAL и TGFb1-TG/rhTM (допълнителна фигура S9A–C).

Фигура 1|Трансгенната (TG) мишка с човешки трансформиращ растежен фактор b1 (TGFb1) развива прогресивна бъбречна фиброза. ( а ) Концентрациите на TGFb1 протеин в плазмата и урината се измерват чрез ензимен имунен анализ и съдържанието на тъканен хидроксипролин чрез колориметричен анализ. (b–d) Срезове от бъбречна тъкан бяха оцветени с (b) периодична киселина–Шиф (ленти ¼ 20 mm) и с (c,d) трихром на Masson (ленти ¼ 10{{ 40}} mm) и след това (e, f) количествено определени с помощта на точкова система или софтуера за изображения WinROOF (Mitani Corporation, Токио, Япония). Броят на мишките за оценка на бъбречна тъкан: за мишки от див тип (WT), n=4 на 4, 12 и 20 седмици; за TG мишки, n=7 на 4 седмици, n=8 на 16 седмици и n=9 на 20 седмици. Броят на мишките за оценка на плазмата и урината: за WT мишки, n=12 на 4 седмици, n=8 на 8 седмици, n=7 на 12 седмици и n=4 на 16 и 20 седмици; за TG мишки, n=24 на 4 седмици, n=17 на 8 и 12 седмици и n=9 на 16 и 20 седмици. Данните са изразени като среден интерквартилен диапазон. Статистически анализ чрез U тест на Mann-Whitney. *P <0,05, **p=""><0,01, ****p=""><0,0001. ns,="" незначително.="" за="" да="" оптимизирате="" гледането="" на="" това="" изображение,="" моля,="" вижте="" онлайн="" версията="" на="" тази="" статия="" на="">

Фигура 2|Находки от трансмисионен електронен микроскоп в модела на бъбречна фиброза, индуциран от трансформиращ растежен фактор b1. Фиксирането, обработката и отстраняването на бъбреците от мишки се извършват, както е описано в методите. ( a, b ) Микроволиозна трансформация и ( a, b, d, e, g ) изтриване на израстъци на краката (бели стрелки) на подоцитите, (c–e) намалена гломерулна капилярна ендотелна фенестрация (жълти стрелки), (f) удебеляване на присъстват гломерулна базална мембрана (звездички) и (h,i) повишено отлагане на мезангиален матрикс (бели стрелки). CL, капилярен лумен. За да оптимизирате гледането на това изображение, моля, вижте онлайн версията на тази статия на www.kidney-international.org.

rhTM подобрява бъбречната функция

Нивата на протеин, свързващ L-мастни киселини (197.0 спрямо 313,4 pg/ml),бъбречно увреждане молекула1 (299,9 спрямо 596,2 pg/ml), азотът на уреята в кръвта (12,9 срещу 34,8 mg/dl), креатининът (0.5 срещу 1,4 mg/dl) и съотношението албумин-креатинин са значително намалени в TGFb1-TG мишки с бъбречна фиброза, лекувани с rhTM в сравнение с техните нелекувани TG двойници (Фигура 5). Общият протеин в урината и съотношението общ протеин креатинин също бяха намалени при TGFb1-TG мишки, третирани с rhTM, в сравнение с техните нетретирани двойници (Фигура 5).

rhTM намалява апоптозата на гломерулните клетки

Терминално дезоксинуклеотидил трансфераза-медиирано оцветяване с dUTP nick крайно маркиране показва значително намален брой апоптотични клетки в гломерули от TGFb1-TG мишки, третирани с rhTM, в сравнение с гломерули от TGFb1- TG мишки, третирани със SAL (допълнителен Фигура S10A и B). Разцепването на каспаза-3 също беше значително намалено в бъбречните тъкани от TGFb1-TG мишки, третирани с rhTM, в сравнение с бъбречните тъкани от TGFb1-TG мишки, третирани със SAL (допълнителна фигура S10C). Theбъбречни тъканиот TGFb1-TG мишки, третирани с rhTM, в сравнение с тези от TGFb1-TG, третирани със SAL, показват значително повишаване на нивата на иРНК на В-клетъчен лимфом 2 (Bcl-2), B -клетъчен лимфом-изключително голям (Bcl-XL), бакуловирусен инхибитор на апоптоза, съдържащ повторение 5 (BIRC5, известен също като сурвивин) и BIRC6 (Apollon) с повишено съотношение Bcl-2–Bax (допълнителна фигура S11 ).

Фигура 3|Трансгенната (TG) мишка с човешки трансформиращ растежен фактор b1 (TGFb1) има бъбречна дисфункция. ( а ) Общият протеин и ( б ) азотът на уреята в кръвта (BUN) бяха измерени чрез колориметрични методи и креатинин чрез ензимен метод. Броят на мишките за оценка на плазмата и урината: за мишки от див тип (WT), n=12 на 4 седмици, n=7 на 8 и 12 седмици и n=4 на 16 и 2{ {21}} седмици; за TG мишки, n =24 на 4 седмици, n=17 на 8 и 12 седмици и n=9 на 16 и 20 седмици. Данните са изразени като медиана ± интерквартилен диапазон. Статистически анализ чрез U тест на Mann-Whitney. *P <0.05, **p=""><0,01, ****="" p=""><>

rhTM инхибира апоптозата на подоцитите

Предварителното третиране на подоцити с rhTM значително намалява апоптозата на подоцити, култивирани в присъствието на TGFb1, както се оценява по броя на клетките в subG1 фазата (3,2 процента срещу 5,2 процента), терминална деоксинуклеотидил трансфераза-медиирана dUTP nick крайно маркиране-положителни клетки ( 1.0 спрямо 5,4 клетки/Fifield) и степента на разцепване на каспаза-3 (съотношения 0.9 срещу 1.1) (Фигура 6a–e). Скринингът на антиапоптотични фактори в култивирани подоцити показа, че rhTM значително повишава експресията на mRNA на антиапоптотичния фактор Bcl-2 в сравнение с експресията в нетретирани клетки (допълнителна фигура S12). Експресията на mRNA на антиапоптотичния фактор BIRC5 също се повишава в клетки, третирани с rhTM, в сравнение с експресията в нетретирани клетки (допълнителна фигура S12). Експресията на mRNA на проапоптотичния фактор Bax беше значително намалена чрез лечение с rhTM в сравнение с липса на лечение (допълнителна фигура S12). Третирането с rhTM също така значително инхибира експресията на анексин V и терминално дезоксинуклеотидил трансфераза-медиирано dUTP nick крайно маркиране в подоцити, култивирани в присъствието на водороден пероксид (допълнителна фигура S13A–E) и при условия на висока глюкоза (допълнителна фигура S14A–E ), допълнително потвърждавайки антиапоптотичните свойства на rhTM върху подоцитите. Изследването на пътя на антиапоптозната протеин киназа B (Akt) показва, че rhTM повишава фосфорилирането на Akt в човешки първични подоцити, култивирани в присъствието на водороден пероксид или TGFb1 (допълнителна фигура S15A и B). След това изолирахме подоцити от всяка група мишки и оценихме Akt фосфорилирането чрез Western blotting. Имаше значително повишено фосфорилиране на Akt в подоцити, изолирани от групата TGFb{{30}}TG/rhTM в сравнение с подоцити от нетретираната група (съотношения 1,1 срещу 0,7) (допълнителна фигура S16A и B).

GPR15 посредничество

Предишни проучвания съобщават, че ТМ активира вътреклетъчните пътища чрез взаимодействие с рецептора на фибробластния растежен фактор 1 (FGFR1) иG-протеин свързан рецептор15 (GPR15).26,27 Подоцитите експресират FGFR128, но дали експресират GPR15 не е ясно. Тук изолирахме подоцити от всяка група мишки и показахме, че подоцитите също експресират GPR15 (допълнителна фигура S17A–E). Открихме, че подоцитите от здрав контрол и пациент с гломерулосклероза също експресират GPR15 (допълнителна фигура S18). За да изясним дали FGFR1 или GPR15 медиира rhTM инхибиторната активност върху апоптозата на подоцитите, ние оценихме антиапоптотичната активност на rhTM в TGFb1-третирани подоцити в присъствието на FGFR1 инхибитор или след трансфектиране на клетките с малка интерферираща РНК (siRNA) срещу FGFR1 или GPR15. Предварително третиране на подоцити с FGFR1 инхибитор (допълнителна фигура S19A и B) или FGFR1 siRNA (13,2 процента срещу 7,9 процента) (Фигура 7а и b) не успя да премахне инхибиторната активност на rhTM върху апоптозата на подоцитите. Въпреки това, трансфекцията на клетки с GPR15 siRNA напълно премахва инхибиторната активност на rhTM (14,6 процента срещу 13,8 процента) върхуапоптоза на подоцитите(Фигура 7a–c).

Фигура 4|Рекомбинантният човешки тромбомодулин (rhTM) инхибира гломерулосклерозата и тубулоинтерстициалната фиброза. Секции от бъбречна тъкан бяха оцветени (a, b) с периодична киселина-Schiff и (c, d) с трихром на Masson и (e) след това количествено определени с помощта на точкова система или софтуера за изображения WinROOF. (e) Средната стойност на групата с див тип (WT)/физиологичен разтвор (SAL) беше взета като 100 процента. Статистически анализ чрез U тест на Mann-Whitney. (f) Съдържанието на тъканен хидроксипролин се измерва чрез колориметричен метод, концентрация на колаген I-a1 (Col1a1) и периостин чрез ензимен имуноанализ и експресия на mRNA чрез верижна реакция на обратна транскриптаза-полимераза. Статистически анализ от Kruskal Wallis анализ на дисперсията и коригиран тест на Dunn. n=8 във всяка група. Пръчки {{10}} (a,c) 50 mm и (d) 20 mm. Данните са изразени като медиана ± интерквартилен диапазон. *P <0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001, ****p=""><0,0001. tg,="" трансгенен;="" tgfb1,="" трансформиращ="" растежен="" фактор="" b1.="" за="" да="" оптимизирате="" гледането="" на="" това="" изображение,="" моля,="" вижте="" онлайн="" версията="" на="" тази="" статия="" на="">

rhTM инхибира ЕМТ на подоцитите

Имаше значително увеличена площ с положително оцветяване за подоцин и a-гладкомускулен актин (a-SMA) (1,4 процента срещу 11,2 процента) при TGFb1-TG/SAL мишки в сравнение с TGFb1-TG / rhTM мишки (Фигура 8а и b). След това култивирахме in vitro първични човешки подоцити, предварително третирани с rhTM преди добавяне на TGFb1 протеин към културалната среда. Фибробластоподобната морфология и повишената експресия на a-SMA бяха потиснати в подоцити, третирани с rhTM в сравнение с нетретирани клетки (допълнителна фигура S20A). В допълнение, rhTM инхибира експресията на mRNA на фибронектин и виментин, въпреки че повишава експресията на mRNA на E-cadherin в подоцитите в сравнение с експресията в нетретирани клетки (допълнителна фигура S20B). SMAD членове на семейството 2 (Smad2) и Smad3 играят критична роля в TGFb1-медиирания епителен-мезенхимален преход (EMT).29 Лечението с rhTM значително потиска активирането на Smad2 и Smad3 в TGFb1-TG мишки в сравнение с нетретирани TG мишки (Фигура 8с) и в човешки подоцити, култивирани в присъствието на TGFb1 (допълнителна фигура S20C).29 TG мишки, третирани с rhTM (TGFb1-TG/rhTM) също показват по-слаба експресия на a-SMA (3,7 процента срещу 17,2 процента) в тубулни епителни клетки в сравнение с техните нетретирани аналози (допълнителна фигура S21A и B).

Фигура 5|Рекомбинантният човешки тромбомодулин (rhTM) облекчава бъбречно увреждане и бъбречна дисфункция. Креатининът се измерва с ензимен метод; общ белтък по колориметричен метод; и уреен азот в кръвта (BUN) и албумин, молекула 1 на увреждане на бъбреците (KIM-1), свързващ протеин на L-мастни киселини (L-FABP) и общ трансформиращ растежен фактор b1 (TGFb1) чрез ензимен имунен анализ. n=8 във всяка група. Данните са изразени като медиана±интерквартилен диапазон. Статистически анализ чрез дисперсионен анализ на Kruskal-Wallis и некоригиран тест на Dunn. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001,="" ****="" p="">< 0,0001,="" #p="0.06." ns,="" незначително;="" sal,="" физиологичен="" разтвор;="" tg,="" трансгенен;="" wt,="" див="">

GPR15 медиира инхибиторната активност на rhTM върху EMT

Трансфекцията на подоцити с FGFR1 siRNA не успя да премахне инхибиторната активност на rhTM върху относителните mRNA експресии както на колаген I-a1, така и на a-SMA в третирани с TGFb1- подоцити (допълнителна фигура S22). Въпреки това, трансфекцията на клетки с GPR15 siRNA значително премахна инхибиторната активност на rhTM върху относителните mRNA експресии както на колаген I-a1, така и на a-SMA в подоцити, третирани с TGFb1- (допълнителна фигура S22).

ДИСКУСИЯ

TGFb1 и увреждане на гломерулни клетки

Честата последица от заболявания, причиняващи ХБН, е бъбречна фиброза.8,30,31 TGFb1 е общият двигател на фиброгенезата в бъбреците, свързана с ХБН, причинена от заболявания, включително ЗД, артериална хипертония и автоимунни заболявания.10 Клетки от гломерула и тубулоинтерстициалните пространства може да секретира латентните форми на TGFb1, които, когато са прекомерно активирани по време на тъканно увреждане, могат да доведат до бъбречни белези.32 Тъй като TGFb1 може да стимулира собствената си секреция, фиброзният процес обикновено се превръща в порочен кръг.8 Ранно събитие в патогенния процес на TGFb 1- с посредничествофиброза на бъбрецитее увреждане на подоцитите и гломерулните ендотелни клетки.33-35 Плазменото ниво на разтворим ТМ е маркер за ендотелно увреждане. В съответствие с ролята на TGFb1 при увреждане на бъбречните клетки, тук открихме значителна корелация на активен TGFb1 с разтворим ТМ, разтворим подоцин и креатинин в плазмата от пациенти със ЗД. Връзка между гломерулни ендотелни клетки и подоцити по време на aбъбречно уврежданеводи до локална експресия на протеази, причиняващи разграждане на гломерулната базална мембрана.34-36 Това може да обясни откриването на разтворим подоцин и неговата значителна корелация с разтворим ТМ при нашите пациенти със ЗД.

Фигура 6|Рекомбинантният човешки тромбомодулин (rhTM) потиска апоптозата на подоцитите, индуцирана от трансформиращ растежен фактор b1 (TGFb1). (a) rhTM се добавя към културалната среда на подоцити 1 час преди индуциране на апоптоза с 10 ng/ml TGFb1 за 48 часа. ( b ) Процентът на клетките в subG1 фазата беше открит чрез друга цитометрия. (a,b) n=3 във всяка група. (c,d) Броят на клетките с фрагментация на ДНК се измерва чрез анализ на dUTP nick end-labeling (TUNEL), медииран от терминална дезоксинуклеотидил трансфераза (n=3 във физиологичен разтвор [SAL]/SAL и rhTM/SAL групи; n=6 в SAL/TGFb1 и rhTM/TGFb1 групи) и (e) степента на разцепване на каспаза-3 се измерва чрез Western blotting (n=4 във всяка група). Решетки=100 mm. Данните са изразени като медиана ± интерквартилен диапазон. Статистически анализ чрез U тест на Mann-Whitney. *P <0,05. dapi,="" 40,6-диамидино-2-фенилиндол;="" hpf,="" високомощно="" поле;="" ns,="" незначително.="" хистограмите="" се="" показват="" като="" максимален="" процент="" (процент="" от="" максималната="" стойност),="" като="" всяка="" крива="" се="" мащабира="" до="" режим="100" процента.="" за="" да="" оптимизирате="" гледането="" на="" това="" изображение,="" моля,="" вижте="" онлайн="" версията="" на="" тази="" статия="" на="">

Подоцит-специфична бъбречна фиброза, свързана със свръхекспресия на човешки TGFb1

Лекарство, което може да противодейства на ефекта на TGFb1, би било идеално за блокиране на бъбречната фиброза. Тук сме генерирали TG мишка, свръхекспресираща човешкия ген TGFb1 в гломерула, който развива спонтанна и прогресивна гломерулна склероза и тубулоинтерстициална фиброза с бъбречна недостатъчност още 4 седмици след раждането. Моделът показва напреднала гломерулопатия с увреждане на подоцитите и гломерулните ендотелни клетки; удебеляване на гломерулната базална мембрана и мезангиална експанзия с интерстициални белези; повишени маркери за увреждане на бъбречната тъкан и бъбречна дисфункция; и повишен TGFb1 в плазмата,бъбречна тъкан, и урина. Увеличаването на уринарната екскреция на протеини, TGFb1 и активирането на системата на комплемента може да обясни едновременното развитие на интерстициални белези в нашия настоящ модел.37-40 По-нататъшни експерименти разкриват повишени апоптотични клетки и активиране на Smad протеини в бъбречна тъкан от нетретиран TGFb{ {3}}TG мишки в сравнение с WT мишки. Като цяло, тези открития сочат тази нова TGFb1-TG мишка като подходящ модел за откриване на лекарства вфиброза на бъбреците.

Фигура 7|G-протеин свързан рецептор (GPR15) медиира инхибирането на апоптозен рекомбинантен човешки тромбомодулин (rhTM) в подоцитите. Човешки първични подоцитни клетки бяха трансфектирани с рецептор на фибробластен растежен фактор 1 (FGFR1) малка интерферираща РНК (siRNA), GPR15 siRNA или разбъркана siRNA за 48 часа и след това rhTM беше добавен към клетъчната култура 1 час преди третиране с трансформиращ растежен фактор b1 (TGFb1). Апоптозните клетки бяха (а) оценени чрез друга цитометрия и (б) след това количествено определени. ( c ) Клетъчните лизати се приготвят за Western blotting. n{{10}} във всяка група. Данните са изразени като медиана ± интерквартилен диапазон. Статистически анализ чрез U тест на Mann-Whitney. *P <0,05, #p="0.1." sal,="" физиологичен="">

Фигура 8|Инхибиране на епителен-мезенхимален преход от рекомбинантен човешки тромбомодулин (rhTM). ( а ) Подоцин и а-гладкомускулен актин (a-SMA) бяха оцветени, както е описано в методите. ( b ) Областта, положителна за a-SMA оцветяване, се определя количествено от софтуера за обработка на изображения WinROOF. n=3 в групи от див тип (WT)/физиологичен разтвор (SAL) и WT/rhTM и n=5 втрансформиращ растежен фактор-b1–трансгенен(TGFb{{0}}TG)/SAL и TGFb1-TG/rhTM групи. ( c ) Общите (t) и фосфорилираните (p) протеини от семейството на SMAD (Smad) бяха оценени чрез Western blotting. n=8 във всяка група. Данните са изразени като медиана ± интерквартилен диапазон. Статистически анализ чрез дисперсионен анализ на Kruskal-Wallis и коригиран тест на Dunn. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0.08." за="" да="" оптимизирате="" гледането="" на="" това="" изображение,="" моля,="" вижте="" онлайн="" версията="" на="" тази="" статия="" на="">

rhTM облекчава бъбречната фиброза

Ние показахме, че rhTM облекчава белодробната фиброза, развита при мишки, свръхекспресиращи човешки TGFb1 в белите дробове, чрез потискане на апоптозата на алвеоларните епителни клетки.41 Клиничните изпитвания също демонстрират облекчаване на идиопатичната белодробна фиброза след rhTM лечение.42,43 Тези предишни наблюдения предполагат потенциала на rhTM за лечение на органна фиброза. Ние предположихме, че rhTM ще бъде ефективен при бъбречна фиброза, свързана с TGFb1-. За да тестваме тази хипотеза, ние третирахме бъбречно-специфични TGFb1-TG мишки с rhTM.44 Прилагането на rhTM в продължение на 4 седмици значително намали увреждането, дисфункцията и фиброзата на бъбреците. Мишки, третирани с rhTM, показват ниски нива в урината на общ протеин, албумин, TGFb1, C5a и намалени бъбречни нива на профибротични цитокини, C5a и HMGB1.45 Терапията с rhTM също инхибира както апоптозата, така и EMT на подоцитите. Въпреки това, rhTM не оказва влияние върху тромбин антитромбиновия комплекс, маркер за активиране на коагулацията, въпреки че повишава генерирането на APC, антикоагулантен фактор с противовъзпалителна и антиапоптотична активност.23 Струва си да се отбележи, че тромбинът, прокоагулантният ензим, може да парадоксално насърчават антикоагулацията при нискостепенни протромботични състояния чрез образуване на ТМ/тромбинов комплекс, който увеличава генерирането на антикоагуланта APC. Въпреки това, тромбинът действа главно като прокоагулант при прекомерни протромботични състояния (напр. сепсис).46 Този двоен и парадоксален ефект на тромбина може да обясни очевидната неефикасност на rhTM за инхибиране на активирането на коагулацията в нашия модел, който е в нискостепенно протромботично състояние . Като цяло, тези наблюдения предполагат, че rhTM подобрява прогресивната фиброза и дисфункцията набъбрецичрез удължаване на преживяемостта на или предотвратяване на ЕМТ на гломерулни клетки и чрез потискане на възпалението, активирането на комплемента и активността на растежния фактор директно или индиректно чрез активиране на пътя на протеин С и намаляване на експресията на HMGB1. Подобряването на диабетната нефропатия при мишки с повишен циркулиращ TM лектиноподобен домен и влошаване на заболяването при мишки без лектиноподобен домен подкрепя благоприятния ефект на rhTM върху бъбречната фиброза.20,21

Инхибиране на апоптозата на подоцитите

Подоцитите играят критична роля в поддържането на бариерата за гломерулна филтрация и образуването на прорезна диафрагма, за да се предотврати загубата на основни циркулиращи протеини.47Бъбречно уврежданепричинени от реактивни кислородни видове, висока глюкоза или възпалителни медиатори, включително TGFb1, индуцира апоптоза на подоцити, водеща до изчерпване на подоцитите, което в крайна сметка може да доведе до бъбречна дисфункция.47 След свързване и активиране на серин/треонин киназа трансмембранен хетеромерен тип I и тип II рецепторен комплекс , TGFb1 излъчва вътреклетъчни сигнали чрез семейството на транскрипционни фактори Smad или чрез Smad-независими сигнални пътища.48 Активирането на Smad-зависимия път възниква, когато активираният TGFb1 рецептор фосфорилира Smad2 и Smad3, които със Smad4 се преместват в ядрото.49 Smad2/ Комплексът Smad3/Smad4 стимулира транскрипцията на проапоптотични фактори и намалява тази на антиапоптотичните фактори, водещи до клетъчна апоптоза.49 В съответствие с това открихме високото бъбречно ниво на проапоптотичния фактор Bax и ниското ниво на антиапоптотичните фактори Bcl2 и Bcl-XL в TGFb1- TG мишки. ТМ може да инхибира апоптозата на различни типове клетки.21,41,49 В съответствие с това, тук открихме, че rhTM инхибира апоптозата на подоцитите, индуцирана от водороден пероксид, висока глюкоза или TGFb1, и това откритие може да обясни благоприятния ефект на rhTM при ХБН . В допълнение, rhTM накланя баланса към инхибиране на апоптозата чрез намаляване на експресията на Bax, чрез увеличаване на експресията на Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 и BIRC6 и чрез увеличаване на активирането на Akt пътя вбъбречни тъкани. Като цяло, тези наблюдения предполагат, че rhTM стимулира оцеляването на подоцитите чрез благоприятстване на активирането на Akt и експресията на антиапоптотичен фактор.

cistanche за хронично бъбречно заболяване

Инхибиране на ЕМТ

ЕМТ на подоцитите също допринася за бъбречна фиброза. Подоцитите, подложени на ЕМТ, освобождават извънклетъчни матрични протеини, които се натрупват и отлагат по време на TGFb1-свързаната бъбречна фифиброгенеза.50 TGFb1 насърчава ЕМТ чрез рецептор-медиирано активиране на комплекса Smad2/Smad3/Smad4. Фосфорилираният Smad3 насърчава EMT чрез стимулиране на транскрипцията на матрични протеини и чрез намаляване на експресията на епителни маркери.51 В съответствие с това, ние открихме повишен EMT на подоцити в TGFb1-TG мишки и подоцити, култивирани в присъствието на TGFb1 или под състояния на оксидант или висока глюкоза. Предишни доклади предполагаха, че rhTM потиска EMT.52,53 Тук открихме, че rhTM инхибира EMT на подоцити и тубулоинтерстициални епителни клетки в TGFb1-TG мишки. Инхибирането на активирането на Smad протеин изглежда е механизмът на благоприятния ефект на rhTM върху EMT, тъй като TGFb1-TG мишки и първични подоцити, третирани с rhTM, изобразяват значително намалено фосфорилиране на Smad2 и Smad3 в сравнение с нетретирани състояния. Тези открития подкрепят инхибиторната активност на ТМ върху ЕМТ.

Рецепторно медииране в rhTM защитната активност

Предишни проучвания показват, че GPR15 или FGFR1 медиират цитопротективната активност на TM.26,27,54 Тествахме дали тези рецептори медиират защитната активност на rhTM срещу апоптоза и EMT. Докато регулирането на GPR15 протеин от siRNA напълно премахна супресивната активност на rhTM върху TGFb1-медиирана апоптоза на подоцити, нито FGFR1 siRNA, нито неговият инхибитор го премахнаха, което предполага, че GPR15 медиира rhTM защитната активност. Имаше повишено фосфорилиране на Akt в култивирани подоцити и подоцити, изолирани от TGFb1-TG мишки след лечение с rhTM, което предполага участието на вътреклетъчния Akt път. Работа, показваща, че rhTM активира пътя на Akt в ендотелните клетки, подкрепя това откритие.55 Активирането на сигналния път на Akt може допълнително да потенцира rhTM ефекта чрез увеличаване на повърхностната експресия на GPR15.56 Тези наблюдения показват, че rhTM защитава подоцитите от апоптоза в нашия TGFb{ {13}}TG мишки чрез активиране на оста GPR15/Akt, което води до повишена експресия на антиапоптотични фактори и намалена експресия на проапоптотични фактори.57 От друга страна, предишни проучвания показват, че анафилатоксините C3a и C5a чрез техните GPR могат да допринесат за ХБН чрез нараняване на подоцитите и че APC може да инхибира апоптозата на подоцитите и фиброзата на бъбреците чрез неговия ендотелен протеин С рецептор и протеаза-активиран рецептор 1.23,58–61 Тук открихме, че rhTM инхибира системата на комплемента и увеличава генерирането на APC. Следователно, освен активирането на пътя GPR15/Akt, инхибирането на факторите на комплемента и повишеното активиране на протеин С и неговите рецептори може също да обясни благоприятните ефекти на rhTM в нашия TGFb1-свързанмодел на бъбречна фиброза.

В допълнение, регулирането надолу на GPR15, но не и това на FGFR1, блокира инхибиторния ефект на rhTM върху EMT, което предполага, че GPR15 също медиира тази rhTM защитна активност. Инхибирането на Smad протеини участва в потискането на ЕМТ, тъй като лечението с rhTM инхибира фосфорилирането както на Smad2, така и на Smad3 в TGFb1-TG мишки и култивирани подоцити. Въпреки това, точният механизъм на инхибиране на Smad протеин чрез GPR15 не е ясен. Някои доказателства показват, че пътят на Akt може да пресича и регулира Smad сигналния път, 62-64 и че Akt може да предотврати фосфорилирането на Smad3 чрез директно взаимодействие с нефосфорилиран Smad3, за да го изолира извън ядрото, което води до инхибиране на транскрипцията и EMT.62- 64 Въз основа на тези доклади е възможно Akt да се активира след свързване на rhTM с GPR15 изолира нефосфорилиран Smad3, което води до инхибиране на EMT на подоцитите. Струва си да се отбележи, че този Akt-медииран благоприятен ефект се наблюдава само при незлокачествени клетки.65-67 В злокачествените клетки взаимодействието на TGFb1 с неговите рецептори може директно да активира пътя на фосфоинозитид 3-киназа/Akt/охлюв и да причини EMT.65–67 Като цяло, резултатите от нашето проучване подкрепят ролята на GPR15 като рецептор, медииращ благоприятните ефекти на rhTM върху подоцитите.

Заключение

В обобщение, тук докладваме за първи път нова трансгенна TG мишка, свръхекспресираща пълната дължина на човешкия TGFb1 ген, специално в гломерулите, които развиват спонтанна и прогресивна гломерулна склероза, тубулоинтерстициална фиброза ибъбречна недостатъчности облекчаване на установена бъбречна фиброза/бъбречна недостатъчност чрез rhTM взаимодействие с GPR15, което инхибира апоптозата и мезенхимния преход на подоцитите.

МЕТОДИ

Генериране на TGFb1 BAC TG мишка

TGFb1-BAC-TG мишка, експресираща човешкия TGFb1 ген с пълна дължина под контрола на миши подоцин промотор, е генерирана чрез пронуклеарно инжектиране в 392 C57BL/6J миши ембриона (CLEA Japan, Inc., Токио, Япония). Ние оценихме основателите на TG и предаването на зародишната линия на BAC TG конструкта чрез Southern blotting (допълнителни материали и методи).

Опитни животни

TGFb1-TG мишките са отглеждани повече от 10 поколения на фона на C57BL/6, преди да бъдат използвани в експериментите. Като контролни животни бяха използвани WT котила. Всички животни бяха държани в специфична свободна от патогени среда и подложени на 12--часов цикъл светло-тъмно при околна температура и влажност, вариращи между 22 градуса и 26 градуса и 40 процента и 70 процента, и с ad libitum достъп за храна и вода в къщата за животни на университета Mie (допълнителни материали и методи).

Етична декларация

Комитетът за безопасност на експерименти с рекомбинантна ДНК (одобрение № I-629; дата: 19 септември 2013 г.) и Комитетът за изследване на животни към университета Ми (одобрение № 27-4; дата: 19 август 2015 г.) одобри протоколите от изследването. Всички процедури с животни бяха извършени в съответствие с институционалните указания на университета Mie и следвайки международно одобрените принципи за грижа за лабораторни животни, публикувани от Националния институт по здравеопазване (https://olaw.nih.gov/).

За клиничното изследване беше дадено писмено информирано съгласие от всички пациенти и здрави субекти и протоколът от изследването беше одобрен от Комитета по етика за клинични изследвания на университета Mie (одобрение № 1043 и 2194).

Експериментален дизайн

За характеризиране набъбрекмодел на фиброза, разпределихме мъжки TGFb{{0}}TG мишки (n=24) и мъжки WT мишки (n=12) на възраст 4 седмици и с тегло 20 до 23 g в 3 групи с 8 TGF b1-TG мишки и 4 WT мишки във всяка група. Мишки от всяка WT и TGFb1-TG група бяха евтаназирани на седмици 0, 8 или 16, за да се съберат проби от урина, кръв и бъбрек за оценка на промените във фифиброзата и параметрите на бъбречната функция с течение на времето.

За оценка на терапевтичната ефективност на rhTM (rhTM е любезно предоставен от Asahi Kasei Pharma Corporation, Токио, Япония) при бъбречна фиброза, TGFb1-TG мишки (n= 8) или WT котила (n {{2 }}) са третирани с rhTM (3 mg/kg) чрез ip инжекция, 3 пъти седмично през 4-те седмици преди мишките да бъдат умъртвени. TGFb1-TG мишки (n =8) или WT котила (n= 8), получаващи еднакво количество физиологичен SAL чрез ip инжекция, бяха използвани като отрицателни контролни мишки.

Протоколът на настоящото проучване следваше насоките за изследвания върху животни: Докладване на експерименти in vivo (ARRIVE). Мишките бяха рандомизирани и изследователите, които измерваха параметрите, бяха заслепени за групите за лечение.

Биохимичен анализ

Концентрациите на общия протеин (комплект за анализ на протеин BCA; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), моноцитен хемоатрактант протеин-1 (BD Biosciences Pharmingen, Сан Диего, Калифорния), тромбин, антитромбинов комплекс (Cedarlane Laboratories, Hornby, Онтарио, Канада) бяха измерени с помощта на търговски комплекти за ензимен имуноанализ, следвайки инструкциите на производителя (допълнителни материали и методи).

Клетъчна култура

Първичните човешки подоцитни клетки са закупени от CELPR OGEN (Torrance, CA). Човешки подоцитни първични клетки се култивират в модифицираната на Dulbecco среда Eagle във влажна атмосфера с 5 процента CO2 при 37 градуса. Средата беше допълнена с 10 процента топлинно инактивиран фетален говежди серум (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 IU/ml пеницилин, 100 mg/ml стрептомицин и L-глутамин (допълнителни материали и методи).

Статистически анализ

Данните са изразени като медиана±интерквартилен диапазон. Статистическата разлика между променливите се изчислява чрез дисперсионен анализ на Kruskal-Wallis с post hoc анализ, използвайки теста на Dunn. U тестът на Mann-Whitney беше използван за оценка на разликите между 2 групи. Статистическите анализи бяха направени с помощта на GraphPad Prism версия 8.0.1 (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния). Статистическата значимост се разглежда като P <>

РАЗКРИВАНЕ

ECG, CND-G и YY имат патент върху мишката TGFb1-TG сбъбречна фиброзаизползвани в настоящото изследване. CND-G и YY получиха грант от Министерството на образованието, културата, спорта, науката и технологиите на Япония за настоящото изследване. ECG, TY, CND-G и MT получиха грант от Shionogi Pharmaceuticals. Всички останали автори декларираха липса на конкурентни интереси.

БЛАГОДАРНОСТИ

Това изследване беше подкрепено отчасти от грантове от Министерството на образованието, културата, спорта, науката и технологиите на Япония (Kakenhi № 17K09824 за YY; Kakenhi № 17K08442 за CND-G) и отчасти от грант от Shionogi & Co, Ltd., Япония. Финансиращите нямат никаква роля в дизайна на изследването, анализа на данните, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Част от тази работа е публикувана в абстрактна форма.

АВТОРСКИ ПРИНОС

AT подготви модела на заболяването и написа първата чернова на ръкописа. TY, KN, TT, RI и CND-G подготвиха моделите на заболяването и измериха параметрите. AM и SW извършиха трансмисионно микроскопско изследване. MT, YO и AU измерват параметрите и извършват in vitro експерименти. YT, LQ, TK и VFD предоставиха интелектуален принос. YY и ECG коригираха черновата на ръкописа и проектираха изследването.

cistanche за симптоми на бъбречна недостатъчност

ДОПЪЛНИТЕЛЕН МАТЕРИАЛ

Допълнителен файл (PDF) Допълнителни материали и методи.

Таблица S1. Характеристики на субектите.

Таблица S2. Праймери за RT-PCR на миши тъкани.

Таблица S3. Праймери за RT-PCR на човешки подоцити.

Фигура S1. Разтворимите тромбомодулинови фрагменти корелират с TGFb1 и креатинина при пациенти със ЗД.

Фигура S2. Конструкция на човешка TGFb1–бактериална изкуствена хромозома (BAC). Фигура S3. Мишки основатели, експресиращи пълната дължина на човешки TGFb1 ген.

Фигура S4. Характеризиране на гломерул-специфичния трансформиращ растежен фактор b1 трансгенна мишка.

Фигура S5. Човешката TGFb1 трансгенна мишка има повишени маркери за бъбречно увреждане.

Фигура S6. Терапията с рекомбинантен човешки тромбомодулин (rhTM) намалява изтриването на подоцитите и удебеляването на гломерулната базална мембрана.

Фигура S7. TGFb1 трансгенни мишки, третирани с рекомбинантен човешки тромбомодулин (rhTM), имат ниска концентрация на профибротични фактори и HMGB1 в бъбречната тъкан. Фигура S8. Терапията с рекомбинантен човешки тромбомодулин (rhTM) повишава генерирането на активиран протеин С, инхибира системата на комплемента, намалява циркулиращия разтворим подоцин, въпреки че не упражнява ефект върху коагулационната система в TGFb1 трансгенни мишки.

Фигура S9. Терапията с рекомбинантен човешки тромбомодулин (rhTM) намалява концентрацията на подоцин в урината.

Фигура S10. Терапията с рекомбинантен човешки тромбомодулин (rhTM) намалява апоптозата на гломерулните клетки.

Фигура S11. Лечението на бъбречна фиброза, свързана със свръхекспресия на TGFb1-, с рекомбинантен човешки тромбомодулин (rhTM) инхибира апоптозата в бъбречната тъкан.

Фигура S12. Рекомбинантният човешки тромбомодулин (rhTM) повишава експресията на антиапоптотични фактори в подоцитите.

Фигура S13. Рекомбинантният човешки тромбомодулин (rhTM) потиска апоптозата на подоцитите, индуцирана от водороден пероксид.

Фигура S14. Рекомбинантният човешки тромбомодулин (rhTM) потиска апоптозата на подоцитите, предизвикана от високи нива на глюкоза.

Фигура S15. Рекомбинантният човешки тромбомодулин (rhTM) повишава активирането на Akt пътищата в подоцитите.

Фигура S16. Терапията с рекомбинантен човешки тромбомодулин (rhTM) повишава Akt фосфорилирането в подоцити от TGFb1-TG мишки.

Фигура S17. Подоцитите от всяка третирана група мишки експресират GPR15 mRNA.

Фигура S18. Оцветяване на GPR15 в подоцити от здрав индивид и пациент с фокална сегментна гломерулосклероза.

Фигура S19. Рецепторът на фибробластния растежен фактор-1 не участва в инхибиторната активност на рекомбинантния човешки тромбомодулин (rhTM) в подоцитите.

Фигура S20. Рекомбинантният човешки тромбомодулин (rhTM) инхибира епително-мезенхимния преход на подоцитите.

Фигура S21. Терапията с рекомбинантен човешки тромбомодулин (rhTM) инхибира експресията на a-гладкомускулен актин в бъбречните тубули.

Фигура S22. G-протеин свързан рецептор (GPR15) медиира инхибиторната активност на рекомбинантния човешки тромбомодулин (rhTM) върху епителния-мезенхимния преход на подоцитите.

Допълнителни препратки.

ПРЕПРАТКИ

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, et al. Хронично бъбречно заболяване. Ланцет. 2017; 389: 1238-1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M, et al. Оценка на глобалното състояние на здравето на бъбреците. ДЖАМА. 2017; 317: 1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J, et al. Глобално здраве на бъбреците 2017 г. и след това: пътна карта за отстраняване на пропуски в грижите, изследванията и политиката. Ланцет. 2017; 390: 1888–1917.

4. Ackland P. Разпространение, откриване, оценка и управление на хронично бъбречно заболяване. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, et al. Лечение на хронично бъбречно заболяване. Kidney Int. 2012; 81: 351-362.

6. Breyer MD, Susztak K. Следващото поколение терапевтици за хронично бъбречно заболяване. Nat Rev Drug Discov. 2016; 15: 568-588.

7. Liu Y. Бъбречна фиброза: нови прозрения за патогенезата и терапията. Kidney Int. 2006; 69: 213-217.

8. Liu Y. Клетъчни и молекулярни механизми на бъбречна фиброза. Nat Rev Nephrol. 2011; 7: 684-696.

9. Ксавие С, Васко Р, Мацумото К и др. Ограничаването на ендотелното TGF-бета сигнализиране е достатъчно за намаляване на ендотелно-мезенхимния преход и фифиброзата при ХБН. J Am Soc Nephrol. 2015; 26: 817-829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, et al. TGF-бета1/р53 сигнализиране при бъбречна фиброгенеза. Клетъчен сигнал. 2018; 43: 1–10.

11. Конуей Е.М. Тромбомодулин и неговата роля при възпаление. Semin Immunopathol. 2012; 34: 107-125.

12. Мартин FA, Murphy RP, Cummins PM. Тромбомодулин и съдовият ендотел: прозрения във функционални, регулаторни и терапевтични аспекти. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013; 304: H1585–H1597.

13. Morser J. Thrombomodulin свързва коагулацията с възпалението и имунитета. Curr Drug Targets. 2012; 13: 421-431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Тромбомодулинът инхибира активирането на еозинофилите и мастоцитите. Клетъчен имунол. 2015; 293: 34-40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M, et al. Инхибирането на алергичната бронхиална астма от тромбомодулин се медиира от дендритни клетки. Am J Respir Crit Care Med. 2011; 183: 31-42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Двойни модулиращи функции на тромбомодулин в алтернативния път на комплемента. Biosci Trends. 2016; 10: 231-234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Тромбомодулинът модулира дендритните клетки както чрез антагонизъм на протеин B1 с висока подвижност, така и чрез независим механизъм. Allergol Int. 2014; 63: 57-66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, et al. Лектин-подобният домен на тромбомодулина пречи на активирането на комплемента и предпазва от артрит. J Thromb Haemost. 2006; 4: 1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT, et al. Разтворимият тромбомодулин защитава исхемичните бъбреци. J Am Soc Nephrol. 2009; 20: 524-534.

20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K, et al. Лектин-подобният домен на тромбомодулина облекчава диабетната гломерулопатия чрез инхибиране на комплемента. Thromb Haemost. 2012; 108: 1141-1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL и др. Тромбомодулин домейн 1 облекчава диабетната нефропатия при мишки чрез анти-NF-kappaB/NLRP3 възпаление, медиирано от инфламазома, повишаване на антиоксидантната активност на NRF2 и инхибиране на апоптозата. Диабетология. 2014; 57: 424-434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Разтворима тромбомодулинова активност и разтворим тромбомодулинов антиген в плазмата. J Thromb Haemost. 2005; 3: 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. Екзогенно активиран протеин С инхибира прогресията на диабетна нефропатия. J Thromb Haemost. 2012; 10: 337-346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Облекчаване на диабета чрез протеин S. Диабет. 2016; 65: 1940–1951.

25. Хаваси А, Боркан СК. Апоптоза и остро бъбречно увреждане. Kidney Int. 2011; 80: 29-40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK и др. FGFR1 медиира индуцирана от рекомбинантен тромбомодулин домен ангиогенеза. Cardiovasc Res. 2015; 105: 107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S, et al. Петият регион, подобен на епидермален растежен фактор на тромбомодулин, облекчава LPS-индуцирания сепсис чрез взаимодействие с GPR15. Thromb Haemost. 2017; 117: 570-579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W и др. Геномна идентификация на гени, които са от съществено значение за цитоскелетите на подоцитите, въз основа на едноклетъчно РНК секвениране. Kidney Int. 2017; 92: 1119-1129.

29. Vigolo E, Marko L, Hinze C, et al. Каноничното BMP сигнализиране в тубулните клетки медиира възстановяването след остро бъбречно увреждане. Kidney Int. 2019; 95: 108-122.

30. Nangaku M. Хронична хипоксия и тубулоинтерстициално увреждане: последен общ път към краен стадий на бъбречна недостатъчност. J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Хронично бъбречно заболяване и неговите усложнения. Прим Кеър. 2008; 35: 329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA, et al. Бъбречна експресия на фиброзни матрични протеини и изоформи на трансформиращ растежен фактор-бета (TGF-бета) в TGF-бета трансгенни мишки. J Am Soc Nephrol. 1999; 10: 271-280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, et al. Моторният протеин Myo1c регулира бета-сигнализирането на трансформиращия растежен фактор и фиброзата в подоцитите. Kidney Int. 2019; 96: 139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L, et al. Ендотелин рецептор-А медиира разграждането на повърхностния слой на гломерулния ендотел чрез патологично кръстосано взаимодействие между активирани подоцити и гломерулни ендотелни клетки. Kidney Int. 2019; 96: 957-970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY, et al. Увреждане на гломерулни ендотелни клетки и кръстосано говорене при диабетно бъбречно заболяване. Am J Physiol Renal Physiol. 2015; 308: F287– F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA, et al. Модифицирана сканираща електронна микроскопия разкрива патологично пресичане между ендотелни клетки и подоцити в миши модел на мембранопролиферативен гломерулонефрит. Sci Rep. 2018; 8: 10276.

37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D, et al. Проксималните тубулни клетки насърчават фифиброгенезата чрез TGF-бета1-медиирана индукция на перитубулни миофибробласти. Kidney Int. 2002; 61: 2066-2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL, et al. Увреждане на бъбречните тубули: движеща сила към хронично бъбречно заболяване. Kidney Int. 2018; 93: 568-579.

39. Loefffller I, Wolf G. Трансформиращ растежен фактор-бета и прогресията на бъбречно заболяване. Трансплантация на Nephrol Dial. 2014; 29 (допълнение 1): i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S, et al. Уринарен трансформиращ растежен фактор-бета при пациенти с гломерулни заболявания. Педиатр Нефрол. 1997; 11: 334-336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H, et al. Инхибиране на клетъчната апоптоза и облекчаване на белодробната фиброза от тромбомодулин. Am J Pathol. 2017; 187: 2312-2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y, et al. Рекомбинантен човешки тромбомодулин при остра екзацербация на идиопатична белодробна фиброза. Гръден кош. 2015; 148: 436-443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, et al. Тромбомодулин за остри екзацербации на идиопатична белодробна фиброза: доказателство за концепция. Pulm Pharmacol Ther. 2014; 29: 233-240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Оптимален избор на пациенти за антикоагулантна терапия при сепсис: предложение, основано на доказателства от Япония. J Thromb Haemost. 2018; 16: 462-464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X и др. Ролята на групата с висока мобилност кутия 1 (HMGB1) в патогенезата на бъбречните заболявания. Acta Pharm Sin B. 2016; 6: 183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Дозозависими диференциални ефекти на тромбина при алергична бронхиална астма. J Thromb Haemost. 2013; 11: 1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL, et al. Нови прозрения за биологията на подоцитите в гломерулното здраве и заболяване. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Smad-зависими и Smad-независими пътища в TGF-бета фамилното сигнализиране. Природата. 2003; 425: 577-584.

49. Schuster N, Krieglstein K. Механизми на TGF-бета-медиирана апоптоза. Cell Tissue Res. 2002; 307: 1–14.

50. Greka A, Mundel P. Клетъчна биология и патология на подоцитите. Annu Rev Physiol. 2012; 74: 299-323.

51. Isaka Y. Насочване към TGF-бета сигнализиране при бъбречна фиброза. Int J Mol Sci. 2018; 19: 2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK и др. Тромбомодулинът влияе върху преживяемостта на пациенти с неметастатичен колоректален рак чрез преход от епител към мезенхим (EMT). PLoS One. 2016;11:e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B, et al. Тромбомодулинът намалява туморогенния и метастатичен потенциал на раковите клетки на белия дроб чрез регулиране нагоре на Е-кадхерин и понижаване на експресията на N-кадхерин. Biochem Biophys Res Commun. 2016; 476: 252-259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C, et al. Свързаният с G-протеин рецептор 15 медиира ангиогенезата и цитопротективната функция на тромбомодулина. Sci Rep. 2017; 7: 692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH, et al. Рекомбинантният тромбомодулин упражнява антиавтофагично действие в ендотелните клетки и осигурява антиатеросклерозен ефект при мишки с дефицит на аполипопротеин Е. Sci Rep. 2017; 7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B, et al. PI3K/Akt сигнално-медиирана протеинова повърхностна експресия, усетена от 14-3-3 взаимодействащ мотив. FEB J. 2009; 276: 5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. Двойна роля на TGF-beta1 в апоптозата. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 15–34.

58. Griffifin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Активиран протеин С, протеаза-активиран рецептор 1 и невропротекция. Кръв. 2018; 132: 159-169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T, et al. Активираният протеин С предпазва от диабетна нефропатия чрез инхибиране на ендотелната и подоцитната апоптоза. Nat Med. 2007; 13: 1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, et al. Ролята на анафилатоксините в здравето и болестта. Mol Immunol. 2009; 46: 2753–2766.

61. Morigi M, Perico L, Corna D, et al. Блокадата на C3a рецептора предпазва подоцитите от увреждане при диабетна нефропатия. JCI Insight. 2020; 5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, et al. Akt взаимодейства директно със Smad3, за да регулира чувствителността към индуцирана от TGF-бета апоптоза. Nat Cell Biol. 2004; 6: 366-372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Сътрудничество на сигналния път при TGF-бета-индуциран епителен-мезенхимален преход. Curr Opin Cell Biol. 2014; 31: 56-66.

64. Реми I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB/Akt модулира TGF-бета сигнализирането чрез директно взаимодействие със Smad3. Nat Cell Biol. 2004; 6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N, et al. TGF-бета насърчава PI3K-AKT сигнализирането и миграцията на ракови клетки на простатата чрез TRAF6-медиираната убиквитилация на p85alpha. Научен сигнал. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z, et al. Дихотомични ефекти на Akt сигнализиране при рак на гърдата. Мол рак. 2012;11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S, et al. Сигнализацията на FAM83A индуцира епителен мезенхимален преход чрез пътя PI3K/AKT/Snail в NSCLC. Стареене (Albany NY). 2019; 11: 6069-6088.