Упражнението на бягаща пътека предотвратява намаляването на пространственото обучение и паметта при 3×Tg-AD мишки чрез подобряване на структурната синаптична пластичност на хипокампуса и префронталния кортекс, част 2

2.5. Western Blot

Мишките се анестезират чрез вдишване на изофлуран и се обезглавяват. Тъканите на хипокампуса или префронталния кортекс бяха лизирани в студен RIPA лизисен буфер (Thermo ScientificPierce, Waltham, MA, USA), допълнен с протеазен и фосфатазен инхибиторен коктейл (Roche, Indianapolis, IN, USA).

Лизисните буфери позволяват на изследователите в биологичните лаборатории да контролират по-добре експерименталните условия, като по този начин по-добре изучават растежа и промените на клетките, което играе важна роля в академичните среди и медицинските изследвания.

Освен че са полезни за изследванията, буферите за лизис могат също да имат положително въздействие върху подобряването на човешката памет. Според най-новите изследвания, химическите компоненти, богати на лизисни буфери, могат да помогнат за насърчаване на растежа и развитието на нервните клетки, като по този начин подобряват паметта на мозъка.

Проучване установи, че определени компоненти в буферите за лизис могат да насърчат предаването на сигнал между определени нервни клетки, като по този начин подобряват способностите за учене и памет на мозъка. В допълнение, тези компоненти могат да стимулират растежа на нервните клетки и да помогнат на мозъка да се адаптира по-добре към нови среди и ново обучение. Резултатът от тези ефекти е, че хората могат по-добре да възприемат нови знания и да ги запомнят за по-дълго.

Разбира се, самите буфери за лизис не могат магически да разрешат всички проблеми с паметта. Учените все още трябва да проведат повече изследвания за това как да използват тези открития за подобряване на човешката памет. Въпреки това, положителното значение на това откритие вече е много ясно: буферите за лизис могат да осигурят добро начало за подобряване на човешката памет и да предоставят повече възможности за бъдеща научноизследователска работа. Може да се види, че трябва да подобрим паметта и Cistanche може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche е традиционен китайски лекарствен материал с много уникални ефекти, един от които е да подобри паметта. Ефектът на Cistanche идва от различните активни съставки, които съдържа, включително танинова киселина, полизахариди, флавоноидни гликозиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по различни начини.

Щракнете върху Знайте начини за подобряване на паметта

Общият протеин се измерва с помощта на BCA анализ (Thermo Scientific Pierce, САЩ). Пробите се нагряват при 100 ◦C за 15 минути. За Westernblot се зареждат равни количества протеин (20 ug/ямка) върху 12% гел. След електрофореза и прехвърляне към PVDF мембрани (Millipore, IPVH00010, Burlington, MA, USA), те се инкубират в продължение на 1 час при стайна температура с блокиращ буфер (5% BSA буфер).

PVDF мембраните се инкубират една нощ с първичното антитяло (GAPDH, 1:10, 000, Abcam, Бостън, Масачузетс, САЩ; PSD95, 1:500, Abcam, САЩ; Syn, 1:500, Abcam, САЩ) .

След това се промиват с TBST буфер три пъти на интервали от 5 минути и се инкубират в продължение на 1 час с HRP-конюгирано козе анти-заешко или HRP-конюгирано козе анти-мише вторично антитяло (1:15, 000, Proteintech Group, Rosemont , IL, САЩ), последвано от TBST промивания на интервали от 5 минути.

Нивата на протеин се откриват с хемилуминесцентни реагенти (ThermoScientific Pierce, Waltham, MA, USA) и лентите се измерват с помощта на софтуера Image J.

2.6. Електронна микроскопия

Мишките бяха дълбоко анестезирани с хлоралхидрат и перфузирани транскардиално с PBS, последвано от 4% параформалдехид и 2,5% разтвор на глутаралдехид в 0.1 Мфосфатен буфер за 20 минути.

Мозъкът беше отстранен и потопен в същия фиксатор за една нощ. Хипокампусът и префронталната кора бяха оцветени с 1% осмиев тетроксид и след това дехидратирани в градуирана серия от ацетон.

Тъканите бяха нарязани на ултратънки срезове, оцветени с уранил ацетат и оловен цитрат и изследвани с електронен микроскоп Hitachi H-7100. Снимки на произволни позиции от тези образци бяха направени при ×30,000 увеличение (22 µm2).

Предполага се, че синапсите с кръгли везикули, асиметричните синапси и единичен голям синаптичен контакт са възбуждащи синапси, докато пресинаптичните терминали с плеоморфни сплескани везикули и симетрични синапси са инхибиторни синапси [48].

Ние анализирахме броя на предполагаемите възбуждащи синапси (22 µm2/всяко поле на изображение, Фигура 2) в хипокампуса и префронталния кортекс на всяка мишка и след това осреднихме броя на синапсите на шест полета на изображение от същата група (6 полета на изображение от 4 мишки във всяка група).

Дължината на синаптичната активна зона, ширината на синаптичната цепнатина, кривината на синаптичната повърхност и дебелината на постсинаптичната плътност от 12-15 произволно избрани синапса бяха количествено определени и сравнени от 4 мишки на група (Фигура 3).

Дължината на активната зона и дебелината на постсинаптичната плътност бяха измерени според Güldner [49]. Синаптичната цепнатина се определя като най-ярката област между пре- и постсинаптичните мембрани [50].

Синаптичната кривина се определя с помощта на формулата: R=a/2 + b2/8a, където b е линията, свързваща двата края на постсинаптичната удебеляване и a е перпендикулярното разстояние от постсинаптичната мембрана до b [51 ,52] (виж Фигура 3A).

Фигура 2. Упражнението на бягаща пътека увеличава броя на синапсите на хипокампуса и префронталния кортекс при 3×Tg-AD мишки. (A) Представително електронно микроскопско изображение на хипокампуса и префронталния кортекс при не-Tg контрол, не-Tg упражнение, 3 × Tg-AD контрол и 3 × Tg-AD упражнения мишки.

Сините върхове на стрелките маркират синапсите. Червената кутия представлява разширен синапс. Разширен изглед с голямо увеличение на синапсите в префронталния кортекс е показан в червената квадратна кутия в долната част. (B, C) Броят на синапсите на хипокампуса (B) и префронталния кортекс (C) е значително намален в контролната група 3 × Tg-AD в сравнение с контролната група без Tg (*** p < 0 .001,n=6 секции на изображение) и това намаление беше блокирано от предварителна обработка на упражнения на бягаща пътека както в хипокампуса (B), така и в префронталния кортекс (C) (*** p < 0,001, n {{ 9}} секции с изображения).

Предварителното лечение с упражнения на бягаща пътека увеличи броя на синапсите на хипокампуса (B) и префронталния кортекс (C) при не-Tg мишки (** p < 0.01, n=6 секции на изображението). Всеки набор от данни е получен от 4 мишки.

Фигура 3. Упражнението на бягаща пътека подобрява синаптичните структурни параметри на хипокампуса и префронталния кортекс при 3 × Tg-AD мишки. (A) Представително измерване на синаптичните структурни параметри.

Формулата R=a/2 + b2/8a, където b е линията, свързваща двата края на постсинаптичното удебеляване, а a е перпендикулярното разстояние от постсинаптичната мембрана до b, беше използвана за определяне на синаптичната кривина.

(B, C) Дължината на синаптичната активна зона на хипокампуса (B) и префронталния кортекс (C) е значително намалена в контролната група 3 × Tg-AD в сравнение с контролната група без Tg (*** p < {{ 3}}.001, n=12–15 синапси), и това намаление беше блокирано от предварително третиране с упражнения на бягаща пътека както в хипокампуса, така и в префронталния кортекс (*** p < { {18}}.001, n=12–15). (D, E) Ширината на синаптичната цепнатина на хипокампуса (D) и префронталния кортекс (E) е значително увеличена в контролната група 3 × Tg-AD в сравнение с контролната група без Tg (*** p < {{ 30}}.001, n=12–15 синапси), и това увеличение е блокирано от предварителна обработка на упражнения на бягаща пътека както в хипокампуса (D;** * p < 0.001, n=12–15 синапси) и префронтален кортекс (E; ** p <0,01, n=12–15). (F, G) Синаптичната кривина на хипокампуса (F; *** p < 0,001, n=12–15) и префронталната кора (G; ** p < 0,01, n=12–15 ) е значително намалено в контролната група 3×Tg-AD в сравнение с контролната група без Tg и това намаление е блокирано от предварителна обработка с упражнения на бягаща пътека както в хипокампуса (F; ** p <0,01, n=12– 15) и префронтален кортекс (G; *** p <0,001, n=12–15). (H, I) Дебелината на постсинаптичната плътност на хипокампуса (H) и префронталната кора (I) е значително намалена в контролната група 3 × Tg-AD в сравнение с контролната група без Tg (*** p < 0.001, n {{ 50}}–15) и това намаление беше блокирано от предварителна обработка на упражнения на бягаща пътека както в хипокампуса (H; ** p <0,01,n=12–15), така и в префронталния кортекс (I; *** p <0,001, n=12–15).

Всеки набор от данни се състои от 12 и 15 синапса от 4 мишки във всяка група.

2.7. Статистика

Анализът на данните беше сляп за генотипите и историята на лечението на мишките. Данните са представени като средна стойност ± SEM. Наборите от данни бяха сравнени с двупосочен ANOVA, последван от post hoc анализ на Tukey. Post-hoc анализи бяха извършени само когато ANOVA доведе до значителен основен ефект или значително взаимодействие между двата фактора. Резултатите се считат за значими при p < 0.05.

3. Резултати

3.1. Упражненията на бягаща пътека предотвратяват влошаване на пространственото учене и памет при 3×Tg-AD мишки

Първо се опитахме да определим дали шестмесечни 3 × Tg-AD мишки проявяват пространствено обучение и увреждане на паметта и дали предварителната обработка с упражнения на бягаща пътека предотвратява спада в пространственото обучение и паметта при шестмесечни 3 × Tg-AD мишки.

Контролни мишки без Tg и 3 × Tg-AD мишки получиха 12 седмици упражнения на бягаща пътека или контролно лечение без упражнения, започвайки на тримесечна възраст (2 × 2 факторен дизайн: генотип срещу упражнение).

След 12-седмичното обучение тестът с радиален лабиринт с осем ръце беше използван за изследване на пространственото учене и паметта на мишки. Бяха измерени както работната памет (способността да се помни за сравнително кратък период), така и референтната памет (памет за информация, която се поддържа постоянна във времето) (разликата между работната и референтната памет е описана в раздел 2, фигура 1A).

Двупосочната ANOVA показа, че генотипът и упражненията на бягаща пътека имат значително въздействие върху процента на грешки в работната памет на ден 5 (генотип: F1,39=8.6, p=0.006; упражнения на бягаща пътека: F1,{{ 8}}.5, p=0.024; генотип × взаимодействие с упражнения на бягаща пътека: F1, 39=4.2, p=0.047; Фигура 1B) и ден 6 (генотип: F1 ,39=6.1, p=0.019; упражнение на бягаща пътека: F1,39=6.4, p=0.016; генотип × упражнение на бягаща пътека:F1,{{30 }}.6, p=0.039; Фигура 1B) от сесията за придобиване.

Post hoc тестовете на Tukey показват, че процентът грешки в работната памет е значително увеличен в контролната група с 3 × Tg-AD в сравнение с контролната група без Tg (и ден 5, и ден 6: p < 0).01; Фигура 1B ).

Увеличаването на процента на грешки в работната памет е предотвратено чрез предварителна обработка на упражнения на бягаща пътека (и ден 5, и ден 6: p < 0.01; Фигура 1B). Въпреки това, двупосочната ANOVA установи, че генотипът и упражненията на бягаща пътека нямат значителни ефекти върху процента на референтните грешки в паметта (напр. ден 10, генотип: F1, 39=0.2, p=0.6; бягаща пътека упражнение: F1, 39=0.04, p=0.8; всички 10 дни от сесията за придобиване.

Заедно тези резултати предполагат, че шестмесечни 3×Tg-AD мишки показват нарушена пространствена работна памет, но не и референтна памет, а упражненията на бягаща пътека предотвратяват намаляване на пространствената работна памет при 3×Tg-AD мишки.

3.2. Упражнението на бягаща пътека увеличава броя на синапсите и подобрява синаптичните структурни параметри на хипокампуса и префронталния кортекс при 3×Tg-AD мишки

За да проучим дали предизвиканото от упражнения на бягаща пътека намаляване на пространственото обучение и паметта е свързано със структурна синаптична пластичност, ние количествено определихме броя на синапсите и синаптичните структурни параметри на хипокампуса и префронталния кортекс, които са критични за предаване на информация, свързана с ученето и паметта (Фигура 2А).

Двупосочната ANOVA разкрива, че генотипът и упражненията на бягаща пътека имат значително въздействие върху броя на синапсите и в хипокампуса (генотип: F1, 23=59.3, p < 0.0{{9} }1; упражнение на бягаща пътека: F1, 0}, p < 0,001; взаимодействие на бягаща пътека: F1, 23=5, p=0.027; Фигура 2B) и префронтален кортекс (генотип: F1,23=48.6, p <0,001; тренировка на бягащата мила: F1,23=59.8, p <0,001; генотип × взаимодействие с упражнения на бягаща пътека: F1,23=8.5,p=0.009 Фигура 2C). Post hoc тестовете на Tukey показват, че броят на синапсите на хипокампуса и префронталния кортекс е значително намален в контролната група 3 × Tg-AD в сравнение с контролната група без Tg (p <0,001; Фигура 2B, C).

Предварителното лечение с упражнения на бягаща пътека блокира намаляването на броя на синапсите както в хипокампуса, така и в префронталния кортекс при 3 × Tg-AD мишки (p < 0.001; Фигура 2B, C).

Междувременно упражненията на бягаща пътека увеличават броя на синапсите в хипокампуса и префронталния кортекс при не-Tg мишки (p < 0.01; Фигура 2B, C).

За по-нататъшна оценка на ефективността на синаптичната трансмисия, ние измерихме и анализирахме ултраструктурните параметри чрез електронна микроскопия (EM), включително дължината на синаптичната активна зона, ширината на синаптичната цепнатина, синаптичната кривина и дебелината на постсинаптичната плътност в хипокампус и префронтален кортекс (Фигура 3А).

Предишни проучвания разкриха, че по-голямата синаптична активна зона е по-ефективна при възбуждането на постсинаптичните неврони и скъсяването на активната зона може да отразява състояние на нарушена ефективност на синаптичното предаване [36].

Двупосочната ANOVA показа, че генотипът и упражненията на бягаща пътека имат значителен ефект върху дължината на синаптична зона както в хипокампуса (генотип: F1, 53=10).6, p=0.0{{ 20}2; упражнение на бягаща пътека:F1,53=5.0, p=0.03; взаимодействие на бягаща пътека: F1,53=9.2, p { {14}}.004; Фигура 3B) и префронтален кортекс (генотип: F1,56=17.4, p <0,001; упражнение на бягаща пътека: F1,56=5.0, p=0. 03; генотип × взаимодействие с упражнения на бягаща пътека: F1, 56=6.8, p=0.012 Фигура 3C).

Posthoc тестовете на Tukey показват, че дължината на синаптичната активна зона на хипокампуса и префронталния кортекс е значително намалена в контролната група 3 × Tg-AD в сравнение с контролната група без Tg (p < 0.001; Фигура 3B, В).

Предварителното третиране с упражнения на бягаща пътека увеличи дължината на синаптичната активна зона както в хипокампуса (p < 0.001; Фигура 3B), така и в префронталния кортекс (p=0.001; Фигура 3C) при 3×Tg-AD мишки .Синаптичната цепнатина е тясно пространство ~20 nm между края на аксона на пресинаптичния неврон и мембраната на постсинаптичния неврон.

Оптималното скъсяване на синаптичната цепнатина може да има адаптивна функция за оптимизиране на синаптичната сила чрез повишаване на ефективната концентрация на освободените невротрансмитери и намаляване на ефективното съпротивление на цепнатина [37,38].

Двупосочната ANOVA показа, че генотипът и упражненията на бягаща пътека имат значителни ефекти върху ширината на синаптичната цепнатина както в хипокампуса (генотип: F1, 55=21.5, p < 0.0{ {24}}1; упражнение на бягаща пътека: F1,55=15.1, p <0,001 × взаимодействие на бягаща пътека: F1,{12}}.025; Фигура 3D) и префронтален кортекс (генотип: F1, 53=10.6, p=0.002; упражнение на бягаща пътека: F1, 53=5.0, p=0.03; генотип × бягаща пътека упражнение взаимодействие: F1, 53=9.2, p=0.004; Фигура 3E).

Post hoc тестовете на Tukey показват, че ширината на синаптичната цепнатина на хипокампуса и префронталния кортекс е значително увеличена в контролната група 3 × Tg-AD в сравнение с контролната група без Tg (p < 0.001; Фигура 3D, Д).

Предварителното третиране с упражнения на бягаща пътека намалява ширината на синаптичната цепнатина както в хипокампуса (p < 0.001; Фигура 3D), така и в префронталния кортекс (p=0.001; Фигура 3E) при 3×Tg-AD мишки.

For more information:1950477648nn@gmail.com