Днес клетъчното стареене се счита за обща реакция на почти всички видове пролифериращи клетки

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

РезюмеЦеленасоченото елиминиране на стареещите клетки, анализ, е една от основните тенденции в терапията против стареене. Наскоро беше доказано, че сърдечните гликозиди са широкоспектърни сенолитици. Тук тествахме сенолитичните свойства на сърдечните гликозиди спрямо човешки мезенхимни стволови клетки (hMSC). Сърдечните гликозиди нямат сенолитична способност към стареещи hMSCs от различен произход. Използвайки биологични и биоинформатични подходи, ние сравняваме развитието на стареене в „чувствителни към сърдечни гликозиди“ A549 и „нечувствителни“ hMSC. Установено е, че липсата на анализ е медиирана от ефективния внос на калий и повишената резистентност към апоптоза в стареещите hMSC. Отслабването на "антиапоптозната защита" предразполага hMSC към анализ. Разкрихме, че резистентността към апоптоза, призната преди като обща характеристика на стареенето, всъщност не е обща характеристика на стареещите клетки. Освен това, само апоптоза-пролин стареещи клетки са чувствителни към индуциран от сърдечен гликозид анализ. По този начин можем да спекулираме, че ефективността на анализа може да зависи от това дали стареещите клетки наистина стават устойчиви на апоптоза в сравнение с техните пролифериращи двойници.

Ключови думиСтволови клетки. Сенолиза·Стареене·Апоптоза·Устойчивост на стрес

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Въведение

Днес клетъчното стареене се счита за обичайна реакция на почти всички видове пролифериращи клетки, включително ракови и стволови, както и някои постмитотични клетки към различни стресови стимули [1-3]. Следните типове клетъчно стареене могат да бъдат разграничени според произхода на индуциращия фактор: репликативно (поради увреждане на ДНК в скъсените краища на теломерите), индуцирано от онкоген (в отговор на аберантно активиране на онкогенното сигнализиране), индуцирано от стрес ( медиирано от увреждане на ДНК, причинено от оксидативен стрес, топлинен шок, UV и y радиация и т.н.) и индуцирано от химиотерапия (активирано в раковите клетки в отговор на химиотерапевтични лекарства) [4-7]. Има хетерогенност в маркерите, експресирани от стареещи клетки, в зависимост както от типа клетка, така и от инсулт, използван за предизвикване на стареене. Въпреки това, има няколко общи черти, типични за повечето видове стареещи клетки. Основната характеристика на стареенето за всеки вид деляща се клетка е необратимата загуба на пролиферация [8].екстракт от Cistanche tubulosaНеобратимостта на спирането на клетъчния цикъл се контролира от инхибиторите на циклин-зависимата киназа (CDK) pl6 и p21 и често се регулира от туморния супресорен протеин p53 [8,9]. Другите важни характеристики на стареещите клетки са активирането на постоянен отговор на увреждане на ДНК; клетъчна хипертрофия, която често възниква в резултат на нарушена рибозомна биогенеза и протеинов синтез; нарушение на лизозомното разграждане и дисфункция на останалите системи за разграждане; повишена активност на специфичния лизозомален ензим, свързан със стареенето- -галактозидаза; различни митохондриални изменения; придобиване на секреторен фенотип, свързан със стареенето (SASP), съставен от провъзпалителни фактори, ензими, разграждащи матрицата, реактивни кислородни видове и др.; епигенетични и хроматинови ландшафтни промени, включително образуването на свързани със стареенето хетерохроматични огнища и свързано със стареенето разтягане на сателити [8-10]. С други думи, стареещите клетки запазват метаболитната активност и жизнеността, но тяхното функциониране е значително променено в сравнение с клетките на произхода.

Cistanche може да спре стареенето

Сега е ясно, че стареещите клетки могат да променят околната микросреда, засягайки както съседните клетки, така и клетъчните ниши, което може да доведе до неправилно функциониране на тъканите и следователно може да бъде свързано с прогресията на стареенето и свързаните с възрастта заболявания [11,12]. Имайки това предвид, днес повече внимание се фокусира върху стратегиите за целенасочено „убиване“ на стареещи клетки [13-15]. За тази цел активно се развива нов клас лекарства, наречени сенолитици. Сенолитиците са насочени към сигнални пътища, които допринасят за резистентността на стареещите клетки към апоптоза, като по този начин индуцират апоптоза предимно в стареещите клетки [16]. Списъкът на сенолитиците непрекъснато се попълва с нови средства. Най-известните съединения с посочената сенолитична активност са навитоклакс (инхибитор от семейството на Bcl-2), комбинация от дазатиниб (инхибитор на множество тирозин кинази) и кверцетин (естествен флавонол), Hsp90 инхибитори, MDM2 инхибитори, FOXO{ {8}}p53 интерфериращ пептид, деградатор на протеин от семейство BET, uPAR-специфичен CAR-T, галакто-конюгиран навитоклакс и различни сенолитични природни съединения [16-24]. Наскоро, използвайки високоефективен лекарствен скрининг, две независими изследователски групи идентифицираха сърдечните гликозиди, особено уабаин, дигоксин и буфалин, като широкоспектърни сенолитици [25,26].cistanche tubulosa мненияСтрува си да се спомене, че почти всички декларирани сенолитици имат ограничения, като нежелани странични ефекти или неефективност спрямо някои видове клетки. Мезенхимните стволови клетки (MSCs), намиращи се практически във всички постнатални органи/тъкани, се характеризират със способността да се самообновяват (симетрични деления) и да се диференцират, като по този начин допринасят за поддържането и регенерирането на остатъчната тъкан [27]. Благодарение на тези уникални свойства, заедно с мощните противовъзпалителни и имуносупресивни функции, MSCs се прилагат широко в клетъчно-заместваща терапия за лечение на различни заболявания, включително захарен диабет, множествена склероза, миокарден инфаркт и т.н. [28]. Въпреки това, подобно на техните диференцирани потомства и други унипотентни клетки, MSC са в състояние да стареят или репликативно, или преждевременно в отговор на активирането на онкогените и стресиращи стимули [29, 30]. Стареенето на MSC има много нежелани последствия, сред които е изтощението на групата от стволови клетки, намалена поддръжка и регенерация на тъкани, нарушен капацитет за диференциация, SASP-медиирано разпространение на стареене, намалени ангиогенни свойства, модификация на нишата на стволовите клетки [29,31-33]. Като се вземе предвид биологичното значение на правилното функциониране на MSC, стареещите MSC могат да се считат за решаваща цел за анализ. В съответствие с това предложение през изминалата година бяха публикувани редица рецензии, подчертаващи възможни благоприятни резултати от премахването на стареещи MSC [29, 31, 34, 35]. Въпреки това има само няколко експериментални данни относно този проблем [36-40].

В рамките на настоящото проучване ние демонстрираме за първи път, че сърдечните гликозиди, а именно уабаин и буфалин, не успяват да проявят хемолитична активност спрямо човешки MSCs (hMSCs), получени от ендометриума (END-MSCs), мастната тъкан (AD-MSCs), зъбна пулпа (DP-MSCs) и Warton jelly (WJ-MSCs). В допълнение, ние потвърждаваме, че и двата сърдечни гликозида са способни да индуцират апоптоза преференциално в senes-cent A549 и SK-HEP-1, както беше описано по-рано в пилотните проучвания [25,26]. Чрез оценка на промените в йонната хомеостаза, причинени от блокирането на Nat/K плюс -ATPase и нивата на експресия на свързаните гени, ние разкриваме, че отсъствието на уабаин-индуциран анализ може да бъде медиирано от повишената ефективност на компенсаторния K плюс импорт в стареене END- MSCs в сравнение със стареене A549. Освен това, използвайки усъвършенствана биоинформатика, ние демонстрираме, че стареенето на END-MSCs, устойчиви на индуциран от уабаин анализ, е придружено от придобиване на устойчив на апоптоза фенотип, докато стареенето на чувствителен към уабаин A549 не е. Важно е, че блокирането на активността на антиапоптотичния протеин MCL-1 преди лечението със сърдечни гликозиди доведе до анализ на резистентни на апоптоза стареещи END-MSC. Следователно, ние предоставяме ясни доказателства, че резистентността към апоптоза не е обща характеристика на стареещите клетки. Въз основа на получените данни заключаваме, че ефективността на аналитичните подходи може да зависи от това дали клетките наистина са станали устойчиви на апоптоза по време на развитието на стареене.

Материали и методи

клетки

END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549 и SK-Help бяха получени от Руската колекция от клетъчни култури (Институт по цитология, Санкт Петербург, Русия). A549 и SK-Help линиите бяха удостоверени чрез кариология, туморогенност, изоензимни (LDH и G6PD) тестове и STR анализ. Клетките бяха култивирани в пълна среда DMEM F12 (Gibco BRL), допълнена с 10 процента FBS (HyClone), 1 процент пеницилин-стрептомицин (Gibco BRL) и 1 процент глутамин (Gibco BRL). Всички клетки бяха рутинно тествани за заразяване с микоплазма.

Състояния, предизвикващи стареене и стрес

За индуцирано от оксидативен стрес стареене, END-MSCs/WJ-MSCs бяха третирани с 200 uM/100 uM H O (Sigma) в продължение на 1 час. За индуцирано от доксорубицин стареене, DP-MSCs/A549 бяха третирани с 1 μM доксорубицин （Veropharm） в продължение на 3 дни. Във всеки случай клетките се считат за стареещи не по-рано от 14 дни след лечението. За репликативно стареене AD-MSC по-рано от 4-тия пасаж бяха идентифицирани като контролни клетки и по-късно от 10-ия като стареещи. За индуцирано от етопозид стареене A549/END-MSCs/SK-Help бяха третирани с 2 uM/5 uM/3 uM етопозид (Veropharm) в продължение на 3 дни и анализирани не по-рано от 7 дни след индукцията на стареене. В този случай дизайнът на лечението напълно съвпада с тези, описани в проучването, от което произхождат данните от RNA-seq (Wang et al., 2017). Два сърдечни гликозида, които приложихме като сенолитични съединения - Ouabain (Sigma) и Bufalin (Calbiochem).

За да се сравни устойчивостта на стрес между контролните и стареещите END-MSC или A549, клетките бяха третирани или с 400/800 uM H O2 (Sigma) за 1 час, или с 0,3/1 uM ставроспорин (Sigma). Клетъчната жизнеспособност се анализира 48 часа след индуцирането на стрес.

За блокиране на активността на MCL-1 END-MSC бяха предварително третирани с 10 uM A-1210477(Sigma) в продължение на 3 дни.

Анализ с поточна цитометрия

Измерванията на клетъчната жизнеспособност, пролиферацията, размера на клетката, автофлуоресценцията, скоростите на апоптоза, разцепването на каспаза 3/7, потенциала на митохондриалната мембрана и деполяризацията на мембраната бяха извършени чрез поточна цитометрия. Проточната цитометрия беше извършена с помощта на CytoFLEX (Beckman Coulter) и получените данни бяха анализирани с помощта на софтуер CytExpert версия 2.0. Прилепналите клетки се промиват два пъти с PBS и се събират чрез трипсинизация. Отделените клетки се събират и ресуспендират в прясна среда и след това се преброяват и анализират за автофлуоресценция. За да се получи достъп до жизнеспособността на клетките, 50 ug/ml пропидиев йодид （Life Technologies） се добавя към всяка проба непосредствено преди анализа. Размерът на клетката се оценява чрез цитометрично разсейване на светлината напред на PI-отрицателни клетки. Индукцията на апоптоза беше потвърдена с помощта на съвместно оцветяване с Annexin-V-APC (Invitrogen) и DAPI (Sigma), следвайки инструкциите на производителя. Активността на каспазата беше оценена с помощта на CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen), следвайки протокола на производителя. Загубата на потенциала на митохондриалната мембрана беше оценена с помощта на съотношителното багрило JC-1 (Invitrogen). Процедурата на оцветяване се провежда в съответствие с протокола на производителя. За деполяризация на мембраната използвахме DiBAC4 (3) флуоресцентна сонда (Invitrogen).

Оцветяване с галактозидаза, свързано със стареенето

Свързаното със стареенето -галактозидаза (SA- -Gal) оцветяване беше извършено с помощта на комплект за оцветяване със стареене -галактозидаза (Cell Signaling Technology) съгласно инструкциите на производителя. Количественият анализ на изображенията беше произведен с приложението на пакета MatLab, съгласно алгоритъма, описан по-рано [41]. За всяка експериментална точка бяха анализирани не по-малко от 50 произволно избрани клетки.

Western blotting

Уестърн блотинг се извършва, както е описано по-рано [41]. SDS-PAGE електрофореза, прехвърляне към нитроцелулозна мембрана и имуноблотинг с ECL (Thermo Scientific) откриване бяха извършени съгласно стандартните протоколи на производителя (Bio-Rad Laboratories). Използвани са антитела срещу следните протеини: глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH)(клон 14C10), фосфо-p53(Ser15), p21(клон 12D1), фосфо-Rb (Ser807/811) , HMGB1 (клонинг D3E5), както и кози антизаешки IgG, конюгиран с пероксидаза от хрян. Степента на разреждане е 1:1000 за всички първични антитела и 1:7000 за вторичните. Всички антитела са закупени от Cell Signaling. Scion Image 4.0 (Scion Corporation) беше използван за избор и определяне на извадената от фона плътност на лентите във всички гелове и петна.

Транскриптомен анализ

В анализа бяха използвани проби от следните три набора от данни Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 и GSM2742121-GSM2742122за контролни и стареещи клетки A549, съответно); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 и GSM3454500-GSM3454502 за контролни и стареещи IMR-90 клетки, съответно); и нашия набор от данни GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 и GSM4877907-GSM4877910 съответно за контролни и стареещи END-MSC). Данните за всички набори от данни бяха обработени по един и същи начин.

Суровите данни за четене преминаха качествено филтриране и изрязване на адаптера чрез FilterByTile и BBDuk скриптове от пакета BBtools (версия 38.75), като се използват опциите по подразбиране. Останалите показания бяха допълнително филтрирани и подрязани с помощта на скрипт за тримесечие от пакета FastqPuri (версия 1.0.7).cistanche ВеликобританияОперацията за подрязване беше приложена и за двата края на четенията, ако те съдържаха N или качеството им беше под прага на качеството, зададен на 27, всички четения, по-къси от 25 бази, бяха отхвърлени. Качественият контрол на изрязването се проведе със софтуера FastQC (версия 0.11.7) и скриптове FastqPuri. Четенията, преминали през всички операции, съдържат не по-малко от 90 процента от първоначалните данни.

Изобилието на транскрипт беше оценено с помощта на лекото картографиране на Salmon (версия 1.1.0), работещо в режим на селективно подравняване. Списъкът с примамки беше генериран въз основа на човешкия референтен геном на Gencode GRCh38.p13 (издание 33) и използван по-нататък за изграждане на индекс върху референтни файлове на Gencode с конкатениран транскриптом и геном (издание 33), като се използва kmer размер 21. Операциите по картографиране бяха извършени с допълнителни флагове——numBootstraps 30——пайети——gcBias——валидиране на съпоставяния. Получените нива на картографиране бяха около 70 процента.

Допълнителна обработка на данни беше извършена с помощта на R версия 3.6.3 с колекцията от пакети Tidyverse (версия 1.3.0). Приблизителният брой на гените, метаданните и диапазоните на транскриптите бяха заредени в R и обобщени до генно ниво с помощта на tximeta (версия 1.4.5). Получената матрица за преброяване беше филтрирана, за да съдържа редове с най-малко 5 приблизителни преброявания във всички проби, получената матрица съдържаше 20 400 гена.

За представянето на PCA и топлинна карта, броят на четенията беше нормализиран с помощта на трансформация на журнал от пакета DESeq2 (версия 1.26.0).cistanche wirkungТоплинните карти бяха конструирани с помощта на пакети за генен филтър (версия 1.38.0) и топлинна карта (версия 1.0.12)R. Валидирането на проби от разделяне по променлива за стареене беше проведено чрез подмножество на нормализирания брой четения от гени, свързани с термина на генната онтология „Клетъчно стареене“ (GO 0090398). Анализът на диференциалната експресия и оценката на промените в логаритмичното сгъване бяха изчислени с помощта на DESeq2 за последната променлива във формулата на дизайна, контролираща статуса на стареене на клетките, реакцията на лечение с уабаин и взаимодействието на посочените фактори. За да се засили тестването на диференциалното изразяване, беше приложена корекция на промяната на логаритмичното сгъване с помощта на комбинация от адаптивен оценител на свиване от пакета palm (версия 1.8.0) и определянето на допълнителен праг на промяна на логаритмичното сгъване, равен на 0,667. Получените свити оценки бяха използвани допълнително за класиране на гени и провеждане на анализ на обогатяване на набор от гени, използвайки клъстерен профил (версия 3.14.3) и предпазител (версия 1.12.0)R пакети с p стойности, коригирани за множество сравнения съгласно метода на Benjamin-Hochberg. Пробите от микрочипове на Affymetrix за контролни и сенесцентни AD-MSC бяха получени от базата данни GEO (GSE66236) и обработени с уеб приложение Phantasus с нормализиране на log2 и квантилен брой. Анализът на обогатяване на набор от гени беше извършен с помощта на предпазител (версия 1.12.0)R пакет.

Екстракция на РНК, обратна транскрипция и PCR в реално време

Екстракцията на РНК, обратната транскрипция и PCR в реално време бяха извършени, както е описано в нашето предишно проучване [32]. Реагенти за РНК екстракция (ExtractRNA реагент), обратна транскрипция (MMLV RT kit) и PCR в реално време (HS SYBR kit) са получени от Evrogen. Нивата на генна експресия бяха оценени с помощта на PCR в реално време BioRad CFX-96 усилвател (BioRad) със следната работеща програма за всички изследвани гени: 40 цикъла на топене за 10 s при 95 градуса, отгряване за 15 s при 57,5 ​​градуса и синтез за 15 s при 72 градуса. Анализът на кривите на топене беше приложен за контрол на специфичността на реакциите. Следващият анализ на получените данни беше извършен с помощта на софтуера Bio-Rad CFX Manager (BioRad) със стандартния 2deltaCt метод за количествено определяне с използване на GAPDH експресия като еталон. Последователностите на праймерите са изброени в Таблица 1.

Статистически анализ

За да се получи значимостта на разликата между двете групи, беше приложен t-тест на Student или t-тест на Welch. За множество сравнения между групите беше използвана ANOVA с HSD на Tukey. Освен ако не е посочено друго, всички количествени данни са показани като средна стойност ± SD и звездичките показват значителни разлики, както следва: ns, не е значимо, *p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Резултати

Третираните с H2O2- END-MSC влизат в преждевременно стареене

В рамките на настоящото проучване използвахме човешки мезенхимни стволови клетки, изолирани от десквамиран ендометриум (END-MSCs), които отговарят на минималните критерии, предложени от ISCT за определяне на hMSCs [41]. Преди това разработихме надежден експериментален модел за изследване на различни аспекти на преждевременното стареене на END-MSC [30]. А именно, ние показахме, че END-MSCs, подложени на сублетален оксидативен стрес, постепенно придобиват всички типични характеристики на стареещите клетки, включително персистиращи огнища на увреждане на ДНК и активен отговор на увреждане на ДНК, необратимо спиране на клетъчния цикъл, медиирано от класическия p53/p21/Rb път, загуба на пролиферация, клетъчна хипертрофия, поява на SA- -Gal оцветяване и развитие на секреторен фенотип, свързан със стареенето [30, 32, 42]. Тук приложихме проектирания модел за изследване на сенолитичния ефект на уабаин, както и за разкриване на основните вътреклетъчни промени в йонната хомеостаза. Първоначално, чрез оценка на най-често срещаните параметри, ние потвърдихме, че лечението с единична доза (1 час, 200 μM) с H O е достатъчно, за да предизвика стареене в END-MSC. Важно е, че стресираните END-MSC се считат за стареещи две седмици след оксидативния стрес; следователно, всички маркери за стареене са оценени не по-рано от 14 дни след лечението с H-Oz. Наистина, лечението с H-Oz на END-MSC води до блокиране на пролиферацията, клетъчна хипертрофия, както е показано от увеличения размер на клетката, натрупване на липофусцин, установено чрез повишаване на автофлуоресценцията, поява на SA- -Gal, активиране на p21/Rb пътят и загубата на HMGB1 заедно поддържат установяването на стареене при избраните експериментални условия (фиг. ac, e, f).

Смята се, че най-вредните ефекти на стареещите клетки на тъканно и организмово ниво са следствие от тяхната продължителна жизненост. В съответствие с тази точка, третираните с HO? END-MSC запазват висока жизнеспособност дори в късните етапи на развитие на стареене (жизнеспособността на стареещите END-MSCs се оценява 17 дни (14 дни + 3 дни) след първоначалния оксидативен стрес) (фиг. 1d ). За да обобщим, сублеталното лечение с HO2- на END-MSCs е подходящият модел на преждевременното стареене и е от значение за изследване на ефектите на сенолитичните съединения върху END-MSCs.

Сърдечният гликозид уабаин няма сенолитична активност спрямо стареещи END-MSC в широк диапазон на концентрация

Последните данни сочат, че сърдечните гликозиди, включително уабаин, дигоксин и буфалин, представляват семейство съединения с хемолитична активност [25,26]. Въпреки че днес сърдечните гликозиди се считат за широкоспектърни сенолитици, липсват данни относно техните ефекти върху стареещите hMSCs. Следователно тук тествахме дали уабаинът има потенциала да индуцира смърт селективно в стареещи END-MSC. За да направим това, ние оценихме жизнеспособността на контролните и стареещите END-MSC след третиране с уабаин в широк диапазон на концентрация (от 10-' до 10~ M). Интересно е, че нито една от приложените концентрации не доведе до забележимо намаляване на жизнеспособността както на контролните, така и на стареещите клетки на първия ден след прилагането на уабаин (Фигура 2 и допълнителна фигура S1).

Въпреки това, на третия ден след лечението с уабаин, ние разкрихме значителен зависим от дозата спад в жизнеспособността на контролните END-MSC (фиг. 2а и допълнителна фигура S1). Неочаквано стареещите клетки се оказват по-устойчиви на уабаин при всяка тествана концентрация. В съответствие с този резултат, 10-M ouabain доведе до по-склонна апоптотична смърт в контролните клетки (20,75 процента An плюс /PI-и 36,47 процента An плюс /PI плюс ) в сравнение със стареещите (15,01 процента An＋/PI -и 12,15 процента An плюс /PI плюс )(Фиг.2b). Получените резултати ясно показват, че в контекста на стареещи END-MSCs ouabain няма сенолитична активност.

За да изключим възможни ефекти, свързани с променливостта на стимули, предизвикващи стареене, върху сенолитичното действие на уабаин, ние проведохме допълнителен набор от експерименти. А именно, ние третирахме END-MSC с етопозид вместо оксидативен стрес, за да предизвикаме преждевременно стареене.цитрусови биофлавоноидиТретираните с етопозид END-MSC показват всички характеристики, типични за стареещите клетки (фиг. 3a-e).

Важно е, че уабаин няма хемолитично действие спрямо третирани с етопозид стареещи END-MSCs (фиг. 3f и допълнителна фигура S2). Тези данни осигуряват допълнително потвърждение за горните резултати и доказателство, че липсата на индуциран от уабаин анализ не е следствие от конкретното задействане на стареенето, използвано за предизвикване на стареене.

Фиг.1 Валидиране на модел на преждевременно стареене на END-MSCs, предизвикан от оксидативен стрес. Стареещите END-MSCs a хлабава пролиферация, b претърпяват хипертрофия, c придобиват повишена автофлуоресценция, запазват висока жизнеспособност на клетките d и e показват SA- -Gal активност в сравнение с контролните. f Нива на фосфорилиране на p53 и Rb и нива на експресия на p21 и HMGBI протеини в контролни и стареещи END-Ouabain няма хемолитично действие спрямо човешки мезенхимни стволови клетки от различен произход За да разширим нашите наблюдения относно липсата на индуциран от ouabain анализ в END-MSCs , анализирахме ефектите на уабаин върху hMSCs, изолирани от други източници, включително мастна тъкан, зъбна пулпа и желе на Wharton. За да подсилим допълнително нашите данни, ние приложихме различни модели на стареене - репликативно стареене за AD-MSCs, предизвикано от доксорубицин стареене за DP-MSCs и предизвикано от оксидативен стрес стареене за WJ-MSCs (фиг.4a-f).

Както е показано на Фигура 4g, различните типове hMSC се различават по жизнеспособността при лечение с уабаин, например, както контролните, така и стареещите DP-MSC са много по-устойчиви на действието на уабаин, отколкото WJ-MSC (Фигура 4g и допълнителна фигура S3b, ° С). Въпреки това, ouabain не е в състояние да индуцира сенолиза в двата вида стареещи hMSCs (фиг. 4g и допълнителна фигура S3). Заедно получените данни показват, че липсата на индуциран от уабаин анализ е обща характеристика за различни видове hMSC. MSC. Представените стойности са средни ± SD. За множество групови сравнения при a и d беше приложена еднопосочна ANOVA, n=3, ns незначително,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH се използва като контрола на натоварването

Сърдечният гликозид буфалин не успява да убие стареещите END-MSCS

За да проверим липсата на сенолитично действие на сърдечните гликозиди спрямо hMSCs, ние приложихме буфалин, друго съединение с посочената сенолитична активност, принадлежащо към семейството на сърдечните гликозиди [25]. Буфалин няма почти никакъв ефект върху жизнеспособността на контролните и третирани с H2O2- старещи END-MSCs в широк диапазон на концентрация (от 10-7 до 10-5 M) (фиг. 5а и допълнителна Фиг. S4a).

Подобно на това, което наблюдавахме при лечението с уабаин, липсата на анализ върху буфалин беше независима от стимули, предизвикващи стареене, тъй като жизнеспособността на ESCs, които старееха или в отговор на оксидативен стрес, или на етопозид, не беше засегната (фиг. 5a, b, допълнителна фигура S4a, b). Резултатите, описани по-горе, потвърждават, че сърдечните гликозиди са се оказали неефективни за целенасочена индукция на смърт при стареещи END-MSC. MSC. Представените стойности са средни ± SD. За множество групови сравнения при a и d беше приложена еднопосочна ANOVA, n=3, ns незначително,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Сърдечният гликозид буфалин не успява да убие стареещите END-MSCS

За да проверим липсата на сенолитично действие на сърдечните гликозиди спрямо hMSCs, ние приложихме буфалин, друго съединение с посочената сенолитична активност, принадлежащо към семейството на сърдечните гликозиди [25]. Буфалин няма почти никакъв ефект върху жизнеспособността на контролните и третирани с H2O2- старещи END-MSCs в широк диапазон на концентрация (от 10-7 до 10-5 M) (фиг. 5а и допълнителна Фиг. S4a).

Подобно на това, което наблюдавахме при лечението с уабаин, липсата на анализ върху буфалин беше независима от стимули, предизвикващи стареене, тъй като жизнеспособността на ESCs, които старееха или в отговор на оксидативен стрес, или на етопозид, не беше засегната (фиг. 5a, b, допълнителна фигура S4a, b). Резултатите, описани по-горе, потвърждават, че сърдечните гликозиди са се оказали неефективни за целенасочена индукция на смърт при стареещи END-MSC.

Фиг.2 Ouabain няма хемолитична активност спрямо третирани с HO2- стареещи END-MSCs в широк диапазон на концентрация. Относителна клетъчна жизнеспособност (процент) на контролните и стареещите END-MSC за 3 дни след третиране с 1077,10~6,10-5 M ouabain. b Индукция на апоптоза в END-MSC върху 10-6 M mouabain, оценена чрез двойно оцветяване с Анексин V/DAPI. n=3 независими експеримента. Всички данни съответстват на средната стойност ± SD. Статистическата значимост беше оценена чрез t-теста на Welch: ns не е значим,***p<>

И двата сърдечни гликозида уабаин и буфалин са способни да индуцират клетъчна смърт селективно в стареещи A549 и SK-Hep1 клетки

Като вземем предвид факта, че нашите резултати не съответстват на наскоро публикуваните доказателства относно широкоспектърното сенолитично действие на сърдечните гликозиди, ние решихме да възпроизведем този ефект, като използваме клетъчния модел, описан в съответните проучвания [25,26]. По този начин, ние проведохме серия от експерименти, използвайки контролни и стареещи A549 белодробни карциномни клетки. Стареенето в клетки A549 се индуцира чрез лечение с етопозид. Индуцираното от етопозид стареене на A549 клетки е често използван и следователно добре характеризиран модел на индуцирано от терапия стареене [4]. Също така беше показано, че уабаин селективно убива стареещи A549 клетки, третирани с етопозид [25]. За да докажем стареенето в A549, ние оценихме скоростта на пролиферация, размера на клетките, натрупването на липо-фини, SA- -Gal оцветяване, статуса на активиране на p53/p21/Rb пътя и нивото на експресия на HMGB1 (фиг. 6a-e).

За да проверим хемолитичната активност на уабаин към стареещи ракови клетки, първо оценихме зависимата от дозата жизнеспособност на клетките. В съответствие с нашите резултати, описани по-горе, не успяхме да открием значителен спад в броя на жизнеспособните контролни или стареещи A549 клетки в рамките на 24 часа след прилагането на уабаин (допълнителна фигура S5a). Въпреки това, за 3 дни след лечението ouabain значително намалява жизнеспособността на стареещите A549 клетки по дозозависим начин, докато броят на контролните A549 клетки намалява в много по-малка степен (Фигура 7а и допълнителна фигура S5a). А именно, приблизително 90 процента от контролните клетки запазват жизнеспособността при 10- M ouabain в сравнение с 50 процента от стареещите A549 клетки, третирани със същата доза (Фигура 7а). Нещо повече, стареещите A549 клетки са по-склонни към индуцирана от буфалин клетъчна смърт, отколкото техните контролни двойници (Фигура 7b) (Фигура 5b и допълнителна фигура S5b).

Според публикуваните данни уабаинът предизвиква каспаза-3-зависима апоптоза в стареещи A549 клетки [26]. Наистина, ние разкрихме значително увеличение на двойната положителна и/или PI-фракция в стареещи ракови клетки, третирани с 10-6M ouabain (Фигура 7c). Освен това, използвайки флуоресцентен анализ, ние наблюдавахме активиране на каспаза -3 в третирани с уабаин стареещи A549 клетки (фиг. 7d). Взети заедно, тези резултати напълно съответстват на данните, описани от други автори, и потвърждават хемолитичната активност на уабаин спрямо А549.

Също така използвахме доксорубицин вместо етопозид, за да предизвикаме стареене в A549 (фиг.8a-e). Както се очакваше, третираният с доксорубицин стареещ A549, както и третираният с етопозид демонстрираха по-висока чувствителност както към уабаин, така и към буфалин в сравнение с техните контролни аналози (Фиг. 8g и Допълнителна Фигура S6). Последното потвърждава, че сенолитичните ефекти на сърдечните гликозиди са независими от стимулите, предизвикващи стареене. По този начин сърдечните гликозиди наистина имат сенолитик

Фиг.3 Ouabain не е в състояние да индуцира сенолиза в третирани с етопозид стареещи END-MSC. Валидиране на модела на индуцирано от епизод стареене за END-MSC: способност за пролиферация, размер на b клетка, c нива на автофлуоресценция и d SA- -Gal активност, e ниво на фосфорилиране на Rb и нива на експресия на p21 и HMGBI протеини. f Относителна клетъчна жизнеспособност (процент) на контролните и стареещите клетки след третиране с 10-6 ouabain. Стойностите са средни ± SD. За множество групи бяха приложени сравнения при еднопосочен ANOVA, n=3, ns незначително,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Накрая решихме да възпроизведем експерименти за анализ на третирани с етопозид клетки на рак на черния дроб SK-Help, друг клетъчен модел с доказани сенолитични ефекти на сърдечните гликозиди според Guerrero et al. проучване [25] (фиг.9a-e). Третираният с етопозид сенесцентен SK-Help демонстрира по-висока чувствителност към двата агента в сравнение с техните контролни аналози, доказвайки хемолитичното действие на сърдечните гликозиди спрямо този тип клетки (Фигура 9f и Допълнителна фигура S7).

Заедно тези данни доказват, че селективността на хемолизата, предизвикана от сърдечни гликозиди, разчита повече на клетъчната природа, отколкото на конкретния тригер на стареене.

Тази статия е извлечена от Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x