Резюме:ИзползванеCistanche DeserticolaПаразитизирайки две растения гостоприемник (Haloxylon Ammodendron и Atriplex canescens) Като тестови материали, това проучване определя съдържанието на полизахарид в C. deserticola от различни гостоприемници, използвайки метода на фенол-сулфурната киселина. Транскриптно секвениране и анализ на Haloxylon-Cistanche иAtriplex-Cistanche асоциациибяха проведени с помощта на платформата за секвениране на Illumina Novaseq 6000. Изследването се фокусира върху изследване на разликите в транскриптома в C. deserticola от различни гостоприемници, скрининг на ключови ензимни гени, участващи в метаболизма на полизахарид, и валидиране на избраните гени чрез проверка на QRT-PCR. Това проучване има за цел да даде теоретична основа за изследване на нови растения гостоприемник и генетично подобрение на C. deserticola. Резултатът показа, че съдържанието на полизахарид, намиращо се в Atriplex Quadriptera-C.Deserticola, е по-добро от това, присъстващо в Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola. Чрез сравнителен анализ на транскриптома, 14089 диференцирано експресирани гени (DEGs) са прегледани от месестите стъбла на Atriplex Quadriptera-C. Deserticola и Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola. Резултатите от анализа на обогатяването на KEGG разкриха, че тези DEG са най -наклонени по пътищата, свързани с метаболизма на въглехидратите, метаболизма на галактозата, метаболизма на аминокиселини и метаболизма на мастните киселини. Освен това са получени общо 26 градуса от четири пътя, свързани с полизахаридния метаболизъм, сред които нивата на експресия на гена на фруктозидаза и -галактозидаза в халоксилон амодендрон -С. Deserticola са значително по-високи от тези в Atriplex Quadriptera-C. Deserticola. Нивата на експресия на UDP-глюкозен дехидрогеназа ген и маноза -1- фосфат гуанилат трансфераза ген в Atriplex Quadriptera-C. Deserticola са значително по-високи от тези в Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola, който може да са ключовите ензимни гени за регулиране на разликата в метаболизма на полизахарид в C. deserticola.

Ключови думи Cistanche Deserticola; Транскриптно секвениране; домакини; Разлика на метаболизма на полизахарид

Cistanche Deserticola

 

Cistanche deserticola yc ma, предимно разпределено вGansu, Xinjiang, Ningxia и Inner Mongolia, е традиционна китайска лечебна билка, наскоро включена в"Лекарствени и хранителни хомоложни"Каталог. Има различни ползи за здравето, катоТонизиращ бъбрек Ян, подхранваща същност и кръв и насърчаване на движенията на червата, правейки го широко приложен вмедицина, здравеопазване и хранителна индустрия[1]. Поради своетоХетеротрофна природа, Cistanche Deserticolaпаразитира различни растения гостоприемник, сHaloxylon Ammodendronи новоизведенотоПолуверен храстAtriplex canescens(Pursh) Nutt.като основни домакини.

Полизахаридите са ключовите активни вещества при оценкатаCistanche Deserticolaкачество. При различни условия на хоста,натрупване и метаболитен съставнаЦистанчеПолизахаридите варират значително [2]. Медицинските изследвания показват товаЦистанчеПритежават полизахаридиантиоксидант, невропротективен, имуно-регулиращ и повишаващ паметтафармакологични ефекти, ефективно облекчаванеБолестта на Алцхаймер, болестта на Паркинсон и недостиг на далака, предизвикана от далака[3]. С напредък в съвременнияТехники за извличане и технологии за анализ на многоспектърни, TheСъдържание, композиция и структурни характеристикинаЦистанчеПолизахаридите постепенно се изясняват, разширявайки приложенията си.

По отношение наИзследване на молекулярна биологиянаЦистанчевидове, изследвания за секвениране на транскриптоми са фокусирани главноCistanche TubulosaиХалоксилон-ЦистанчеСложни системи.Например,Hou et al.[4] извършениПълно-транскриптно секвениране и профилиране на генната експресиянаCistanche TubulosaИзползванеPacbio и Bgiseq -500 RNA-Seq Technologies, идентифициране237,772 Уникални преписии скрининг ключови ензимни гени, участващи вФенилетаноидна биосинтеза на гликозид. По същия начин,Feng et al.[5] проведенитранскриптомични и метаболомични анализина Хаустория и съседни тъкани наХалоксилон корени иЦистанчемесести стъбла, разкривайки ролята на домакина в натрупването наЦистанчеметаболити. Тяхното проучване подчерта, чеЗаводът домакин не само влияе на добива наЦистанчено и неговото качество. Изследване наЦистанчеПаразитизирането на различни растения гостоприемник остава ограничена.

Atriplex canescens, a дълбоко вкоренено и силно устойчиво растение, се различава от традиционнотоHaloxylon Hostи произхожда отПолусухи плато на централните Съединени щати. През последните години той е въведен и популяризиран като aНов домакин заCistanche DeserticolaотглежданевСеверозападен Китай. A Qing et al.[6] анализира и сравняваПолисахаридно натрупване наЦистанчепаразитизиране на халоксилон и атриплекс canescensв същата производствена зона, намиранеЗначителни разлики в съдържанието на полизахаридмежду двете условия на хоста.

Така това проучване има за целпоследователност месестите стъбла наCistanche Deserticolaпаразитизиране на халоксилон и атриплекс canescens, Анализиране наДиференциална експресия на ключови ензимни гени, участващи в биосинтезата на полизахарид. Констатациите ще осигурят aтеоретична основа за допълнителни изследвания наЦистанчеПолизахаридни механизми за биосинтеза, обогатяване на транскриптомични изследвания на атриплекс-Цистанчесистеми и насърчават иновациите във висококачественитеЦистанчересурси за зародишна плазма.

 

Материали и методи

1.1 Експериментални материали

Cistanche Deserticolaпроби паразитизиращиHaloxylon AmmodendronиAtriplex canescensса събрани отЦистанчеотглеждане на база вКсикан град, окръг Джингтай, провинция Гансу(ширина36 градуса 5 'n, дължина103 градуса 42 'E). И дветеХалоксилониAtriplex canescensса култивирани в една и съща среда. Пробите бяха категоризирани катоХалоксилон-Цистанче(Проба А)иАтриплекс--Цистанче(Проба H),с три повторения за всяка категория (пет растения на реплика). Е проведена вземане на проби вАприл 2024 г.и пробите бяха идентифицирани катоCistanche Deserticolaмесести луковици отПрофесор Гоо ЙехонготКолеж по земеделие, Земеделски университет Гансу.

СледНасоки за вземане на проби на Shanghai OE Biotech Co., Ltd., TheЦистанчеМесните стъбла се изплакват с ултрачиста вода и излишната влага се отстранява с помощта на филтърна хартия. Тънки филийки са взети ототгоре, среден и отдолуна всяко стъбло, смесено старателно и поставени в криогенни флакони. Пробите бяхабързо замразени в течен азотза2 часаПреди да бъде прехвърлен в a-80 фризерза съхранение [7].

1.2 Експериментални методи

1.2.1 Създаване на стандартна крива и определяне на съдържанието на полизахарид

A 10 мгпроба отD-глюкозен стандарте претеглено и разтворено в a100 ml обемна колбас дестилирана вода за приготвяне на a100 ug · ml⁻⁻ Разтвор на запас. Калибриращи разтвори на{{0}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 7, 0.на разтвора на запасите бяха прехвърлени в10 мл запушаващи се епруветки, разреден с вода до1. 0 ml, и след това се смесиха с1. 0 ml от 6% фенол разтвори5 ml концентрирана сярна киселина. След вихъра разтворите се нагряват във вана с вряща вода за20 минути, след това се охлади в вана с ледена вода за10 минути. A празно управлениебеше подготвен с помощта на1. 0 ml дестилирана водавместо разтвора на глюкоза. Абсорбцията се измерва при482 nmИзползване на aUV-VIS спектрофотометъри aСтандартна кривае генериран сконцентрация (x) като хоризонтална осиабсорбция (y) като вертикална ос.

След модифициран подход отLi Jie et al. [8], 0. 2 g изсъхналоЦистанчепрахбеше претеглено точно и поставено в a20 ml запушена епруветка. 10 ml 80% етанолсе добавя и сместа се подлага наУлтразвукова екстракция при 80 градуса (100 W, 40 kHz) за 30 минути. Екстрактът се филтрира, докато е горещо и процедурата се повтаря веднъж. След изсушаване на остатъка,10 ml дестилирана водасе добавя и ултразвуковото извличане се повтаря два пъти. Филтратите се комбинират и разреждат до20 mlс дестилирана вода.1. 0 ml от този разтворбеше допълнително разреден до10 mlс дестилирана вода.

A 1. 0 ml аликвотана подготвенитеЦистанчеПробният разтвор се анализира, като се използва същата процедура като стандарта на глюкозата. Абсорбцията при482 nmе измерено и съдържанието на полизахарид наЦистанчеот различни растения гостоприемник се изчислява.

1.2.2 Извличане на РНК, изграждане на библиотека на кДНК и секвениране

Общата РНК се извлича отCistanche Deserticolaпроби паразитизиращиHaloxylon AmmodendronиAtriplex canescensИзползване наTiangen DP441 RNA комплект (Китай), следвайкиПротокол за реагент на TRIZOL. Чистотата на РНК се оценява с aNanodrop 2000 спектрофотометър (Thermo Scientific, САЩ), докато концентрацията и целостта на РНК са оценени с помощта на AnAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, САЩ).

Библиотеките на транскриптоми са конструирани с помощта наVahts Universal V6 RNA-Seq Bibrary Prep Kit. След контрол на качеството сБиоанализатор Agilent 2100, библиотеките бяха секвенирани наПлатформа Illumina Novaseq 6000, генериране150 bp сдвоени четения.

1.3 Анализ на данните

1.3.1 Сглобяване на транскриптома и функционална анотация

Сурови четения вFastq форматса обработени с помощта наТримоматичниза премахванеPloy-N чете и нискокачествени четения, което води доЧисти четения. Последователностите на адаптера и нискокачествените региони бяха отстранени и чистите показания бяха сглобени вКонтигс(изразени тагове за последователност) с помощта наТроица софтуер. Най -дългият препис от всеки клъстер е избран като aUnigeneза допълнителен анализ.

Функционалната анотация на унигените беше извършена чрез сравняване с тях сNCBI не-съкращение (NR) протеинова база данни, швейцарска Prot и еволюционната генеалогия на гените: база данни, които не са надвишаващи ортологични групи (EGGNOG)ИзползванеDiamond Software (e-стойност <1e -5). Анотация на еукариотни ортологични групи (KOG)е извършен за идентифициране на хомоложни гени. Освен това, унигените бяха картографирани наКиото Енциклопедия на пътищата на гени и геноми (KEGG)За анотация на метаболитен път.Класификация на генната онтология (GO) и функционална анотацияса проведени с помощта на карти от базата данни на Swiss-Prot.

1.3.2 Анализ на генната експресия и идентифициране на различно експресирани унигени (DEGs)

Нивата на генна експресия бяха количествено определени с помощта наПапийонка2За да изравните чистите четения към унигените. Стойностите на експресията се изчисляват катоФрагменти на килобаза препис на милион картографирани четения (FPKM)ИзползванеЕкспресен софтуер. Анализът на диференциалния израз е извършен с помощта наСофтуер DESEQ2, сТестове от отрицателно биномиално разпределение (NB)използва се за тестване на значимост. Различно експресирани гени (DEGs) са дефинирани като тези сq-стойност <0. 05иСгънете промяна (FC)> 2.

1.3.3 QRT-PCR валидиране на различно експресирани гени

Ключови ензимни гени, участващи вПолизахаридна биосинтезасзначителна диференциална експресиябяха избрани заКоличествено валидиране на PCR в реално време (qRT-PCR). Пробите от РНК бяха проверка на качеството и стойностите на OD бяха измерени преди обратната транскрипция. СДНК синтеза се извършва с помощта наTransscript All-in-One Първата верига CDNA синтез Supermix за комплект QPCR. Синтезираната cDNA се разрежда10- сгъванеи qRT-PCR се провежда с помощта на aФлуоресцентна QPCR системапри различни условия на колоездене.ACTB (бета-актин) се използва като вътрешен референтен гени относителните нива на генна експресия се изчисляват, като се използва2⁻ΔΔCT метод.

 

Таблица 1 Праймерни последователности

Генен идентификатор	Име на ген	Преден грунд (5 '-3')	Обратна грунд (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2	ГМПП	Gatagtggctacaacatccactt	CCTCCTCTTCGTGTCGTAGGATTC
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2	Pfp	Tatatgggaccatggaaccaa	Gaccataggccgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1	Ugdh	Aaagatcttccagttcgtaagc	Accaattcgttgatgctacc
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1	lacz	Gtctccttgttattcgtgaggat	Gtcgatggtggtgaagcagat
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1	Сака	TTACGAGGATAGTGGTGCTA	Aatggaagatgaggaggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2	lacz	Ggcacagtcaaggagtacgatg	CACTGGCATCGACGAGGAAAG
-	Actb	Caatggatgatgatatcgccgcgt	CACTGGCATCGACGAGGAAAG

 

 

1.4 Анализ на данните

Йерархичен клъстеринг анализ наразлично експресирани гени (DEGs)се извършва с помощта наR (v3.2.0)за визуализиране на моделите на генна експресия в групи и проби. Go (генна онтология) анализ на обогатяването иKEGG (Киото Енциклопедия на гени и геноми) Анализ на обогатяване на пътяса проведени с помощта наR, въз основа наХипергеометрично разпределение. Значително обогатените функционални термини бяха показани с помощта набар диаграми, сюжети за балончета и графики за обогатяване на кръга.

2 резултати и анализ

2.1 Резултати от определяне на съдържанието на полизахарид

Линейното уравнение на регресия, получено от измерванията на абсорбцията, беше:

y {{0}}. 0 154x - 0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. 0154x - 0. 1636 \ Quad (R^2=0. 9963) y =0. 0154x - 0.1636 (r 2=0. 9963)

с линеен обхват от20–90 ug · ml⁻⁻. Прецизността, повторяемостта, стабилността и степента на възстановяване на пробата бяха{{0}}. 38%, 0. 86%, 0,53%и 99,67%, съответно.

ИзмеренотоСъдържание на полизахаридвCistanche DeserticolaПроби от различни растения гостоприемник бяха:

Халоксилон-Цистанче: 6.51%

Атриплекс--Цистанче: 11.83%

2.2 Транскриптно секвениране и сглобяване на данни

Транскриптно секвениране наШест пробигенерира общо41,77 g чисти данни. Валидните данни за извадка варират от6,89 g до 7,04 g, сQ30 базови проценти между 95,38% и 95,91%и anСредно съдържание на GC от 45,13%.

Общо61,423 унигенибяха сглобени, с обща дължина на65 962 858 базисни пунктаисредна дължина от 1,073,91 bp.

2.3 Генна функционална анотация

Общо61,423 унигениса получени от секвенирането наCistanche Deserticolaпроби, паразитизиращи две различни растения гостоприемник. Резултатите от пояснението са както следва:

30 689 унигени (49,96%)бяха анотирани вNR (ненуледна) протеинова база данни.

18 698 унигени (30,44%)бяха анотирани вБаза данни на швейцария.

3,998 унигени (6,51%)бяха анотирани вБаза данни на KEGG.

17 188 унигени (27,98%)бяха анотирани вKOG (еукариотни ортологични групи) база данни).

25 280 унигени (41,16%)бяха анотирани вEggnog (Еволюционна генеалогия на гените: база данни, които не са надвизирани).

16,210 унигени (26.39%)бяха анотирани вGo (Gene Ontology) база данни.

16,153 унигени (26.30%)бяха анотирани вPFAM (протеинови семейства) база данни.

Сред тях,21 650 унигенибяха по -дълги от1 кб.

Анализ на хомология въз основа наNR база данниразкри, че първите три най -тясно свързани видове са:

Паулонова Фортуней (30,23%)

Phtheirospermum japonicum (14,15%)

Хеноподиев киноа (7,1%)

 

 

Таблица 2 Информация за пояснения наCistanche DeserticolaГенна функция

База данни	Номер на генната анотация	Пропорция (%)
Nr	30,689	49.96
Швейцарски Prot	18,698	30.44
Кег	3,998	6.51
Ког	17,188	27.98
Eggnog	25,280	41.16
Върви	16,210	26.39

 

 

2.4 GO и KEGG ФУНКЦИОННИ АНВЕНТИЦИЯ И Класификация

TheGo (Gene Ontology) база данние използван за по -нататъшно анотиране на унигените, идентифицирани вNR база данни, което води до общо16,210 унигени. Тези унигени бяха категоризирани вТри основни функционални групи:

Биологичен процес (BP)

Молекулярна функция (MF)

Клетъчен компонент (CC)

Вкатегория биологичен процес (BP), Най -изобилните унигенови клъстери бяха:

"Клетъчен процес" (11,023 унигени)

"Метаболитен процес" (9,117 UNIGENES)

Закатегория клетъчен компонент (CC), 17 подкатегорииса идентифицирани, като всяка подкатегория съдържа поне30 унигени. Най -големите клъстери бяха:

"Клетка" (13,947 UNIGENES)

"Клетъчна част" (13 918 Унигени)

ВКатегория молекулярна функция (MF), Най -обогатените функционални групи бяха:

"Обвързване" (10,039 унигени)

"Каталитична активност" (8 490 унигени)

Фиг.2 GO функционално анотация и класификация на унигените

 

Функционална анотация и класификация на KEGG

По време наТранскриптно секвениране, общо3,998 UNIGENESбяха анотирани вKEGG (Kyoto Encyclopedia на гени и геноми) база данни. Тези унигени бяха класифицирани вШест основни категории, със съответните си универсални броя и пропорции, както следва:

Клетъчни процеси: 326 UNIGENES (8.15%)

Обработка на информация за околната среда: 299 UNIGENES (7.47%)

Генетична обработка на информация: 1,771 унигени (44.30%)

Човешки заболявания: 14 унигени (0.35%)

Метаболизъм: 1,465 унигени (36.64%)

Органични системи: 123 Unigenes (3.07%)

Тези шест основни категории бяха допълнително разделени на20 Вторични нива на класификация. Сред тях,Генетична обработка на информацияимаше най -висок дял, последван отМетаболизъм. В рамките наМетаболизъмКатегория, най -изобилните пътища бяха:

Метаболизъм на въглехидрати

Метаболизъм на мастни киселини

Флавоноиден метаболизъм

Фиг.

 

2.5 Анализ на диференциалната генна експресия и обогатяване наCistanche Deserticolaот различни хостове

Данните за секвениране на транскриптоми бяха филтрирани с помощта наКритерии за избор на диференциална експресия по подразбиране по подразбиране, което води до идентифициране на14,089 различно експресирани гени (DEGs):

6,576 гени бяха регулирани

7,513 гени бяха понижени

A Вулканен сюжете генериран за визуализиране на цялостното разпределение на DEG.

ВФункционални класификации за обогатяване на Топ 30 GOот DEGs беше наблюдавано, че:

В сравнение сБиологичен процес (BP)иКлетъчен компонент (CC)категории,Молекулярна функция (MF)прояви по -значително обогатяване на DEG.

Най -забележимо обогатените DEG са свързани сметаболизъм на нуклеинова киселина, протеинов метаболизъм и ключови ензими в метаболизма на галактозата.

Освен това, DEG са значително обогатени вGO Условия, свързани с полизахаридния метаболизъм, включително:

Метаболитен процес на нишесте

Биосинтетичен процес на гликоген

Катаболен процес на захароза

Активност на глюкозидаза

Активност на UDP-L-Rhamnose Synthase

Полисахаридна хидролазна активност

Фиг.4 Вулканична карта на различно експресирани гени

 

Анализ на обогатяването на пътя на Kegg на DEG вCistanche Deserticolaот различни хостове

За допълнително проучванеразлично експресирани гени (DEGs)вCistanche DeserticolaОт различни растения домакини,Анализ на обогатяването на пътя на Кеге изпълнен. Анализът разкри, че:

DEG са картографирани по 117 метаболитни пътища.

TheТоп 20 пътищапоказазначително обогатяване на DEG, с най -обогатените пътища, включително:

Метаболизъм на мастни киселини

-Миноленова киселина метаболизъм

Галактозен метаболизъм

Деградация на лизин

По -нататъшен анализ на обогатяването наТоп 20 метаболитни категории с най-малките Q-стойностипосочва, че DEG са значително обогатени в:

Органични системи

Метаболизъм

Генетична обработка на информация

Сред тези категории,"Метаболизъм"имаше най -голям брой обогатени DEG и показа най -значителното обогатяване. Освен това, в обогатените метаболитни пътища,Пропорцията на регулираните и понижените унигени е почти равна.

Тези открития предполагат, чеМетаболитните пътища играят решаваща роляв диференциалната генна експресия наCistanche Deserticolaот различни растения домакини, особено вЛипид, въглехидрати и метаболизъм на аминокиселини.