Общо гликозиди от стъбла на Cistanche Tubulosa облекчават подобно на депресия поведение: двупосочно взаимодействие на фитохимикалите и чревната микробиота

за повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Ли Фан и др

АБСТРАКТ

Заден план: Като най-често използваната билка за тонизиране на бъбреците в традиционната китайска медицина, изсушените сочни стъбла наЦистанчеtubulosa(Schenk) Wight (CT) са показали, че са ефективни при лечението на депресия. Компонентите на антидепресанта и техният основен механизъм обаче остават неясни.

Предназначение: Да се ​​изследват активните компоненти на КТ(Цистанчеtubulosa)срещу депресията, както и потенциалните механизми. Дизайн и методи на изследването: Използвани са тестове за поведенческо отчаяние за оценка на антидепресивните активности на полизахариди, олигозахариди и различни обогатени с гликозиди фракции, отделени от CT, както и типичните метаболити на чревната микробиота, включително 3-хидроксифенилпропионова киселина ({{2 }}HPP) и хидрокситирозол (НТ). Освен това ефектите на биоактивните фракции и метаболитите върху моделите на хроничен непредсказуем лек стрес (CUMS) бяха изследвани с множество фармакодинамични и биохимични анализи. Промени в хистологията на дебелото черво и чревната бариера се наблюдават чрез оцветяване и имунохистохимичен анализ. Чревните микробни характеристики и метаболизмът на триптофан-кинуренин бяха изследвани с помощта на 16S rRNA секвениране и съответно Western-blotting.

Резултати: Обща сумагликозиди(TG) драматично облекчава подобно на депресия поведение в сравнение с различни разделени фракции, което се отразява в синергичните ефекти на фенилетаноидите и иридоидните гликозиди върху хиперактивирането на хипоталамо-хипофизно-надбъбречната (HPA) ос, тежко невро- и периферно възпаление и недостатъци в 5-хидрокситриптамин (5-HT) и мозъчен невротрофичен фактор в хипокампуса. Освен това TG(общи гликозиди)смекчено нискостепенно възпаление в дебелото черво и разрушаване на чревната бариера и изобилието от няколко бактериални рода силно корелират с HPA оста и възпалението при плъхове CUMS. Последователно, експресията на индоламин 2, 3-диоксигеназа 1 (IDO1) в дебелото черво е значително намалена след TG(общи гликозиди)приложение, придружено от потискане на метаболизма на триптофан-кинуренин. От друга страна, HT също така упражнява подчертан антидепресивен ефект чрез подобряване на функцията на оста на HPA, освобождаването на провъзпалителни цитокини и метаболизма на триптофан-кинуренин, докато не е в състояние да коригира до голяма степен нарушената чревна микробиота по същия начин като TG. Изненадващо, превъзхождащи флуоксетина, TG и HT могат допълнително да подобрят дисфункцията на хипоталамо-хипофизно-гонадната ос и анормалния цикличен нуклеотиден метаболизъм.

Ключови думи: Цистанчеtubulosa, общи гликозиди, хидрокситирозол, депресия, чревна микробиота

Щракнете за продукт cistanche deserticola ma

Въведение

Депресията е хронично, повтарящо се и потенциално животозастрашаващо психично разстройство, което засяга до 20 процента от населението по света (Nabavi et al., 2017). Понастоящем, въпреки че са одобрени множество антидепресанти, страничните ефекти са обезпокоителни. По-специално, дългосрочното лечение със селективни инхибитори на обратното захващане на серотонина (SSRIs) като флуоксетин, основният фармакологичен агент за депресия, изостри проблеми като хронична сексуална дисфункция (Bijlsma et al., 2014); това привлече все по-голямо внимание към откриването на нови антидепресанти от естествени билки (Wang et al., 2019). В теорията на традиционната китайска медицина (ТКМ) дефицитът на бъбрек-ян води до характеристика на ефективността, подобна на клиничните симптоми на депресия, като чувство на свалка, загуба на интерес и сантименталност (Yang et al., 2020), насърчавайки мислите за облекчаване на подобно на депресия поведение чрез тонизиране на бъбреците-ян. По случайност много билки, тонизиращи бъбреците, притежават предимството да подобряват сексуалната функция (Wu et al., 2015). Подобни проучвания ни карат да обърнем внимание на потенциалното приложение нацистанчииHerba, която е най-често използваната билка за тонизиране на бъбреците в TCM и е ефективна при лечение на мъжка сексуална дисфункция (Wang et al., 2020), по отношение на развитието на антидепресанти.цистанчииHerba, официално записан като изсушени сочни стъбла наЦистанчеtubulosa(Schrenk) Wight (CT) иЦистанчеdeserticola(YC Ma) в Китайската фармакопея (Wang et al., 2017) се използва в Китай и други страни от Източна Азия от 15-ти век за лечение на състояния като бъбречен дефицит на Ян, импотентност и женско безплодие. Съвременните фармакологични изследвания показват товацистанчииHerba има многобройни биоактивности, като повишаване на имунитета, неврозащита, антиоксидант, ефект против стареене и умора (Wang et al., 2017). Невропротективните свойства нацистанчииHerba предполага неговия терапевтичен потенциал при когнитивно-свързани заболявания като инсулт, депресия и болестта на Алцхаймер (Wang et al., 2020). В нашето предишно проучване открихме, че CT(Цистанчеtubulosa)екстракт облекчава подобно на депресия поведение на плъхове с хроничен непредсказуем лек стрес (CUMS) (Li et al., 2018). Към днешна дата химичен анализ на CT(Цистанчеtubulosa)показаха, че основните му съставни части включват фенилетаноидни гликозиди, иридоидни гликозиди, полизахариди и олигозахариди (Jiang and Tu, 2009), но типът съединение, което играе доминираща роля в неговия антидепресивен ефект, остава неясен.

Многобройни проучвания потвърждават, че физиологичното действие на червата (особено коменсалната микробиота) играе важна роля в развитието на депресия и може да регулира невроендокринната, автономната нервна система и имунната система (Yang et al., 2020). Освен това връзката, свързваща метаболизма на триптофана, чревната микробиота и депресията, постепенно привлече много внимание. Променената чревна микробиота може да активира триптофан-кинурениновия път, като впоследствие намалява наличността на периферен и церебрален триптофан, което води до 5-НТ дефицит (Agus et al., 2018). Предишното ни проучване показа, че фенилетаноидните гликозиди в CT(Цистанчеtubulosa)като цяло имат ниска бионаличност и могат бързо да се метаболизират до 3-хидроксифенилпропионова киселина (3-HPP) и хидрокситирозол (HT) от чревната микробиота (Li et al., 2016). Освен това, CT(Цистанчеtubulosa)Съобщава се, че екстракт възстановява хомеостазата на чревната микробиота при плъхове CUMS (Li et al., 2018). Въз основа на такова изследване, ние заключихме, че двупосочното взаимодействие на фитохимикалите и чревната микробиота може да управлява антидепресантните ефекти на специфични биоактивни компоненти на CT(Цистанчеtubulosa). По-конкретно, съединенията могат да се трансформират в абсорбируеми метаболити (като 3-HPP и HT) в стомашно-чревния тракт от чревната микробиота и впоследствие да упражняват антидепресантни ефекти. На свой ред, индуцираните от биоактивни компоненти структурни промени в чревната микробиота могат едновременно да играят жизненоважна роля в антидепресантната активност.

Тук в нашето проучване използвахме поведенчески тестове за отчаяние, за да оценим антидепресивните активности на полизахариди, олигозахариди и различни фракции, обогатени с гликозиди, отделени от CT(Цистанчеtubulosa)воден екстракт (CTE) и типичните метаболити от чревната микробиота (включително 3-HPP и HT), които допълнително потвърдихме в модел на хроничен непредсказуем лек стрес (CUMS) с множество фармакодинамични и биохимични анализи. Впоследствие проучихме дали неговият механизъм срещу депресия е от значение за двупосочното взаимодействие на фитохимикалите и чревната микробиота.

Материали и методи

Материали

Всички стандарти, използвани за химичен анализ, са закупени от Durst (Сичуан, Китай). 3-HPP, HT, флуоксетин и имипрамин са закупени от Aladdin (Шанхай, Китай). Комплектът за количествено определяне на BCA протеин е закупен от Boster (Ухан, Китай). Nanjing Jiancheng (Nanjing, Китай) предостави 5-HT, BDNF, тумор некрозисфактор-алфа (TNF-), интерлевкин-1бета (IL-1) и интерферон-гама (IFN- ) комплекти за ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Кортикостерон (CORT), адренокортикотропен хормон (ACTH) и кортикотропин-освобождаващ хормон (CRH) ELISA комплекти бяха закупени от MultiSciences (Хангжу, Китай). Комплекти ELISA за цикличен аденозин монофосфат (cAMP), цикличен гуанозин монофосфат (cGMP), тестостерон (T) и гонадотропин-освобождаващ хормон (GnRH) са закупени от Enzyme-linked Biotechnology (Шанхай, Китай). Триптофан и кинуренин ELISA комплекти бяха получени от Small Molecule Antibodies (Бордо, Франция). Първични/вторични антитела, включително zonula occludens 1 (ZO-1), индоламин 2, 3-диоксигеназа 1 (IDO1), -актин и HRP кози анти-заешки IgG (H плюс L) бяха закупени от Proteintech (Ухан, Китай). Всички други реагенти с аналитичен клас или по-висока чистота са получени от търговски доставчици.

Получаване на различни фракции, отделени от CTE(Цистанчеекстракт от тубулоза)

CT(Цистанчеtubulosa)е събрана през ноември 2015 г. в Хетиан, Синдзян, Китай, и удостоверена от проф. Сяобо Ли. Образецът на ваучера (20151108) е депозиран в Факултета по фармация към Шанхайския университет Jiao Tong.

Натрошените проби се екстрахират три пъти с дестилирана вода (1:10, w/v) в продължение на 2 часа при 80~90 ◦C, за да се получи CTE(Цистанчеекстракт от тубулоза)(доходността беше 57,1 процента). CTE се разтваря в дестилирана вода и след това бавно се разбърква с етанол (1:4, v/v) и се поставя при 4 °C за 24 h. След това утайката и супернатантата се събират чрез центрофугиране при 4000 rpm за 20 минути. Общите полизахариди (TP; добивът е 5,7 процента) се получават чрез промиване с 80 процента етанол и депротеинизиране с реагент Savage три пъти от събраната утайка. След това останалият супернатант се хроматографира върху колона с микропореста смола D101 и се елуира с дестилирана вода и 40 процента етанол. Елуираните фракции от вода и 40 процента етанол съдържат общи олигозахариди (TO; добивът е 35,1 процента) иобща сумагликозиди(TG; добивът е съответно 12,1 процента). TG(общи гликозиди)допълнително се елуира с дестилирана вода и 5 процента, 10 процента и 40 процента етанол през D101 микропореста смола отново и елуираните фракции от 5 процента и 40 процента етанол са общи иридоидни гликозиди (TG-IrG; добивът е 2,7 процента) и общи фенилетаноидни гликозиди (TG-PhG; добивът е съответно 8,7 процента).

Химичен анализ

Първо, основните химични съставки на различни фракции, отделени от CTE(Цистанчеекстракт от тубулоза)се характеризират с UPLC-QTOF-MS. Второ, относителното съдържание на общи въглехидрати и гликозиди се определя чрез метода UV-Vis. Трето, основните компоненти (ехинакозид, вербаскозид, вербаскозид, 8-епилоганова киселина и тенипозидна киселина) бяха количествено определени чрез валидиран HPLC метод. Подробните параметри и валидирането на метода са показани в допълнителните материали.

Експерименти с животни

Специфичните графици за експерименти с животни са показани на Фиг. 1. Всички експериментални животни бяха настанени и аклиматизирани за 1 седмица преди експериментите в Центъра за лабораторни животни на Шанхайския университет Jiao Tong (Шанхай, Китай), при контролирани стайни температури (25 ± 2 ◦C; 55 ± 10 процента относителна влажност) с цикъл 12:12 часа светло-тъмно. Това изследване е проведено в съответствие с Насоките за грижа и използване на лабораторни животни на SJTU. Съоръженията и протоколите за животните бяха одобрени от Комитета по етика на животните на SJTU (№ A2019008).

Сто и петдесет мъжки ICR мишки (с тегло 18–20 g, на възраст 6 седмици) бяха закупени от Shanghai Slack Biotechnology Company (Шанхай, Китай) и разделени на случаен принцип в 10 групи (n=15/група). Субектите и дозите за мишки с поведенческо отчаяние във всяка група са показани в таблица 1. Дозите на CTE(Цистанчеекстракт от тубулоза) и неговите отделени фракции бяха изчислени по следната формула: доза=4.55 g/kg.d.bw × добив, който беше определен съгласно три изчисления на еквивалентни дози при хора, базирани на телесната повърхност. Дозите на положителното лекарство имипрамин и метаболитите на чревната микробиота (3-HPP и HT) са определени съгласно предишните проучвания (Gupte et al., 2016; Pablos et al., 2019). След интрагастрално приложение веднъж дневно в продължение на 7 дни, тестът в открито поле (OFT), тестът за окачване на опашката (TST) и тестът за принудително плуване (FST) бяха извършени съответно на 8-ия, 9-ия и 10-ия ден. Специфичните методи на поведенческите тестове са описани в Допълнителните материали.

Седемдесет и два мъжки плъха Sprague-Dawley (с тегло 160–180 g, на възраст 6 седмици) бяха закупени от Shanghai Slack Laboratory Animal Company (Шанхай, Китай). Преди официалните експерименти, всички плъхове бяха подложени на тест за предпочитане на захароза (SPT) след съответното обучение. Плъховете бяха разделени на 8 групи (n=9/група) според техните предпочитания за захароза (допълнителна фигура S1). Субектите и дозите за плъховете във всяка група са показани в таблица 1. Дозите са определени в съответствие с коефициента на преобразуване между мишка и плъх въз основа на техните ефективни дози при поведенчески отчаяни мишки. И дозата на лекарството за положителна контрола флуоксетин е в съответствие с предишното проучване (Hou et al., 2017). Всички групи са получили серия от хроничен непредсказуем лек стрес (CUMS), с изключение на контролната група. Стресорите се прилагат непрекъснато и на случаен принцип в продължение на 4 седмици (вижте допълнителна таблица S1 за подробности). Храната и водата бяха свободно достъпни за контролните плъхове, които останаха необезпокоявани в друга стая, с изключение на поведенческите тестове. Субектите са приложени интрагастрално 1 час преди процедурата CUMS в продължение на 4 седмици. След 28 дни непрекъснати стресови фактори и прилагане на лекарства, OFT, SPT и FST бяха извършени съответно на 29-ия, 31-ия и 33-ия ден. Специфичните методи на поведенческите експерименти са показани в Допълнителните материали.

Вземане на проби и биохимичен анализ

След поведенческите тестове гладните плъхове бяха анестезирани с натриев пентобарбитал и беше събрана цяла кръв за получаване на серумни проби. След перфузия на сърцето с физиологичен разтвор, съдържанието на хипокампуса, дебелото черво и сляпото черво се събира и съхранява в -80 ◦C. Дисталните сегменти на дебелото черво бяха отстранени и фиксирани в 4% параформалдехид. Нивата на CORT, CRH, ACTH, TNF-, IL-1, IFN-, cAMP, cGMP, T, GnRH, триптофан и кинуренин в серума, 5-HT, BDNF и TNF- в хипокампуса, а TNF- и IFN- в дебелото черво бяха измерени съгласно инструкциите, предоставени със съответните ELISA комплекти.

Хистология, имунохистохимия и уестърн-блотинг анализ

Използвани са оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) и Alcian blue-periodic acid-Schiff (AB-PAS) за наблюдение на патологичните промени в тъканта на дебелото черво. Освен това бяха извършени имунохистохимични оценки на тези секции, за да се наблюдава експресията на ZO-1 протеин в епителните клетки на дебелото черво (Ding et al., 2020). Подробности относно подготовката на пробата и Western-blotting анализ за определяне на експресията на IDO1 протеин в дебелото черво и хипокампуса също са описани в Допълнителните материали.

Анализ на съставния профил на чревната микробиота

16S rRNA високопроизводително секвениране беше извършено от MajorBio Co., Ltd. (Шанхай, Китай), а подробният метод и обработка на данни са показани в допълнителните материали.

Статистически анализ

Данните са изразени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) беше използван за сравняване на множество групи чрез използване на софтуера SPSS 20.0. Разликата се счита за значима при p <0,05. корелациите="" между="" чревните="" микроби="" и="" някои="" свързани="" с="" депресията="" физиологични="" фактори="" бяха="" анализирани="" с="" помощта="" на="" корелационния="" коефициент="" на="" spearman="" въз="" основа="" на="" анализ="" на="" топлинна="">

Резултати

Химичен анализ на различни фракции, отделени от CTE(Цистанчеекстракт от тубулоза)

Основните компоненти бяха характеризирани с помощта на UPLC-QTOF-MS (допълнителна таблица S2 и фигура S2) и бяха идентифицирани общо 21 съставки, включително 16 съставки на фенилетаноидни гликозиди, 2 съставки на фенолни гликозиди в CTE(Цистанчеекстракт от тубулоза), TG и TG-PhG; и 3 съставки на иридоидните гликозиди в CTE(Цистанчеекстракт от тубулоза), TG и TG-IrG. Като цяло, относителното съдържание на общи въглехидрати в TP и TO е съответно 60,3 процента и 80,8 процента. Относителното съдържание наобща сумагликозидив ТГ са били 87,7 процента . Съответно, фенилетаноидните и иридоидните гликозиди представляват 86.7 процента и 53,4 процента съответно от TG-PhG и TG-IrG. Съдържанието на ехинакозид, вербаскозид, вербаскозид, 8-епилоганова киселина и тенипозидна киселина във всяка фракция е показано в таблица 2, а HPLC хроматограмата и данните за валидиране на метода са изброени в допълнителна таблица S3 и фиг. S3.

Ефекти на различни фракции, отделени от CTE(Цистанчеекстракт от тубулоза)и типичните метаболити от чревната микробиота при поведенчески тестове за отчаяние при мишки

Както е показано на Фиг. 2, в сравнение с контролната група, мишките, подложени на 7-дневно приложение на имипрамин (положителна контрола), показват значително намаляване на времето на неподвижност както при FST, така и при TST и не показват значим ефект върху общото изминато разстояние при OFT . Подобни промени се наблюдават и в CTE(Цистанчеекстракт от тубулоза), TG и НТ групи, което показва, че CTE, TG(общи гликозиди), и HT упражняват антидепресивна активност и ефектите не са свързани с възбудимостта. Следователно, TG(общи гликозиди)и HT бяха доминиращата биоактивна фракция, отделена от CTE и типичните метаболити съответно от чревната микробиота. Интересно е, че не са показани значителни промени във времето на неподвижност в FST след прилагане на TG-PhG и TG-IrG в сравнение с тези на контролите или в TST след приложение на TG-PhG, което показва, че наличието на фенилетаноидни и иридоидни гликозиди може да да бъде от съществено значение за антидепресантната активност на CTE.

Фармакодинамични ефекти и биохимични промени на различни фракции, обогатени с гликозиди и HT върху CUMS плъхове

Както е показано в таблица 3, плъхове, подложени на 28 дни от парадигмата CUMS, показват значителни намаления (p < 0.001)="" в="" предпочитанията="" за="" захароза="" в="" spt,="" общо="" изминато="" разстояние,="" и="" брой="" на="" отглеждане="" в="" oft,="" както="" и="" значително="" увеличение="" (p=""><0.01) в="" общото="" време="" на="" неподвижност="" в="" fst="" в="" сравнение="" с="" контролите,="" което="" предполага="" индуциране="" на="" подобни="" на="" депресия="" фенотипове="" при="" плъхове="" cums.="" депресивните="" прояви="" бяха="" обърнати="" в="" групата="" flx="" (положителна="" контрола).="" по="" подобен="" начин,="" лечението="" с="" cte,="" tg,="" tg-phg,="" tg-irg="" и="" ht="" доведе="" до="" възстановяване="" на="" предпочитанията="" за="" захароза="" до="" нормални="" нива="" при="" cums="" плъхове,="" които="" бяха="" 102,7%,="" 94,1%,="" 89,8%,="" 91,9%="" и="" 94,3%="" от="" контроли,="" респ.="" последователно="" в="" fst,="" cte="" и="" tg="" групите="" показват="" най-очевидните="" ефекти="" и="" времената="" на="" неподвижност="" достигат="" съответно="" 103,3="" процента="" и="" 93,4="" процента="" от="" тези="" на="" контролната="" група,="" докато="" времето="" на="" неподвижност="" на="" tg-phg,="" tg-irg="" и="" ht="" групите="" току-що="" достигна="" 62,1="" процента,="" 73,2="" процента="" и="" 69,9="" процента="" от="" тези="" на="" контролната="" група.="" подобни="" значителни="" увеличения="" (p=""><0,05) се="" наблюдават="" в="" общото="" изминато="" разстояние="" и="" броя="" на="" отглеждането="" в="" oft="" след="">(Цистанчеекстракт от тубулоза), TG и HT приложение, и лечението с TG-PhG и TG-IrG има тенденция към преразглеждане на броя на отглеждането при плъхове CUMS. Резултатите показват, че TG е доминиращата биоактивна антидепресантна фракция, отделена от CTE, и фенилетаноидните и иридоидните гликозиди са незаменими при упражняването на неговия антидепресивен ефект. Освен това е доказано, че HT е един от активните метаболити на TG in vivo.

Последователно страданието от CUMS значително повишава нивата на CORT, CRF, ACTH, TNF-, IL-1 и IFN- в серума и TNF- в хипокампуса на плъхове в сравнение с тези от контролната група (p< 0.05),="" resulting="" in="" significant="" reductions="" (p="" <="" 0.05)="" in="" the="" levels="" of="" hippocampal="" 5-ht="" and="" bdnf="" (fig.="" 3).="" except="" for="" a="" non-significant="" difference="" in="" the="" level="" of="" hippocampal="" bdnf="" between="" flx="" and="" cums="" groups,="" the="" above-mentioned="" alterations="" in="" cums="" rats="" could="" be="" significantly="" reversed="" (p="" <="" 0.05)="" after="" administration="" of="" fluoxetine,="" cte="">(Цистанчеекстракт от тубулоза), TG и HT, което показва, че CTE, TG(общи гликозиди), и HT показаха облекчаващи ефекти върху хиперактивирането на HPA оста, тежко периферно и неврално възпаление и дефицити в {{0}}HT и BDNF. По същия начин лечението с TG-IrG и TG PhG значително намалява нивата на серумния CORT, TNF-, IFN- и хипокампалния TNF- и повишава нивото на хипокампалния 5-HT при CUMS плъхове (p < {{8}="" }.05).="" значително="" намаление="" (p="">< 0.05)="" в="" нивата="" на="" серумния="" crf="" и="" acth="" също="" се="" наблюдава="" в="" групата="" на="" tg-irg="" в="" сравнение="" с="" групата="" на="" cums.="" интересно="" е,="" че="" нивата="" на="" серумните="" cort,="" tnf-,="" acth="" и="" crf="" в="" групите="" tg-phg="" и="" tg-irg="" са="" значително="" по-високи="" от="" тези="" в="" групата="" tg="" (p=""><0,05), а="" нивата="" на="" хипокампалния="" 5-ht="" и="" bdnf="" показва="" противоположния="" модел="" на="" експресия="" (р=""><0.05). тези="" резултати="" показват,="" че="" ефектите="" на="" tg-phg="" и="" tg-irg="" върху="" хиперактивността="" на="" hpa="" оста,="" периферното="" и="" невронно="" възпаление="" и="" недостига="" на="" 5-ht="" са="" ясно="" по-ниски="" от="" tg,="" което="" показва,="" че="" фенилетаноидните="" и="" иридоидните="" гликозиди="" могат="" да="" упражняват="" синергични="" ефекти="" върху="" гореспоменатите="" множество="">

TG и HT регулират HPG оста и цикличния нуклеотиден метаболизъм при CUMS плъхове

Измерват се нивата на T, GnRH, cAMP и cGMP и съотношението на cAMP и cGMP (cAMP/cGMP) в серума, подложен на CUMS, и резултатите са показани в Таблица 4. Концентрациите на T, GnRH, cAMP, и cAMP/cGMP в серума са значително намалени и нивото на cGMP е значително повишено (p < 0.05)="" в="" cums="" групата="" в="" сравнение="" с="" контролите,="" което="" показва,="" че="" подлагането="" на="" cums="" води="" до="" потискане="" на="" hpg="" оста="" и="" дисфункция="" на="" метаболизма="" на="" цикличните="" нуклеотиди.="" в="" сравнение="" с="" групата="" cums,="" няма="" значителни="" промени="" в="" групата="" flx.="" изненадващо,="" след="">(общи гликозиди)и лечение с ХТ, значителни увеличения (p < {{0}}.05)="" са="" изложени="" в="" нивата="" на="" серумен="" t,="" gnrh,="" camp="" и="" camp/cgmp,="" докато="" нивото="" на="" серумния="" cgmp="" е="" значително="" понижено="" (p="">< 0,05).="" тези="" резултати="" показват,="" че="">(общи гликозиди)и HT регулират HPG оста и метаболизма на цикличните нуклеотиди, което е значително по-добро от положителната контрола на флуоксетин.

TG и HT облекчават слабото възпаление в дебелото черво и разрушаването на чревната бариера при CUMS плъхове

Оцветяването с H&E се използва за оценка на морфологичните увреждания на дебелото черво и не се наблюдават значителни разлики в дебелото черво сред експерименталните групи (фиг. 4а). Освен това, ефектите на TG и HT върху възпалението в дебелото черво и разрушаването на чревната бариера също бяха анализирани (фиг. 4b-d). В сравнение с тези на контролната група, броят на бокалните клетки и дебелината на слузния слой бяха намалени в групата CUMS. Последователно, протеиновата експресия на ZO-1 и нивата на IFN- и TNF- в дебелото черво бяха значително намалени (p < 0.05)="" и="" повишени="" (p=""><0,05 ),="" съответно,="" което="" предполага,="" че="" въпреки="" че="" не="" е="" предизвикано="" очевидно="" хистологично="" увреждане,="" подлагането="" на="" cums="" води="" до="" нискостепенно="" възпаление="" в="" дебелото="" черво="" и="" разрушаване="" на="" чревната="" бариера.="" след="" флуоксетин,="">(общи гликозиди)и лечение с ХТ, броят на бокалните клетки и дебелината на мукусния слой са увеличени, а нивата на IFN- и TNF- на дебелото черво са значително намалени (p < 0.05).="" в="" допълнение,="" tg="" и="" ht="" значително="" повишават="" (p=""><0,05) протеиновата="" експресия="" на="" zo-1="" до="" ниво,="" подобно="" на="" това="" на="" контролната="" група.="" тези="" резултати="" показват,="" че="">(общи гликозиди)и HT може да облекчи нискостепенното възпаление в дебелото черво и разрушаването на чревната бариера при плъхове CUMS.

Ефекти на TG и HT върху състава на чревната микробиота

След премахване на неквалифицирани последователности бяха получени общо 1 874 721 ефективни прочитания. Резултатите от алфа разнообразието (фиг. 5a) и бета разнообразието (фиг. 5b) показват, че въпреки че богатството (Chao) и разнообразието (Shannon) на чревната микробиота в съдържанието на цекума не се различава, цялостната структура на чревната микробиота в диаграмата за анализ на главните координати (PCoA) показва забележителна разлика между контролните и CUMS групите. Освен това TG(общи гликозиди)и третирането с HT значително повишава бактериалното богатство на CUMS плъхове и предизвиква значителни разлики в графиката на PCoA в сравнение с тези на CUMS плъхове, показвайки ясни прилики с контролите, особено когато TG(общи гликозиди)беше анализиран.

Таксономичните промени в микробиотата допълнително потвърдиха, че TG(общи гликозиди)упражнява драматичен регулаторен ефект върху състава на чревната микробиота. След TG(общи гликозиди)администриране, изобилието на повечето променени таксони в плъхове CUMS беше обърнато до ниво, подобно на това на контролната група. Значително намаление (14,2 процента, p < 0.05)="" и="" обогатяване="" (53,6="" процента,="">< 0.05)="" in="" the="" abundances="" of="" the="" phylum="" firmicutes="" and="" bacteroidetes="" were="" observed="" in="" the="" tg="">(общи гликозиди)група в сравнение с групата CUMS (фиг. 5в), съответно. Последователно, на семейно ниво (допълнителна таблица S4), TG намалява изобилието на Ruminococcaceae (тип Firmicutes) и Peptococcaceae (тип Firmicutes) съответно с 33,9 процента и 82,9 процента в сравнение с групата CUMS (p < 0).="" {{10}}5).="" обратно,="" значително="" обогатяване="" на="" изобилието="" на="" семейство="" erysipelotrichaceae="" (тип="" firmicutes,="" 78,4="" процента,="" p=""><0,05) и="" muribaculaceae="" (тип="" bacteroidetes,="" 77,3="" процента,="" p=""><0,05) съществува="" в="" tg="" групата.="" последователно="" на="" ниво="" род="" (фиг.="" 5d),="" изобилието="" на="" anaerotruncus,="" harryflintia,="" ruminiclostridium_9,="" некласифицирани_f_ruminococcaceae="" (членове="" на="" семейство="" rumino-coccaceae)="" и="" peptococcus="" (член="" на="" семейство="" peptococcaceae)="" са="" значително="" намалени,="" докато="" norank_f_erysipelotrichaceae,="" allo="" baculum,="" dubosiella="" (членове="" на="" семейство="" erysipelotrichaceae)="" и="" norank_f{{24}="" }muribaculaceae="" (член="" на="" семейство="" muribaculaceae)="" показва="" по-високо="" изобилие="" в="" групата="" tg,="" отколкото="" това="" на="" групата="" cums="">< 0.05).="" in="" addition,="" tg="" decreased="" the="" abundances="" of="" tyzzerella_3,="" acetatifactor,="" and="" norank_f_lachnospiraceae="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae="" (p="" <="" 0.05),="" although="" the="" abundance="" of="" the="" family="" lachnospiraceae="" was="" similar="" across="" all="" experimental="" groups.="" unlike="" tg,="" ht="" decreased="" the="" abundances="" of="" partially="" altered="" taxa="" induced="" by="" cums,="" including="" the="" family="" ruminococcaceae,="" 3="" genera="" (anaerotruncus,="" harryflintia,="" and="" ruminiclostridium_9)="" assigned="" to="" the="" family="" ruminococcaceae="" and="" 2="" genera="" (tyzzerella_3,="" acetatifactor)="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae.="" additionally,="" converse="" variations="" were="" observed="" in="" the="" abundances="" of="" ruminococcaceae_ucg_013="" and="" streptococcus="" in="" the="" ht="" group.="" these="" results="" indicated="" that="" tg="" and="" ht="" exerted="" clear="" differences="" in="" the="" regulation="" of="" gut="" microbiota="" composition,="" and="" the="" effect="" of="" tg="" was="" superior="" to="" that="" of="" tg="" especially="" in="" altering="" the="" genera="" assigned="" to="" the="" family="" erysipelotrichaceae,="" peptococcaceae,="" and="">

Корелационен анализ на променени микробни родове, засегнати от TG(общи гликозиди)и HT, хормони, свързани с HPA оста, провъзпалителни цитокини, 5-HT и BDNF

За да се изяснят връзките между промените в състава на чревната микробиота, засегнати от TG(общи гликозиди)и HT, и съответните черти, свързани с депресия, беше извършен корелационният анализ на Spearman. Както е показано на Фиг. 6, нивата на 5-HT и BDNF в хипокампуса са само значително положително корелирани с norank_f_Muribaculaceae. В противен случай могат да се идентифицират ясни корелации между променените микробни родове и свързаните с HPA оста хормони. По-специално, Dubosiella, norank_f_Muribaculaceae, norank_f_ Erysipelotrichacea и Peptococcus са тясно свързани с функцията на HPA оста. Серумните CORT, CRF и ACTH имат отрицателни корелации с Dubosiella, norank_f_Muribaculaceae и norank_f_Erysipelotrichacea и положителни асоциации с Peptococcus. Освен това, Dubosiella и norank_f_ Erysipelotrichacea показват отрицателни асоциации с IFN- на дебелото черво и хипокампалния TNF-, докато подобни връзки съществуват в Allobaculum, Harryfinita и серумния и хипокампалния TNF-, както и в norank _f_Lachnospiracea и серумен IFN- и TNF- . Обратно, Peptococcus е положително свързан с TNF- на дебелото черво и серумен TNF-. По същия начин norank_f_Muribaculaceae е положително свързан със серумните IFN- и TNF-. Тези резултати показват, че променените микробни родове, особено някои родове, принадлежащи към семейството Erysipelotrichaceae, Peptococcaceae и Muribaculaceae, които са специфично засегнати от TG, показват силни асоциации с хормони, свързани с HPA оста, и провъзпалителни цитокини едновременно, демонстрирайки критичната роля на чревната микробиота при регулиране на функцията на HPA оста и възпалението.

TG(общи гликозиди)и HT инхибират метаболизма на триптофан-кинуренин при CUMS плъхове

Ефектите на TG(общи гликозиди)и НТ върху нивата на триптофан и кинуренин в серума на плъхове, както и експресията на IDO1 в дебелото черво и хипокампуса са определени. Както е показано на Фиг. 7 и Фиг. 8, в сравнение с това на контролната група, нивото на триптофан в серума е значително намалено в групата CUMS, за разлика от повишеното ниво на кинуренин и съотношението кинуренин към триптофан (Kyn /Trp) и IDO1 протеинова експресия в дебелото черво и хипокампуса. В сравнение с групата CUMS, серумният Kyn/Trp в групата FLX е значително намален (стр< 0.05).="" tg="">(общи гликозиди)и лечението с ХТ доведе до значително повишаване на серумното ниво на триптофан при CUMS плъхове (p < {{0}}.05)="" и="" намаляване="" на="" нивата="" на="" серумния="" кинуренин="" и="" kyn/trp="" (р=""><0,05). в="" допълнение,="" tg="" значително="" инхибира="" експресията="" на="" ido1="" протеин="" в="" дебелото="" черво="" на="" cums="" плъхове="" (p=""><0.05), докато="" незначителна="" разлика="" в="" експресията="" на="" ido1="" протеин="" в="" хипокампуса="" се="" наблюдава="" между="" cums="" и="" tg="" групите.="" въпреки="" това,="" ефектът="" на="" ht="" върху="" експресията="" на="" ido1="" протеин="" в="" дебелото="" черво="" и="" хипокампуса="" е="" противоположен="" на="" този="" на="" tg,="" което="" показва,="" че="" tg="" и="" ht="" инхибират="" метаболизма="" на="" триптофан-кинуренин="" чрез="" намаляване="" на="" експресията="" на="" ido1="" в="" дебелото="" черво="" и="" хипокампуса="" на="" cums="" плъхове,="" съответно="">

Дискусия

В това проучване са използвани два различни животински модела за скрининг на биоактивни съединения в КТ(Цистанчеtubulosa)които облекчават подобно на депресия поведение за първи път. TP и TO най-вероятно са били неефективни съставки в CTE, докато TG(общи гликозиди)показва най-голям потенциал при лечението на депресия. Предишни изследвания на КТ(Цистанчеtubulosa), както иЦистанчерастения, са се фокусирали най-вече върху биоактивностите на фенилетаноидните гликозиди с най-високо съдържание и са пренебрегнали значението на иридоидните гликозиди и други по-малко изобилни съставки. Интересното е, че нашето проучване показа, че фенилетаноидните и иридоидните гликозиди показват синергични ефекти върху хиперактивността на HPA оста, тежко периферно и неврално възпаление и дефицити в хипокампалния 5-HT и BDNF, което може да е критичната причина за благоприятния антидепресант ефект на TG(общи гликозиди). Тези резултати допълнително предполагат многокомпонентните и многоцелеви характеристики на билковата медицина и ни напомнят, че съставките с по-ниски нива, дори следи от съставки, също могат да играят ключова роля във фармакологичните ефекти.

Хроничният стрес индуцира хиперактивността на HPA оста, което насърчава появата на депресия, както и потискането на HPG оста чрез намалено освобождаване на GnRH и/или чувствителност на хипофизата към GnRH (Kirby et al., 2009). Междувременно cAMP и cGMP са важни междинни центрове, които разчитат на много невротрансмитери и хормони, за да упражнят своите физиологични ефекти (Siawrys et al., 2002). Последните проучвания последователно показват, че появата на бъбречно-ян дефицит е тясно свързана с дисфункцията на оста хипоталамус-хипофиза-целева жлеза (Zhang et al., 2019). При синдрома на бъбречно-ян дефицит също са наблюдавани изразени понижения в нивата на серумния cAMP и cAMP/cGMP. В това проучване установихме, че TG(общи гликозиди)може да инхибира нивата на серумния CORT, CRF и ACTH и да повиши съдържанието на серумния Т и GnRH при CUMS плъхове, което показва възстановяване на дисфункцията на HPA и HPG оста след прилагане на TG. Освен това TG(общи гликозиди)обръща значително намаляване на нивото на серумния cAMP/cGMP при плъхове, подложени на CUMS. По този начин, потенциалният основен механизъм на CT(Цистанчеtubulosa) при лечението на депресия и дефицит на бъбречен ян може да бъде частично сходен и заслужава да бъде проучен допълнително. Освен това, производството на сексуално желание и поведение е сложен процес на невронни рефлекси. Половите хормони са основни източници на централна сексуална възбуда и липсата на полови хормони може да причини по-малко сексуално желание или сексуална дисфункция (Holloway и Wylie, 2015). По-специално, прекомерната 5-HT инхибира освобождаването на GnRH, което е доминираща причина за появата на хронична сексуална дисфункция след продължително лечение със SSRI (Prasad et al., 2015). В нашето проучване флуоксетин (представител на SSRIs) е неефективен при дисфункция на HPG оста. Въпреки това, въпреки че TG(общи гликозиди)значително подобрява нивото на 5-НТ в хипокампуса, наблюдавани са също подобни промени в серумните нива на Т и GnRH, като по този начин се подобрява потискането на HPG оста. Тези резултати демонстрират ясното предимство на КТ(Цистанчеtubulosa) при лечението на депресия и присъщият механизъм, отговорен за тези ефекти, трябва да бъде допълнително проучен.

Все повече доказателства показват, че червата са потенциална цел за лечение на хронични заболявания, като се използват естествени съединения с ниска бионаличност (Zhou et al., 2020). Скорошни изследвания (Wei et al., 2019) показват, че лечението с CUMS предизвиква промени в микробиома на фекалиите и дефекти на чревната бариера, което улеснява бактериалната инвазия в лигавицата на дебелото черво и изостря възпалителните реакции в дебелото черво. В съответствие с този доклад, нашите резултати показват, че 4 седмици експозиция на CUMS предизвиква значително намаляване на броя на бокалните клетки и дебелината на слузния слой в дебелото черво на плъхове, както и началото на разрушаване на чревната бариера, представено от повишена чревна пропускливост, която се определя от измерване на протеина ZO-1. В допълнение, повишена експресия на провъзпалителни фактори (като TNF- и IFN-) се наблюдава в дебелото черво. Съответно, тези констатации показват, че въпреки че не е предизвикано очевидно хистологично увреждане, лечението с CUMS инициира възпаление на дебелото черво и разрушаване на чревната бариера. Предишни проучвания съобщават, че CT е показала подобрена ефикасност при предотвратяване на DSS-индуциран колит при мишки (Jia et al., 2014). Непоследователно, TG(общи гликозиди)е доказано също, че облекчава слабото възпаление в дебелото черво и разрушаването на чревната бариера на плъхове CUMS, което подчертава неговия потенциал за клинично лечение на заболявания, свързани с възпаление на дебелото черво.

Обширни проучвания също така демонстрират, че връзката, свързваща коменсалната чревна микробиота, HPA оста и възпалението, е сложна и играе решаваща роля в развитието на депресия (Misiak, et al., 2020). Промените в състава на чревната микробиота могат да допринесат за повишеното освобождаване на цитокини и синтеза на малки биоактивни молекули (Du et al., 2020). Някои цитокини (като TNF-) могат да преминат през кръвно-мозъчната бариера и са мощни активатори на HPA оста (Misiak et al., 2020). На свой ред, хиперактивирането на HPA оста може да допринесе за дисбиоза на чревната микробиота, хронично възпаление в дебелото черво и променена чревна пропускливост (Misiak et al., 2020). В съответствие с предишни проучвания, медикаментозната с TG модификация на чревната микробиота вероятно е отговорна за нейните облекчаващи ефекти върху депресията. Наблюдавахме, че TG(общи гликозиди)обърнаха изобилието от микробни таксони на различни нива при плъхове, подложени на CUMS, до ниво, подобно на това на контролите. По-специално, установено е, че основните променени родове, принадлежащи към семейството Peptococcaceae, Erysipelotrichaceae и Muribaculaceae, са силно свързани с HPA оста и възпалението. В съответствие с нашите резултати се съобщава, че семействата Peptococcaceae, Erysipelotrichaceae и Muribaculaceae играят важна роля в поддържането на целостта на лигавичната бариера и появата на възпаление (Kankoush, 2015; Borton et al., 2017; Zhang et al., 2020). Следователно, ние предположихме, че TG може да намали изобилието на някои родове, приписани на семейството Erysipelotrichacea, Peptococcaceae и Muribaculaceae, впоследствие облекчавайки нискостепенното възпаление в дебелото черво, хиперактивността на HPA оста и нарушаването на целостта на лигавичната бариера. Интересното е, че в нашето изследване само един род, наречен nor ank_f_Muribaculaceae, е свързан с 5-HT и BDNF в хипокампуса. Конкретният механизъм на връзката остава неясен и трябва да бъде проучен допълнително. В противен случай констатациите също предполагат, че е изключително трудно за повечето от променените родове, причинени от TG, да повлияят директно на нивата на 5-HT в хипокампуса. За да обясним как промените в състава на чревната микробиота влияят върху нивото на 5-HT на хипокампа след лечение с TG, сложната връзка, свързваща метаболизма на триптофана, HPA оста, възпалителните цитокини и 5-HT привлече вниманието ни. Триптофанът е основна аминокиселина за хората и по-малко от 1 процент се използва в протеиновия синтез, като по-голямата част (над 90 процента) се превръща от IDO1 и триптофан 2, 3-диоксигеназа 2 (TDO2) в кинуренини и приблизително 5 процента се задвижват от триптофан хидроксилаза надолу по пътя на серотонина (Duan, et al. 2018). Нивото на 5-HT в мозъка до голяма степен зависи от наличността на периферния триптофан, като се има предвид, че триптофанът се транспортира в мозъка чрез транспортери на неутрални аминокиселини (Duan et al., 2018). IDO1, ограничаващият скоростта ензим в първата стъпка от кинурениновия път, се индуцира предимно от IFN- и други провъзпалителни цитокини, като IL-1 и TNF- (Kennedy et al., 2017), които са показали, че са свързани с чревната микробиота в нашето проучване. Както се съобщава, повече триптофан се метаболизира през кинурениновия път, като по този начин конкурентно намалява превръщането на триптофан в 5-HT и се свързва с намалената 5-HT, често срещана при депресия (O'Mahony et al., 2015 г.). По този начин по-ниските нива на триптофан и по-високите Kyn/Trp са често срещани и съвпадат с повишен риск от депресивно настроение. След прилагане на TG, свръхекспресията на IDO1 в дебелото черво се инхибира, което води до повишени серумни нива на триптофан и намаляване на серумния Kyn/Trp, което разкрива потенциалната връзка между чревната микробиота и нивото на 5-HT на хипокампуса, засегнато от TG. Междувременно BDNF, член на семейството на невротрофините, е от съществено значение за клетъчната диференциация, оцеляването на невроните, образуването на синапси и процесите на невропластичност при депресия (Greenberg et al., 2009). Скорошни проучвания показват, че е установено, че BDNF е тясно свързан с бариерната функция на чревната лигавица и чревната микробиота (Maqsood and Stone, 2016). Освен това се съобщава, че промените в чревната микробиота притежават потенциала да увеличат нивата на експресия на BDNF и по този начин да повлияят на развитието на подобно на депресия поведение (Du et al., 2020). Въпреки това, подобно на 5-HT вариацията, беше изключително невъзможно повечето променени родове, причинени от TG в нашето изследване, да повлияят директно на нивата на BDNF в хипокампуса, а присъщата молекулярна връзка и механизъм се нуждаят от допълнително изследване.

За разлика от това, HT, метаболит на чревната микробиота на TG(общи гликозиди), също показва антидепресивен ефект в настоящото проучване, което е в съответствие с неговата благоприятна невропротективна активност (Hu et al., 2014). Притеснение е, че ХТ може също така да намали провъзпалителните цитокини, хормоните, свързани с HPA и HPG оста, и хипокампалните 5-HT концентрации до ниво, подобно на това на контролите при плъхове CUMS, докато повечето от променените микробни родове са засегнати от HT има слаби корелации с горните физиологични индекси, което предполага, че чревната микробиота може да не е целта на антидепресантната активност на HT. Освен това, HT потиска свръхекспресията на IDO1 в хипокампуса, но не и в дебелото черво, придружено от повишени серумни нива на триптофан. Появата на очевидните разлики между TG(общи гликозиди)и HT може да се дължи на отличната абсорбция на HT в кръвния поток и способността на HT да преминава кръвно-мозъчната бариера (Robles-Almazan et al., 2018), което също показва, че силният метаболитен капацитет на чревната микробиота е особено важен за антидепресивната активност на TG, в допълнение към неговите физиологични функции. Следователно, ние предварително доказахме, че двупосочното взаимодействие на фитохимикалите и чревната микробиота играе критична роля при лечението на депресия с приложение на TG (както е показано на Фиг. 9).

Заключение

В обобщение, TG(общи гликозиди)е отговорен главно за антидепресивната активност на CT(Цистанчеtubulosa), което се отразява в синергичните ефекти на фенилетаноидите и иридоидните гликозиди върху хиперактивирането на HPA оста, тежко периферно и неврално възпаление и дефицити на 5-HT и BDNF в хипокампуса. Освен това, потенциалният молекулярен механизъм на антидепресантния ефект на TG(общи гликозиди)се постига чрез двупосочно взаимодействие на фитохимикалите и чревната микробиота. В допълнение, подобрение на потисната HPG ос и циклична нуклеотидна аномалия от TG(общи гликозиди)и HT, които не се регулират от лечение със SSRIs, представени от флуоксетин, показват ясното предимство на CT при лечението на депресия. Такива модулации представляват обещаваща стратегия за лечение на депресия с помощта на КТ(Цистанчеtubulosa) и подобни традиционни билкови лекарства.

Авторски принос

XL, YP и LF проектираха експериментите и анализираха данните. LF и JW извършиха експеримента и анализираха данните. LF и XL съставиха ръкописа. PM допринесе за експеримента с животни и тестването на проби, а LZ допринесе за анализа на състава на чревната микробиота. Всички данни са генерирани вътрешно и не е използвана фабрика за хартия. Всички автори се съгласяват да носят отговорност за всички аспекти на работата, като гарантират почтеност и точност.

Декларация за конкурентен интерес

Авторите декларират, че няма конфликт на интереси.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от грантове от Националния ключов проект за изследване и развитие (2017YFC1702400).

Допълнителни материали

Допълнителни материали, свързани с тази статия, могат да бъдат намерени в онлайн версията на doi:10.1016/j.phymed.2021.153471.

От: 'общи гликозиди от стъбла наЦистанчеtubulosaоблекчаване на подобно на депресия поведение: двупосочно взаимодействие на фитохимикалите и чревната микробиота“ чрезЛи Фан и др

---Фитомедицина 83 (2021) 153471/ https://doi.org/10.1016/j.phymed.2021.153471