Толерантността към NADH/NAD плюс дисбалансът предвижда стареене и интервенции против стареене

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

РЕЗЮМЕ

Редокс двойките координират клетъчната функция, но последствията от техните дисбаланси са неясни. Това донякъде е свързано с ограниченията на тяхното експериментално количествено определяне. Тук ние заобикаляме тези трудности, като представяме подход, който характеризира базираните на фитнес профили на толерантност към дисбаланси на редокс двойки, използвайки силиконово представяне на метаболизма. Фокусирайки се върху редокс двойката NADH/NAD1 в дрождите, ние демонстрираме, че редуктивното неравновесие генерира метаболитни синдроми, сравними с тези, наблюдавани в раковите клетки.ползи от екстракта от цистанчеТолерантността на дрождевите мутанти към редокс неравновесието може също да обясни 30 процента от променливостта в техния експериментално измерен хронологичен живот. Освен това, като прогнозираме значението на някои метаболити за подпомагане на дисбалансите, ние правилно идентифицираме хранителните вещества, които са в основата на механизмите на патологията, молекулите, защитаващи продължителността на живота, или миметиците за ограничаване на калориите. По този начин толерантността към редокс дисбаланси се превръща в звук, осигуряващ рамка за разпознаване на свойствата на фенотипа на стареенето, като същевременно е в съответствие с биологичната обосновка за оценка на интервенциите против стареене.

ВЪВЕДЕНИЕ

Изследванията върху редокс хомеостазата се разшириха значително през последните две десетилетия, непрекъснато прекроявайки класическите представи за оксидативно клетъчно увреждане (Halliwell and Gutteridge, 2015). Сред най-парадигматичните молекулни агенти, лежащи в основата на тази хомеостаза, се появяват съотношенията на редокс двойки, като тези на конюгираните форми на глутатион, NADPH и NADH. Както глутатионът, така и NADPH действат като основни механизми за почистване на реактивни кислородни видове (ROS) в митохондриите, докато NADPH и NADH свързват съответно анаболни и катаболни пътища с редокс състоянието на клетката.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Въпреки това продължават да се разпознават нови механизми, свързващи двойките NADPH/NADP* и NADH/NAD* с редокс хомеостазата. Например, балансът на NADPH/NADP плюс частично обяснява последиците за оцеляването на AMP-активирана протеин киназа (She et al., 2014). Също така, той свързва циркадното отчитане на времето с редокс състояния (Rey et al., 2016). Понастоящем се смята, че съотношението NADH/NAD плюс участва в координирането на митохондриалната и ядрената функция, епигенетичната регулация на възстановяването на ДНК и клетъчната идентичност и настройката на енергийния метаболизъм към променливите на околната среда (Canto et al., 2015; Gomes et др. 2013 г.). При непатологични състояния, съотношението NADH/NAD* варира в зависимост от напрежението на кислорода, като хипоксичните условия и по-високата наличност на кислород съответно се появяват съвместно с редуктивни и окислителни отклонения (Clanton, 2007; Graef et al., 1999).

Но нарастващият интерес към съотношенията на редокс двойките идва главно от техните последици в патологията.цистанче чингис ханПоявата на ROS както в редуктивните (хипоксични, склонни към NADH), така и в окислителните (хипероксични, склонни към NAD плюс) сетива е свързана с отклонения от оптималния редокс потенциал, който осигурява най-доброто представяне на митохондриите (Aon et al., 2010). ; Клантън, 2007). По отношение на рака, намаленият NADH/NAD плюс може да е в основата на смъртността на глиобластомите (Gujar et al., 2016) и да насърчи прогресирането на рак на дебелото черво (Hong et al., 2019), но също така може да спаси някои здрави фенотипове в различна степен в клетки от други видове тумори (Garrido and Djouder, 2017).

Cistanche може да спре стареенето

NADH също се превърна в обект на интерес в биологията на Торонто. В този контекст, увеличаването на набора NAD плюс доведе до частично обръщане на стареенето и други свързани патологични фенотипове в организмите (Das et al., 2018; Mendelsohn and Larrick, 2014; Wei et al., 2017; Zhu et al. , 2017) и е установено, че стареещите и неопластични клетки представят дисбаланси на съотношението NADH/NAD плюс (Braidy et al., 2011; Schwartz and Passonneau, 1974; Wiley et al, 2016). Освен това, новооткритите роли на NADPH и възникващата концепция за NADH/NADH като главен регулатор на редокс хомеостазата и стареенето са в съответствие с теорията за метаболитната стабилност на стареенето (Demetrius, 2004). Тази теория предполага, че причината за стареенето е уязвимостта на стационарните нива на редокс двойките към произволни екологични смущения върху скоростта на ензимната реакция и прави няколко интересни прогнози, които се отнасят за хората.

Като се имат предвид всички тези последици, много проучвания са изследвали феноменологията на съотношенията на редокс двойки или чрез пасивно отчитане на техните нива, или чрез активното им модифициране. Експерименталните манипулации обаче са предизвикателство. Най-традиционните обвиняват дълбоки експериментални предупреждения (Sun et al., 2012), а по-новите все още пропускат определени биологични обстоятелства поради това, че са ограничени до температурни и pH интервали (Hung et al., 2011; Zhao et al., 2015). Освен това е експериментално скъпо да се наблюдава широк спектър от фенотипове след промяна на коензимните пулове чрез добавяне на метаболит (Hou et al., 2010) и мутации или свръхекспресия на ензими, консумиращи NAD(H) (Bait al., 2011; Felipe et al., 1998). Следователно има нужда от алтернативни стратегии за справяне с контрола на редокс хомеостазата чрез манипулиране на редокс двойки, както и нашето разбиране за биологичните последици от този контрол.

In silico моделите се превръщат в практическа изследователска стратегия, когато експерименталните подходи са ограничени, с предимството да позволяват пълно механично отчитане на наблюдаваните явления. Метаболитни модели в геномен мащаб, които могат да бъдат изследвани чрез анализ на баланса на потока (FBA) (Orth et al, 2010) се превърнаха в стандарт в системната биология за изучаване на последствията от метаболитни смущения върху клетъчната функция (методи S1). Наред с други приноси, те са подпомогнали откриването на нови антибиотици и химиотерапевтици, дизайна на бактериални щамове, оптимизирани за промишлено производство на вещества, представляващи интерес, и по-доброто разбиране на човешките метаболитни заболявания (Burgard et al., 2003; Pagliarini et al. 2016; Раман и др., 2009). Използването на FBA има допълнителното предимство да предоставя представа за метаболитните явления без влиянието на неметаболитни объркващи фактори (генетични, епигенетични, механични и др.). По този начин метаболитните модели в геномен мащаб са особено подходящи за изследване на метаболитните последици от отклонения от редокс хомеостазата.

Тук използваме FBA, за да изследваме баланса на редокс двойките при реконструкция в геномен мащаб на едноклетъчния еукариот Saccharomyces cerevisiae, при което характеризираме метаболитните и свързаните с дълголетието последствия от контролирано смущение на наличния NADH/NAD плюс поток през различни генетични фонове. По-конкретно, нашите резултати разкриват, че толерантността към този дисбаланс води до специфично метаболитно пренасочване, напомнящо за патология, и също така обяснява повече от една четвърт от вътрешноспецифичната променливост в постмитотичния живот. В допълнение, тази рамка ни помага да очертаем изчислителен протокол (който също прилагаме към животински и човешки метаболитни модели) за идентифициране на метаболити и ензими с потенциал като терапевтични цели в контекста на свързани с възрастта патологии.

РЕЗУЛТАТИ

Профил на толерантност, базиран на фитнес, характеризира смущенията на редокс двойката

За да представим дисбаланс между конюгатните форми на редокс двойка, ние включихме изкуствена обратима реакция - "реакцията на дисбаланс" - в реконструкцията на геномния мащаб на съответната метаболитна мрежа (STAR ​​методи). Реакцията окислява или редуцира двойката, като взема предвид специфични клетъчни отделения (напр. цитозол, митохондрии и т.н.) и нейната активност може да бъде фиксирана на всяка желана стойност на скоростта. За всяка от тези стойности може да се изчисли скорост на растеж ("годност"), която действа като заместител на толерантността на клетката на дрождите към това конкретно състояние. И накрая, профилът на толерантност се определя чрез изчисляване на скоростта на растеж за диапазон на стойностите на дисбаланс (Фигура 1А; имайте предвид, че редуктивните/окислителните условия са представени съответно в синьо/червено в целия ръкопис).

Профилите на толерантност обикновено показват максимален ръст около точката на нулевия дисбаланс, като грубо всяко отклонение (т.е. ненулевата стойност на реакцията) води до намалена годност. Това подчертава факта, че за да работи метаболизмът, активността на реакциите, които настройват съотношението на редокс двойка в един смисъл, трябва да бъде пропорционална на активността на тези, които го настройват в другия. По-конкретно, цитозолните дисбаланси на NADH/NADt в S.Cistanche удължаване на животаcerevisiae, растящи върху глюкоза и аеробни условия, дават профил с максимален растеж, значително изместен към окислителната страна в точка от профила на дисбаланс, където ~50 mmol/DW/час NADH се превръщат в NADH (Фигура 1B). Когато вместо това разглеждахме дисбаланса в митохондриите, наблюдавахме максимум в точката на нулев дисбаланс (Фигура 1C), модел, който наблюдавахме по подобен начин в други профили (Фигура S1). Като цяло стават редуктивни условия

Фигура 1. Профилът на толерантност характеризира реакцията към редокс дисбаланси

(А) Отгоре. Въведохме изкуствена реакция в модела на метаболитна реконструкция на организъм (в този случай дрожди) за взаимно преобразуване на двете конюгирани форми на редокс коензим (тук двойката NADH/NADH). При всяка поредица от условия на дисбаланс, т.е. стойности на скоростта на изкуствената реакция, ние прилагаме анализ на баланса на потока, за да изчислим скоростта на растеж. Отдолу. Прогнозираните стойности на растеж се нанасят спрямо стойностите на скоростта на дисбаланса, който очертава профила на толерантност; заместител на толерантността на метаболизма, когато е изправен пред избраното смущение.цистанче нз(B) Профил на толерантност в дрожди, свързан с дисбаланси, разположени в цитозола.

(C) Профил на толерантност в дрожди, свързан с дисбаланси, разположени в митохондриите. Синьото/червеното оцветяване представлява режими на намален и окислен дисбаланс, съответно, а сивите точки показват стойности, съответстващи на липса на дисбаланс или екстремни редуктивни/окислителни дисбаланси, които не предизвикват растеж. вредни и смъртоносни по-бързо от окислителните режими. В два случая (конюгираните двойки цитозолен NADH или митохондриален тиоредоксин), лекото изкуствено окисляване на двойката подобрява растежа (Фигура S1).

Нарушенията на NADH/NAD* причиняват метаболитни синдроми, които напомнят за патология

Енергийният метаболизъм на дрождите без дисбаланс съответства на характерен аеробен метаболизъм в присъствието на глюкоза (изследваните условия на растеж), при който гликолизата е свързана с цикъла на трикарбоксилната киселина (TCA) и окислителното фосфорилиране. Пътят на пентозофосфата окислява глюкозата и осигурява рибоза-5P за нуклеотиден синтез и родена от NADPH редуктивна сила за анаболизъм, докато анаплеротичните пътища напускат цикъла на TCA, подобно на тези на метаболизма на глутамин, се използват умерено за основно захранване на пиримидин и синтез на аминокиселини. FBA ни позволява да определим количествено промените в тези пътища и как те в крайна сметка детайлизират метаболитните характеристики, лежащи в основата на всеки конкретен режим на дисбаланс.

По-конкретно, Фигура 2А показва как редуктивните дисбаланси на цитозолния NADH/NADH предизвикват увеличаване на гликолитичния поток, намаляване на активността на TCA цикъла и веригата за транспортиране на електрони и повишаване на метаболизма на глутамин. Този псевдохипоксичен метаболитен подпис - в присъствието на кислород - наподобява анаеробния метаболизъм, където гликолизата е съчетана с алкохолна или млечна ферментация в ущърб на митохондриалните пътища; кислородната част от пътя на пентоза фосфата се изключва и метаболизмът на глутамин, по-активен, може да бъде пренасочен към производството на пируват в допълнение към допринасянето за анаболизма. Трябва да се отбележи, че този фенотип улавя някои характеристики на парадоксалния метаболизъм на добива, наблюдаван в различни видове ракови клетки (ефектът на Warburg) (Potter et al., 2016).

Фигура 2. Потоци на основните пътища за управление на енергията, лежащи в основата на профила на толерантност в дрожди (A) Цитозолен NADH/NAD дисбаланс (горе) и стойности на потока на пет представителни пътя (отдолу); i/гликолиза (гликолиза, ядро), ii/цикъл на Кребс (TCA, розово), ili/пентозен фосфат (Penphos, зелено), iv/окислително фосфорилиране (Oxphos, сиво) и метаболизъм на глутамин (глутамин, лилаво). Представените вектори на потока са резултат от осредняване на потока на всички реакции на конкретния път.

(B) Същото като (A) по отношение на митохондриалния дисбаланс. Обърнете внимание на наличието на отрицателни потоци в гликолизата (панел А, отдолу) представлява повишена глюконеогенеза. Вижте основния текст за подробности.

Обратно, енергийният метаболизъм, лежащ в основата на окислителната толерантност (по отношение на цитозола, Фигура 2А), показва по-аеробна конфигурация, но с особености, като например особено активен полиаминов метаболизъм; и екстремни свойства, включително повишена глюконеогенеза, окислително фосфорилиране и активност на TCA цикъла, както и много висок (до 12-кратно нормалното ниво) поток през пентозофосфатния път. Последното може все пак да бъде артефакт от разликите в псевдореакцията на биомасата, при много висок (последни 55 mmol/gDW/h) окислителен дисбаланс (Вижте методи S1).

Когато реакцията на дисбаланс се локализира в митохондриите, намаляването на NADH отново предизвиква определено псевдохипоксично поведение, с една разлика (Фигура 2B). Потокът през гликолизата и метаболизма на глутамин се увеличава, със съпътстваща загуба на частите от цикъла на ТСА и пентозофосфатния път. Въпреки това, за разлика от цитозолния случай, окислителното фосфорилиране се увеличава значително. От друга страна, окислителната страна на митохондриалния профил е по-идиосинкратична: гликолитичната активност се увеличава успоредно с тази на TCA цикъла, но окислителното фосфорилиране работи в по-голямата си част на по-ниски нива от нормалното и метаболизмът на глутамин е от малко значение,

Метаболитните синдроми са резултат от компромис между редокс баланса, производството на биомаса и ATP/NADH компромис

Идентифицирахме няколко ключови елемента, които са оформили предишните синдроми.размер на пениса cistancheОкислителното смущение беше посрещнато с изострена аеробен отговор като компромис между поддържане на растежа и буфериране на смущението на дисбаланса. Това включва пренасочване на потока чрез максималния възможен брой реакции, които намаляват NAD плюс, като същевременно запазват глобалното разпределение на потока, което е способно да генерира съставки на биомаса. Тези два механични елемента (буфериране на смущенията и максимизиране на биомасата) са най-подходящите изисквания на проблема за оптимизация и достатъчни, за да опишат окислителния режим на профила на толерантност.

Фигура 3. Конкуриращи се механизми причиняват псевдохипоксичното поведение на дрождите

(A) Балансът между NADH, ATP и производството на прекурсор на биомаса благоприятства реакционните модули, които произвеждат възможно най-много ATP и възможно най-малко NADH, за да компенсират последствията от редукционните режими, например използването на гликолиза спрямо тази на TCA. Тук имайте предвид, че лилавите стрелки представляват производството на ATP, жълтите стрелки представляват производството на NAD(H), а белите кръгове показват генерирането на прекурсори на биомаса, (B) Предразположено към NADH NADH/NADt смущение (ос x) се припокрива с изкуствен ADP реакция на фосфорилиране (у-ос), която силно въвежда редукционна сила под формата на АТФ в небалансирания метаболизъм. Градиентът на зеления цвят представлява съотношението между гликолитичния поток и потока от цикъла на Кребс, нормализиран от неговата нормална стойност (до 100- пъти). Може да се оцени, че ADP фосфорилирането намалява псевдохипоксичния фенотип и забавя стадия.

Редуктивната страна обаче изисква едно допълнително прозрение. Тъй като все повече и повече NADH се изолира в NADH, реакциите, които използват NADt и са пряко или косвено необходими за производството на съставките на биомасата, стават все по-ограничени, така че енергийният метаболизъм трябва да бъде пренасочен, за да се позволи повишено превръщане на NADH в NAD' и да се ограничи намаляване на NAD' до NADH. Това все още е недостатъчно за посрещане на смущенията, тъй като по-голямата част от редукционната сила под формата на NADH е по същество безполезна за много метаболитни цели, реакции и растеж: енергията, съхранявана в NADH, трябва да бъде пренасочена към ADP. По този начин метаболизмът трябва да даде приоритет на реакционните модули, които произвеждат възможно най-много ATP и възможно най-малко NADH; той трябва да разчита на шънтове и пътища, които имат висок добив на ATP/NADH, например гликолиза и окислително фосфорилиране.

Това води, наред с други неща, до намален цикъл на TCA и увеличен гликолитичен поток (Фигура 3A). За по-нататъшно изследване на въздействието на този ATP/NADH компромис, ние припокрихме редуктивно NADH/NAD смущение с изкуствена реакция, която позволява фосфорилиране на ADP . Симулациите показаха, че повишеното съотношение на потока на цикъла на гликолиза към TCA, което характеризира редуктивния метаболизъм, зависи от добива на ATP/NADH

Фигура 4. Резултат на толерантност като предиктор на хронологичната продължителност на живота на дрождите

(A) Профили на толерантност, получени за дрождеви мутанти; сини/червени сектори на кривата представляват редуктивния/окислителния режим на NADH/NADH неравновесието.

(B) Връзка между нормализирания резултат на толерантност (пропорционален на обхвата на стойностите на дисбаланса както при окислителен, така и при редукционен режим, методи STAR) и хронологичната продължителност на живота. Корелацията обяснява ~30 процента от общата дисперсия (R'= 0. 29, p-стойност=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Като алтернативен начин за разглеждане на тази връзка, ние получихме хистограма на стойностите на наклона на регресия, получени от десет хиляди произволно генерирани асоциации между резултата на толерантност и продължителността на живота. От тази извадка откриваме само 3 случая, в които връзката между резултата за толерантност и данните за продължителността на живота е по-силна от установената (обозначена с червената вертикална линия).

(Фигура 3B). Принудителното фосфорилиране на ADP намалява тази псевдохипоксична сигнатура дори в лицето на много силни нива на дисбаланс, склонни към NADH.

Толерантността обяснява експерименталните хронологични разлики в продължителността на живота между различните дрождеви мутанти

Попитахме до каква степен профилът на толерантност може да действа като предиктор на продължителността на живота, като се има предвид, че редокс двойките са били обсъждани като потенциални определящи продължителността на живота. Един от начините да се проучи това е да се изчисли профилът на различни мутанти (Фигура 4А) и след това да се определи количествено как той съответства на точните мерки за продължителност на живота, нормализирани хронологични продължителности на живота (CLSs), налични от експериментално измерени криви на оцеляване на мутантите (Garay et al., 2014 г.). CLS се изчисляват от тези криви на оцеляване на мутанти като увеличение на преживяемостта в стационарна фаза спрямо дивия тип.

В FBA мутациите в специфични гени се симулират чрез ограничаване на потока на реакциите, свързани с тях чрез булеви правила, които свързват всяка химическа реакция с ORFs, които превеждат за ензима на реакцията (методи STAR). За всеки от тези мутанти изчислихме профил на мутантна толерантност (Фигура 4А) и използвахме сумата от абсолютните стойности на дисбаланса, при които скоростта на растеж е намалена наполовина (както в редуктивния, така и в окислителния режим) като скаларна оценка на толерантността (STAR методи).

Нашият набор от мутанти обаче беше ограничен от някои ограничения (STAR ​​методи). Трябва да се отбележи, че не бяхме в състояние да различим разликите в толерантността под 10 ppm от стойността на дивия тип, без да достигнем непосилни времена на изчисление, и много мутанти представиха както незначителни разлики в продължителността на живота, така и незначителни разлики в толерантността. Освен това обикновено се счита, че FBA не е в състояние да характеризира заличаванията на усилване на функцията и, съвсем предвидимо, никакви мутантни толеранси не надвишават тези на дивия тип.

Отвъд тези ограничения, профилите на толерантност in silico успяха да обяснят -30 процента от експериментално измерената променливост на продължителността на живота (Фигура 4B, R2= 0.29, N=41,p стойност{{5 }}.2x 10-) с голямо значение:10,000 рандомизациите на двойките данни доведоха до само 3 случая с по-голям наклон на регресия (Фигура 4C).

Конвенционалните хранителни вещества позволяват толерантност към NADH/NADH дисбаланси

И накрая, ние изследвахме дали специфични диетични метаболити са особено определящи в отговора на редокс дисбаланса. За тази цел използвахме допълнителна характеристика на FBA моделите, която е възможността за достъп до използването на конкретен метаболит (дефиниран като скорост на потребление в методите на стационарно състояние, STAR). Изследвахме начина, по който тази скорост се променя с увеличаване на стойностите на редуктивния и окислителния NADH/NAD плюс дисбаланс.

Употребата е по-скоро линейна от двете страни на профила и за повечето метаболити. По този начин ние приспособихме този променящ се модел към линеен модел и разгледахме (абсолютния) наклон като скаларно представително значение на съответния метаболит за толериране на редокс дисбаланс (Фигура 5А). Сред най-отзивчивите хранителни вещества на iAZ900 забелязахме диетични метаболити, за които е известно, че играят критична роля в регулирането на продължителността на живота на дрождите, като ацетат (Burtner et al., 2009), както и много, които експериментално увеличават продължителността на живота на дрожди, червеи, или дори човешки клетки (Madeo et al., 2018; Mishur et al., 2016), включително малат, хидроксибутират, спермидин или оксалоацетат (фигури 5B-5D, таблица S1).

Някои хранителни вещества са по-подходящи за толерантност към намаляването на NADH, други към окисляването на NADH и няколко към двата режима. Най-важните диетични метаболити за редуцираща толерантност бяха ацетат, бета-хидроксибутират (BHB), глутамат и глутамин (Фигура 5B), междувременно най-важните за понасяне на окислението на NADH бяха ацетат, NADP плюс, путресцин и спермидин (Фигура 5D). Сред тези, които са участвали от толерантност от двете страни на профила, най-подходящият е в реда на ацетат, глутамат, оксалоацетат и оксоглутарат (Фигура 5C).

Разгледахме метаболитни модели в други организми, за да потвърдим допълнително кои хранителни вещества са определящи в отговора на дисбаланси (методи S1, вижте също Фигура S2 за това как се променят потоците на основните пътища). Всички тези водещи участници се промениха, макар и не широко, с алфа-кето киселини, редокс двойки, определени витамини и определени аминокиселини, които са значително необходими за контролиране на смущенията на NADH/NADt в C.elegans и човешката реконструкция. Най-разпространената реакция към редокс дисбаланс в тези организми се отнася до метаболитите, които медиират рН хомеостазата, като ацетат, бикарбонат, бифосфат, натрий, вода и други подобни. По същия начин значението на глутамат, глутамин, аспартат, треонин, серин и глицин ги отличава от другите аминокиселини и повечето метаболити. Средно големи, окислени киселини като оксоглутарат, малат и оксалоацетат също играят роля в толерантността последователно, както и биотинът и някои фолати (вижте таблица S1 за пълен списък).

ДИСКУСИЯ

Тук предлагаме алтернативен подход за разбиране на широките биологични последици от промените в редокс двойките. Този подход се основава на in silico метаболитни модели и въвежда понятието толерантен профил като мярка, която количествено определя клетъчната устойчивост на тези промени.

Фигура 5. Хомеостатични хранителни вещества в дрожди

(A) Примерен профил на употреба на хранително вещество със съответните му редуктивни (сини) и окислителни (червени) линейни регресии, характеризиращи се съответно с наклони m и m. (в абсолютни стойности). Включихме профила на цитозолната толерантност във фонов режим като референция.

(B) Наклони на линейна регресия (m,) на първите 4 хомеостатични хранителни вещества в редуктивния смисъл на NADH/NAD плюс смущение.

(C) Наклони на линейна регресия на горните 4 хранителни вещества, които са хомеостатични и в двата смисъла на смущението; Син: Наклон на редуктивна линейна регресия; Червено: Наклон на окислителната линейна регресия.

(D) Наклони на линейна регресия (m.) на първите 4 хомеостатични хранителни вещества в окислителен смисъл на NADH/NAD плюс смущение.

Метаболитните корекции в основата на профила разкриват наличието на псевдохипоксичен фенотип, свързан с редуктивните режими на NADH. Този фенотип напомня на някои очевидно парадоксални енергийни метаболизми с нисък добив, наблюдавани при ракови заболявания (ефектът на Warburg) и също се разпознава в дрожди (ефект на Crabtree) и бактериални (преливащ метаболизъм) клетки (Basan et al., 2015; Mori et al., 2016; Потър и др., 2016). Възможността това поведение да бъде причинено от ограничения на разпределението на ресурсите, възникващи при сравнително висок растеж или нива на усвояване на глюкоза, беше представена през последните години (Basan et al, 2015; Mori et al, 2016). Въпреки това, псевдохипоксичният фенотип, който наблюдаваме, е независим от скоростта на растеж и усвояването на глюкоза и всъщност се среща съвместно с ниски темпове на растеж (методи STAR). Ние показахме, че причината за това се крие в основен ATP/NADH компромис, обосновка, която е подкрепена от скорошно експериментално проучване (Maldo-nado and Lemasters, 2014).

Освен това, нашият анализ на потока предполага, че поддържането на АТФ може да бъде отрицателно повлияно от редуктивния NADH/NAD плюс неравновесие. Смята се, че повишеният NADH е корелат на намалената наличност на АТФ, тъй като увреждането на окислителното фосфорилиране може да доведе както до увеличаване на NADH/NAD плюс, така и до намаляване на АТФ/АДФ. Ние показваме, че външно генерираните дисбаланси на NADH могат да бъдат причина за намалена наличност на енергия чрез ортогонални метаболитни механизми, дори когато окислителното фосфорилиране работи над нормални нива. Това е много важно в контекста на изследването на стареенето, тъй като намалената наличност на енергия и съотношенията ATP/ADP са запазена отличителна черта на клетъчното стареене и свързаните с възрастта патологии (Moreira et al., 2003; Pall, 1990; Yaniv et al., 2013). ) и може да насърчи натрупването на токсични отпадъци и загубата на протеостаза (друг отличителен белег на стареенето) чрез намаляване на обмена на протеини и следователно увеличаване на полуживота на протеина (Anisimova et al., 2018).

След това се стремим да определим валидността на нашата рамка като предиктор на продължителността на живота и на диетичните метаболити, буфериращи редокс дисбалансите. Толерантността предвижда продължителността на живота на клетката, с някои ограничения поради наличния набор от данни. Контролирайки тези ограничения (Garay et al., 2014), откриваме, че получените корелации все още са достатъчно доказателство за връзка между вариациите на толерантността и CLS.

Противно на нашите очаквания, най-отчетливият урок, извлечен от нашия анализ на диетичните метаболити, е, че основното вещество, движещо отговора на дисбаланса, не разчита особено на мрежата за спасяване на NADt. Наистина, най-добрите "хомеостатични хранителни вещества" са междинни продукти от цикъла на ТСА и други части от централния метаболизъм, чието действие е много по-проникващо от това на прекурсорите на NAD. В допълнение, уместността на реакциите, които редуцират или окисляват NAD(H), докато действат като мостове между редокс двойката и основните метаболитни пътища, е далеч по-голяма от тази на ограничаващите спасяването на NADt ензими (като никотинамид мононуклеотид аденилтрансфераза).

Например, оксалоацетатът и оксоглутаратът се класират в модела на дрождите сред първите четири най-ефективни метаболита, които са в основата на толерантността както при редукционни, така и при окислителни условия, последователна характеристика, която потвърждава предишни експериментални резултати (Chin et al., 2014; Williams et al., 2009) . Други значими метаболити включват хидроксибутират, за който постоянно е доказано, че увеличава продължителността на живота, регулира NAD и медиира отговора на глад (Edwards et al., 2014; Newman and Verdin, 2014), и спермидин, който принадлежи към семейството на полиамините и е известно, че играят роля в процесите, свързани с възрастта, автофагията и защитата на ДНК (Eisenberg et al, 2009; Minois et al. 2011: Pietrocola et al. 2015).

Използвахме C.elegans и човешки модели, за да подсилим предишната оценка, разкривайки по-широка картина, която е съсредоточена около хомеостазата на pH, редокс двойките и цикъла на TCA. Това предполага, че начините, по които pH (Burtner et al., 2009) и дисбалансът на NADH (Ayer et al., 2014) определят стареенето в клетките, са дълбоко преплетени. Отвъд pH, най-разпространените и важни хранителни вещества за регулиране на NADH/NAD плюс дисбаланса са алфа-кето киселините оксалоацетат и оксоглутарат, техните аминирани форми и други свързани с митохондриите метаболити като малат, пируват и фумарат, т.е. основният център на контролът на редокс баланса е цикълът TCA.

До ден днешен механизмите, чрез които аминокиселините и междинните продукти от цикъла на TCA влияят върху удължаването на живота на дрождите и C. elegans, остават неясни. Метаболити като малат, оксалоацетат, фумарат, валин, серин или треонин наистина могат да удължат живота на организмите, но процесите, водещи до тези ефекти, са обсъждани и сложни (Edwards et al., 2013, 2015). Нашите резултати показват, че общото обяснение за всички тези про-дълголетни явления се крие в ефекта на хранителните вещества върху капацитета на клетките да понасят смущения в съотношението NADH/NAD плюс.

Може обаче да се твърди, че някои от разглежданите метаболити изглеждат очевидни, тъй като в крайна сметка участват в реакции, които взаимно превръщат NADH и NAD плюс. Тогава въпросът е защо други метаболити, които също изглеждат априори очевидни, не се появяват в нашите резултати. Отговорът се крие в механизмите, които осигуряват реалистични прогнози във FBA. За да бъде едно хранително вещество "хомеостатично" срещу редокс дисбаланс, то трябва не само да увеличи производството на NADH или NADt, но да стои в центъра на пътя или модула с висок добив на ATP/NADH и/или капацитет за осигуряване на съставки на биомаса.

И накрая, още две прозрения от нашите резултати са забележителни. От една страна, те предполагат, че в отговор на редокс дисбаланси, метаболитните мрежи са готови все повече да произвеждат и/или консумират някои метаболити, които се интерпретират от сигналните мрежи като изключващи необходимостта от автофагия, антиоксидантни и хорметични реакции, както и много, които превишават или добавянето е установено, че увеличава продължителността на живота и/или по друг начин имитира ефектите от калорийното ограничение (CR), по начин, зависим от сигналните пътища, които са замесени в CR-медиираното удължаване на продължителността на живота. Това подсилва предишни доказателства, свързващи баланса CR и NADH/NADH като част от същия процес за удължаване на продължителността на живота и насърчаване на здравето (Lin et al., 2004).

От друга страна, нашето проучване показва, че в отговор на променените съотношения, метаболизмът също използва все повече определени вещества, които могат да увредят химически клетката, като ацетат, путресцин или ацеталдехид; както и някои, които могат да стимулират туморогенезата чрез метаболитно пренавиване, като глутамин, сукцинат и фумарат (Sciacovell et al., 2016). Това би могло отчасти да обясни патологиите, свързани с редокс дисбаланса и макроскопичните процеси, в които участва, като дегенеративни и онкологични заболявания: ако редокс дисбалансът трябва да бъде буфериран с вещества, които са токсични, тогава тези вещества вероятно са механизми на патологиите, които ко -възникват при редокс дисбаланс.

Ние осъзнаваме, че нашият подход към редокс дисбаланса може да се разбира като необичайна вариация на изследването на устойчивостта на метаболитната мрежа и че той може да обвини някои предупреждения, които оставят много място за подобрение. По отношение на устойчивостта, проучванията, използващи FBA, традиционно я определят като промяна на обективното решение (обикновено растеж) в отговор на различни намаления в скоростта на реакцията, например (Edwards and Palsson, 2000), а не на конкретно смущение (редокс дисбаланс ) в метаболитите, както правим ние. По отношение на ограниченията на нашия анализ, те могат да бъдат свързани с присъщи ограничения на самата FBA, като липсата на регулаторни гени. В крайна сметка надеждността на нашите резултати зависи от предсказващата сила на метаболитните реконструкции: настоящите модели на дрожди са предсказуеми и усъвършенствани, но не са перфектни (Heavner и Price, 2015) и все пак са много по-добри дори от повечето налични са точни многоклетъчни реконструкции. Въпреки всички тези опасения, има много доказателства, които гарантират нарастващата вярност на метаболитните модели към естественото поведение.

Понастоящем преобладаващите изследвания са склонни да игнорират потенциалните негативни последици от безразборното намаляване на съотношението NADH/NADH. Това отчасти се дължи на обещаващите ползи, произтичащи от леките намаления, постигнати експериментално, които включват намаляване на неопластични фенотипове, продължителност на живота и удължаване на продължителността на здравето. Съществуват обаче нови доказателства, които препоръчват изключителна предпазливост по отношение на тези положителни резултати (Gujarat al., 2016; Hong et al., 2019), както и солидна, експериментално поддържана теоретична рамка, която предвижда отрицателни последици от намаляване на съотношенията NADH/NADH отвъд праг (Aon et al., 2010). Нашите профили на толерантност към дисбаланс на NADH/NADt отговарят на тази нововъзникваща картина, тъй като леките оксидативни отклонения могат да бъдат полезни, но по-високите са също толкова вредни, колкото и противоположната крайност.

По-конкретно, нашите профили на толерантност предполагат, че освен че причиняват химически или физиологични проблеми, както ниските, така и високите съотношения NADH/NADH трябва да бъдат посрещнати и с чисто метаболитни недостатъци, включително намалена наличност на енергия и/или биосинтетична продукция. Освен това, както посочихме, ограничените експериментални наблюдения, които са налични по някои от въпросите, които разглеждаме, изглежда напомнят на резултатите, които докладваме тук.

Ограничения на изследването

Представените тук резултати биха се подобрили, когато използваните модели бъдат допълнително усъвършенствани. Нашата работа също страда от присъщите ограничения на FBA като техника. Например, динамичната информация не е достигната, като се има предвид, че наличните в момента версии на динамичния анализ на потока са с твърде ограничен обхват. По същия начин, липсата на имплицитни енергийни ограничения в баланса на потока намалява неговата предсказуемост за високи темпове на растеж. Тази слабост е мотивирала добавянето на техники като CAFBA, както разгледахме в ръкописа. И накрая, би било интересно да получите достъп до нормативна информация, която може лесно да се контролира и включва или изключва. Понастоящем няма стандартизирани подходи за прилагане на генна регулация в FBA. Прилагането на оценките на реакционната активност към границите на ограниченията е обещаващо в това отношение.

Тази статия е извлечена от iScience 24, 102697, 23 юли 2021 г.