Нови ефекти от комбинираната терапия чрез инхибиране на индуцирана от каспаза-1/газдермин D пироптоза при лупусен нефрит

За повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang и Jin Lin

АБСТРАКТ

Цели: Комбинираната терапия с микофенолат мофетил, такролимус и стероиди е ефективна за постигане на пълна ремисия прилупусен нефрит(LN). Комбинираната терапия уникално намалява каспазата-1 в сравнение с монотерапиите, които могат да разцепят gasdermin D (GSDMD) и наскоро беше идентифицирана катопироптозапалач. Затова проучихме дали комбинираната терапия дава възможност за потискане на каспаза-1/GSDMD-медииранапироптозав LN (лупусен нефрит).

Щракнете за cistanche deserticola ma за нефрит

Методи: Експресията и активирането на GSDMD бяха открити в бъбречни проби на хора и мишки с LN (лупусен нефрит) с помощта на имунохистохимично оцветяване и имуноблотинг. Първичните подоцити, изолирани от MRLlpr мишки, се инкубират с LPS плюс ATP и предварително се третират с монотерапия или комбинирана терапия. Инхибиране на каспаза-1/GSDMD-индуциранопироптозачрез комбинирана терапия е оценен в MRLlpr мишки и човешки проби. Бях прегледан с помощта на комплект FAM caspase-1 и поточна цитометрия. Корелацията междупироптозав периферната кръв и беше анализиран индексът на активност на системния лупус еритематозус (SLEDAl).

Резултати: Проби от бъбречна тъкан от LN (лупусен нефрит) пациентите и мишките показват силно повишени нива на експресия и разцепване на GSDMD. В култивирани подоцити комбинираното лечение значително потиска активирането на NLRP3 и каспаза-1 и намалява GSDMD N-крайните нива. Комбинираната терапия потиска прогресията на заболяването чрез инхибиране на каспаза-1/GSDMD-медииранопироптозакакто при хора, така и при MRL/LPR мишки. Броят на положителните за каспаза-1/PI клетки в периферната кръв корелира положително със SLE-DAl. LN (лупусен нефрит) пациентите с пълна ремисия и частична ремисия са имали забележително намален брой положителни клетки на каспаза-1/PI в сравнение с изходното ниво. Ac-FLTD-CMK, инхибитор, получен от GSDMD, предотвратява развитието на LN (лупусен нефрит).

Заключение: Комбинираната терапия потиска каспаза-1/GSDMD-медииранопироптозаin vitro и in vivo и намалено прогресиране на заболяването.

Ключови думи:лупусен нефрит, пироптоза, каспаза-1, газдермин D, терапия

Лечебна терапия запироптоза

ВЪВЕДЕНИЕ

Лупусен нефрит(LN) е бъбречно възпаление, възникващо като последица от автоимунното заболяване системен лупус еритематозус (SLE).LN (лупусен нефрит) е основна проява при пациенти, страдащи от СЛЕ. Около 60 процента от пациентите развиват това състояние, като приблизително 20 процента прогресират до краен стадий на бъбречно заболяване (ESRD) (1). Комбинираната терапия с микофенолат мофетил (MMF), инхибитори на калциневрин (CNI) и стероиди води до допълващи се ефекти и също така минимизира токсичността (2). Тази терапия се препоръчва като начално лечение на LN (лупусен нефрит) и води до по-добра ефикасност и по-пълна ремисия в сравнение с интравенозен циклофосфамид (IVCY) и стероиди (3-5).

За да се изследват молекулярните и клетъчните механизми на комбинираната терапия, беше използван цялостен транскриптомичен анализ в миши модел на LN (лупусен нефрит). MRL/LPR мишки получават самостоятелно MMF, такролимус или преднизон като монотерапия или комбинации от тройни лекарства. Профили на експресията на гени в бъбреците на мишки с LN (лупусен нефрит)разкриха потенциални механизми, които биха могли да обяснят адитивните и синергични ефекти на комбинираната терапия в сравнение с монотерапиите. Един от 45 понижено регулирани гена, които са уникално модулирани чрез комбинирана терапия, е каспаза-1 (6). Той се активира от инфламазоми, които са мултипротеинови олигомери, съставени от NLRP3, про-каспаза-1 и свързан с апоптоза петноподобен протеин (ASC), с интегриран домейн на каспазен афинитет. Инфламазомата NLRP3/ASC/caspase-1 е призната за ключов фактор, допринасящ за патогенезата на LN (лупусен нефрит). Инфламазомата NLRP3 предизвиква автовъзпалителни разстройства чрез активиране на каспаза-1, инициирайки генерирането на провъзпалителни цитокини, напр. IL-1, за който е известно, че предизвиква подоцитна дисфункция в LN(7-9).

Активната каспаза-1 разцепва gasdermin D(GSDMD) в рамките на връзката на неговите N- и C-терминални домени. След това N-терминалният домен улеснява образуването на пори в клетъчната мембрана, стимулира клеткатапироптозаи производството на цитокини IL-1 и IL-18 (10). Появяващи се проучвания показват, че GSDMD-медииранпироптозаучаства в прогресирането на заболявания, включително автоимунен енцефаломиелит (11), множествена склероза (12), алкохолен хепатит (13) и възпалително заболяване на червата (14). В допълнение, генетично или фармакологично инхибиране на каспаза-1/GSDMD има е доказано, че предпазва бъбреците от увреждане при миши модели на диабетно бъбречно заболяване (15, 16), а също и след остро бъбречно увреждане (17-19). Въпреки това,пироптозав Л.Н (лупусен нефрит)все още е слабо дефиниран към днешна дата (20). Ние предположихме, че комбинираната терапия дава благоприятни ефекти при LN (лупусен нефрит)) чрез инхибиранепироптозаиндуцирани от каспаза-1/GSDMD.

В настоящото проучване е изследвано активирането на каспаза-1 и GSDMD в бъбречните тъкани, както и ефектите от комбинираната терапия върху зависимите от каспаза-1/GSDMDпироптозаинхибиране при MRL/LPR мишки и пациенти с LN (лупусен нефрит). Потенциални корелации напироптозас индекса на активност на заболяването SLE (SLEDAI) и отговорите на лечението също бяха оценени.

Лечение запироптоза

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Проучване на населението

Кохортата на проучването се състои от пациенти, диагностицирани чрез биопсия с LN (лупуснефрит) По-малко или равно на 6 месеца преди записването. Възрастовият диапазон на пациента беше 18-65 години и всички отговаряха на критериите за класификация на Американския колеж по ревматология за SLE (2l, 22) и Международното дружество по нефрология/Дружество по бъбречна патология (2003 г.). Набрани са пациенти от Медицинския факултет на университета Zhejiang и Медицинския факултет на университета Нанкин, които са имали протеинурия (по-голяма или равна на 1,5 g/ден) и концентрации на серумен креатинин по-малки или равни на 265,2 umol/L. Критериите за изключване включват: пациент преди това е бил лекуван с високи дози метилпреднизолон; биологични (насочени към специфични патогенни молекули) или комбинирана терапия; текуща плазмафереза ​​или лечение с интравенозен глобулин в рамките на 12 седмици след скрининга; анормални чернодробни функции; текущи активни инфекции; и злокачествен тумор в рамките на 4 седмици от началото на изследването. LN (лупуснефрит) пациентите са получавали пулсова терапия с метилпреднизолон в продължение на 3 дни в доза 0.5 g/ден. След приключване на импулсната терапия с метилпреднизолон комбинираната група с преднизон (0.6 mg/kg/ден), MMF (0.5 g, две дози/ден) и такролимус (2 mg, две дози/d) са дадени за общо 4 седмици. След това дозите преднизон, които все още бяха комбинирани с MMF (0.5 g, две дози/ден) и такролимус (2 mg, две дози/ден), бяха намалени с 5 mg/ден на всеки 2 седмици до беше постигната поддържаща доза от 10 mg/d (4). Пълна ремисия (CR) се приема като 24-h концентрация на протеин в урината по-малка или равна на 0,4 g, липса на активни седименти в урината, концентрация на серумен албумин по-голяма или равна на 35 g/L и нормален креатинин (23). Частичната ремисия (PR) се приема като по-голямо или равно на 50 процента намаление на 24-h концентрация на протеин в урината до по-малко или равно на 3,5 g, концентрация на серумен албумин по-голямо или равно на 30 g/ L и нормално или по-малко от или равно на 25 процента увеличение на концентрацията на серумния креатинин спрямо изходното ниво. Нашият институционален съвет за преглед одобри проучването (№ IIT20200410A) и всички пациенти предоставиха писмено съгласие преди записването.

Модели на животни

Женски мишки MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) бяха доставени от SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Шанхай, Китай), всички мишки бяха разделени на случаен принцип с помощта на генератор на произволни числа, 5 мишки във всяка група и всяка клетка . Те са лекувани на възраст 8 седмици перорално с комбинация от 0.5 mg/kg такролимус (MCE HY-13756), 50 mg/kg MMF (MCE HY-B0199) и 1 mg/ kg преднизон (MCE HY-B0214) или носител дневно за общо 8 седмици, както е описано по-горе (6). Ac-FLTD-CMK се синтезира чрез MCE и се инжектират 10 mg/kg ip дневно. Всички лечения бяха заслепени за участниците, отговорни за следното откриване. Съотношението албумин към креатинин в урината (UACR) се определя с помощта на Albuwell M и Creatinine Companion (Excell, Phil, US). Бъбречните проби се фиксират в 4 процента параформалдехид преди хистологично и имунохистохимично оцветяване и бъбречните кори се екстрахират за имуноблотинг анализ. Използването на мишки беше одобрено от нашия институционален комитет за грижа и използване на животните (№.2019-883).

Изолиране на гломерули на мишки и култура на подоцити

Гломерулите бяха пречистени от бъбреците на 12-седмични женски C57 и MRL/LPR мишки, както е описано по-горе (24). Анестезираните мишки се перфузират с предварително загряти до 37 градуса магнитни перли. Бъбреците се отстраняват и се смилат върху лед на 1 mm³. След това бъбречните тъкани се усвояват при 37 градуса с 1 mg/ml колагеназа и 100 U/ml DNase I за 30 минути, след което се филтруват два пъти с 100- μm клетъчни филтри Falcon（431752, BD). След няколко промивания с 4 градусов HBSS разтвор (H1025, Solarbio) и внимателно центрофугиране при 200 g за 5 минути, гломерулите, съдържащи перли, се събират с помощта на магнитна стойка (HY-K0200, MCE) и се промиват с HBSS разтвор три пъти. Изолираните гломерули се култивират върху култивирани блюда, покрити с колаген тип I (C3867, Sigma-Aldrich) в 5 процента CO, при 37 градуса съгласно метода, описан от Jeffrey (25). Подоцити от пасаж 2 бяха използвани в in vitro експеримента.ПироптозаИндукция, цитотоксичност и откриване на секреция на IL-1

Подоцитите от MRL/LPR мишки бяха инициирани с 1 mg/ml LPS (tell-pb5lps, In InvivoGen), разтворени в Opti-MEM за 4 часа, след това последвани от 5mM ATP (tlrlatpl, In Vivo ген) стимулация. Подоцитите от C57 мишки бяха отрязани като нормална контрола. Монотерапии такролимус (10 μM), MMF (luM) и преднизон (10 μM) или комбинирана терапия се инкубират предварително с клетките за 1 час преди праймирането на LPS. Цитотоксичността след стимулация се определя чрез използване на комплект за откриване на цитотоксичност (11644793001, Roche) съгласно инструкциите на производителя. Супернатантата след стимулация се събира и измерва с помощта на IL-1 миши ELISA комплект (BMS6002, Invitrogen) съгласно инструкциите на производителя.

Антитела и реагенти

Нивата на каспаза-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) бяха оценени съгласно инструкциите на производителя.Пироптозав периферна кръв беше измерен с помощта на FAM FLICAMCaspase-1 Kit (Bio-Rad, САЩ) чрез поточна цитометрия.

Статистически анализ

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism (версия 8.0) и данните са дадени като средни стойности ± SD. Две групови сравнения бяха проведени с помощта на t-теста на Student и корелационни анализи с помощта на корелацията на Pearson. Двуопашат стр<0.05 was="" considered="" statistically="">

Лечение запироптоза влупусен нефрит (LN)

РЕЗУЛТАТИ

GSDMD-медииранПироптозаАктивира се в бъбреците, засегнати от LN (лупуснефрит)

За да се изследва дали GSDMD е допринесъл за патогенезата на LN (лупуснефрит), първо тествахме нивото на протеинова експресия на GSDMD в бъбречни проби, взети от LN (лупуснефрит) пациенти. Имунохистохимичният анализ разкри забележително повишени нива на експресия на GSDMD в проби от бъбречна биопсия, взети от LN (лупуснефрит) пациенти с тип IV, V, I плюс V и IV плюс V и в сравнение със здрави индивиди. GSDMD е универсално експресиран в гломерулни подоцити, тубулни клетки и инфилтрирани интерстициални клетки в LN (лупуснефрит) пациенти. Областта с положително (червени стрелки) и отрицателно оцветяване (черни стрелки) беше увеличена (Фигура 1А). След това се оценява процентът на GSDMD-позитивната област в бъбрека (Фигура 1B). Подобни резултати са открити в бъбреците на MRL/LPR мишки и контроли от див тип. Имуноблотинг анализът потвърди силно повишена експресия и разцепване на GSDMD в бъбречни проби на MRL/LPR мишки (Фигура 1C). GSDMD в гломерулни подоцити, тубулни клетки и инфилтрирани интерстициални клетки е повишен при MRL/LPR мишки в сравнение с контролни мишки (Фигура 1D). Тези данни предполагат, че GSDMD-медиираният се активира в бъбречна тъкан, засегната от LN (лупуснефрит).

ФИГУРА 1|GSDMD е силно повишен и се разцепва в бъбреците на пациенти и мишки, засегнати от LN (лупусен нефрит).

(A) Имунохимично оцветяване на GSDMD в бъбречни проби, взети от здрави индивиди и LN (лупуснефрит) пациенти, положителното (червени стрелки) и отрицателното оцветяване (черни стрелки) са увеличени.

(B) Количественото определяне на GSDMD положителните области е показано в тип III плюс V, IV, IV плюс V, V LN (лупуснефрит) пациенти и здрави индивиди.

(C) Имуноблот анализ на пълна дължина, разцепен N-терминален домен и С-терминален домен GSDMD в бъбречна кора от три двойки контролни и MRL/LPR мишки.

(D) Имунохимично оцветяване на GSDMD в бъбречни проби, взети от контроли и MRL/LPR мишки.

*p < {{0}}.05,="" **p="">< 0,01.="" ln="">лупуснефрит), лупуснефрит; FL, цял ръст; NT, N-краен домейн; CT, С-терминален домейн.

Комбинираното лечение потиска GSDMD-медиираноПироптозаАктивиране в първични подоцити in vitro

Да се ​​изследват инхибиторните ефекти на комбинираната терапия върхупироптоза, ние приложихме метода за стимулиране на LPS плюс ATP, за да предизвикамепироптозав подоцити от MRL/LPR мишки, като се вземат подоцити от див тип C57 мишки като нормална контрола. Подоцитите от MRLlpr мишки бяха подготвени за 4 часа с LPS и впоследствие третирани за 4 часа с ATP, често използван стимул за GSDMD-медииранпироптозаактивиране (26). В сравнение с нормалната контрола, подоцитите след това показват пироптотични морфологични характеристики като клетъчно подуване и мехурчене. Предварителното лечение с комбинирана терапия значително подобри пироптотичните морфологични характеристики и цитотоксичността (Фигура 2А). LPS плюс ATP индуцирана цитотоксичност на подоцитите. Сравнително, комбинираната терапия значително намалява цитотоксичността и секрецията на IL-1 в супернатанта, индуцирана от LPS плюс ATP стимулация (Фигури 2B, C). За по-нататъшна проверка на активирането на медиирано от GSDMDпироптоза, ние анализирахме канонични инфламазоми и активиране на GSDMD, използвайки имуноблотинг. В съответствие с пироптотичните морфологични промени и цитотоксичността, LPS плюс ATP значително активират NLRP3, каспаза -1 и разцепват GSDMD в подоцитите (Фигура 2D). Комбинираното лечение значително потиска активирането на NLRP3 и каспаза-1 и намалява нивото на GSDMD N-терминал. По-специално, монотерапиите с такролимус, MMF или преднизон потискат LPS плюс ATP, стимулирана клетъчна цитотоксичност и L-1 секреция, но комбинираната терапия показва по-значителен инхибиторен ефект върху Caspase-1 и GSDMD. Тези резултати предоставиха доказателства в подкрепа на мнението, че комбинираното лечение подобрява GSDMD-медииранопироптозачрез потискане на активирането на NLRP3 и каспаза-1.

ФИГУРА 2|Комбинираното лечение подобрява пироптозата в подоцитите in vitro.

(A) Пироптотичните характеристики се проявяват в култивирани първични подоцити след инкубиране с LPS плюс ATP и предварително третирани с комбинирано лечение. Стрелките показват клетки, показващи характеристики, подобни на пироптоза.

(В) Супернатантите от провокираните клетки бяха анализирани за клетъчна смърт, измерена чрез LDH секреция.

(C) Супернатантите от заразените клетки бяха анализирани за освобождаване на IL-1b.

(D) Имуноблотинг анализ на експресия на NLRP3, каспаза -1, GSDMD-NT и ASC след такролимус, MMF, преднизон или комбинирано лечение след активиране на инфламазома на NLRP3.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001;="" ****p="">< 0,0001.="" ldh,="" лактат="">

DSMO, диметилсулфоксид, FK506, такролимус; MMF, микофенолат мофетил; PNS, преднизон; COM, комбинирана терапия; ASC, свързан с апоптоза протеин, подобен на петна.

Комбинирано лечение, потиснато от каспаза-1/GSDMD-индуцираноПироптозав MRL/LPR мишки

На осемседмични MRL/LPR мишки беше дадена комбинация от MMF, такролимус и преднизон или контролен носител. В съответствие с предишно проучване (6), след лечение в продължение на 8 седмици, не е открита разлика в смъртността или телесното тегло между групите с носител и комбинирано лечение. За разлика от групата на носителя, комбинираната терапия е много ефективна за предотвратяване на протеинурия, гломерулосклероза и инфилтрация на бъбречни интерстициални имунни клетки (допълнителна фигура 1).

След това изследвахме нивата на експресия на каспаза-1 и GSDMD в комбинирана терапия и контролни групи с носител. Имунохистохимичният анализ разкрива, че експресията на гломерулната и бъбречната интерстициална каспаза-1 и GSDMD е значително намалена в групата на комбинирана терапия (Фигура 3А). Имуноблотинг анализът също установи намалена експресия и разцепване на каспаза-1 и GSDMD в бъбречните корти на групата на комбинирано лечение (Фигура 3В). Освен това, двойно положителни клетки на каспаза-1/пропидиев йодид (PI) бяха преброени с помощта на поточна цитометрия ипироптозаКомплект FAM Caspase-1. Резултатите разкриват значително намаляване на броя на каспаза-1*/PI' периферни кръвни клетки в MRL/LPR мишки, които са получили комбинирано лечение в сравнение с MRL/LPR мишки, третирани с носител. (Фигури 3C, D). В допълнение, комбинираното лечение също значително намалява серумната концентрация Ii (Фигура 3E). По този начин заключихме, че комбинираното лечение потиска индуцираното от каспаза-1/GSDMDпироптозав бъбреците и кръвните клетки на LN (лупуснефрит) мишки.

ФИГУРА 3|Комбинираното лечение отслабва каспаза-1/GSDMD-медиирана пироптоза при MRL/LPR мишки.

(A) Имунохимично оцветяване на GSDMD и каспаза-1 в MRL/LPR мишки бъбречни проби. В сравнение с контролата на носителя, експресията на каспаза-1 и GSDMD беше значително инхибирана в групата на комбинирано лечение.

(B) Имуноблот анализ на пълна дължина и разцепен GSDMD и каспаза-1 в проби от бъбречна кора на MRL/LPR мишки; сравнение на резултатите от групите с носител и комбинирано лечение.

(C) FACS на каспаза-1/PI двойно положителни клетки в периферна кръв от MRL/LPR мишки, на които е било дадено или не комбинирано лечение.

(D) Количествено определяне на каспаза-1/PI двойно положителни клетки в периферна кръв на MRL/LPR мишки, на които е прилагана или не е прилагана комбинирана терапия.

(E) Количествено определяне на серумните концентрации на IL{{0}}b в MRL/LPR мишки, на които е прилагано или не е прилагано комбинирано лечение. ####P < 0,0001.="" facs,="" флуоресцентно="" активирано="" сортиране="" на="" клетки;="" ct,="" комбинирана="">

Комбинирана терапия, потискана от каспаза-1/GSDMD-индуциранаПироптозав LN (лупуснефрит) Пациенти

Между януари 2020 г. и юни 2020 г. 47 пациенти с LN (лупуснефрит) бяха включени и 43 завършени 24-седмици комбинирана терапия. Изходното заболяване и демографията на включената кохорта са изброени в допълнителна таблица 1. Количественото определяне на каспаза-1/пропидиев йодид (PI двойно положителни клетки е проведено при пациенти с LN (лупуснефрит) тип III, IV, V, III плюс V, IV плюс V и при здрави контроли с помощта на aпироптозаКомплект FAM Caspase-1 и поточна цитометрия. В сравнение със здравите контроли, броят на каспаза-1/PI двойно положителни клетки в периферната кръв е увеличен (Фигури 4A, B). Изследвахме също двойно положителни клетки на каспаза-1/PI след 24-седмици терапия и в началото. След 24-седмици индукционна терапия, честотата на CR и PR е съответно 39,5 процента (17/43) и 32,6 процента (14/43). Броят двойно положителни клетки на каспаза-1/PI в периферната кръв на пациенти с CR и PR беше значително намален в сравнение с изходното ниво (Фигура 4C). Ние също така идентифицирахме връзка между индуцираната от каспаза-1пироптозаи СЛЕДА; данните ясно показват, че положителното съотношение на каспаза-1/PI в периферната кръв корелира положително със SLEDAI (Фигура 4D). Ac-FLTD-CMK, инхибитор, получен от GSDMD, предотвратява развитието на LN (лупуснефрит).

ФИГУРА 4|Комбинираната терапия отслабва медиираната от каспаза-1-пироптоза при пациенти с LN (лупусен нефрит).

(A) FACS на каспаза-1/PI двойно положителни клетки в периферна кръв на LN (лупуснефрит) пациенти, лекувани със или без комбинирана терапия.

(B) Количествено определяне на каспаза-1/PI двойно положителни клетки в периферна кръв от тип III, IV, V, III плюс V и IV плюс V LN (лупуснефрит) пациенти и здрави индивиди.

(C) Количествено определяне на каспаза-1/PI двойно положителни клетки в периферна кръв на LN (лупуснефрит) пациенти на изходно ниво, CR, PR и без ремисия след комбинирана терапия.

(D) Корелационен анализ на съотношенията на каспаза-1/PI двойно положителни клетки със SLE-DAI.

**p < 0.01.="" facs,="" флуоресцентно="" активирано="" сортиране="" на="" клетки;="" ln="">лупуснефрит), лупуснефрит; CR, пълна ремисия; PR, частична ремисия; SLE-DAI, индекс на активност на заболяването системен лупус еритематозус.

Неотдавнашно проучване установи, че GSDMDhмишките развиват повишено отлагане на C3 и IgG в бъбреците, по-тежко бъбречно увреждане и повишена смъртност при индуциран от имиквимод модел на SLE.17 За да се изясни допълнително ролята на GSDMD при LN (лупуснефрит), MRL/LPR мишки бяха третирани с Ac-FLTD-CMK21, започвайки на 8--седмична възраст, с носителя като контрола. След 8-седмици на лечение не е установена разлика в смъртността или телесното тегло между групата, лекувана с носителя и Ac-FLTD-CMK. В сравнение с контролните мишки с носител, третираните с Ac-FLTD-CMK MRL/LPR мишки имат по-ниско съотношение албумин-креатинин в урината (Фигура 5А), по-ниска концентрация на серумен креатинин (Фигура 5В), намалена гломерулосклероза (Фигура 5С) и CD3 , CD4 и CD68 положителна клетъчна инфилтрация (Фигура 5D). Имунохистохимичните резултати показват намалена експресия на GSDMD (Фигура 5D) и потисната серумна секреция на IL-1, определени чрез ELISA (Фигура 5E). Взети заедно, данните предполагат, че Ac-FLTD-CMK инхибирапироптозапри бъбреци, засегнати от LN (лупуснефрит).

ФИГУРА 5|Ac-FLTD-CMK, инхибитор, получен от GSDMD, предотвратява развитието на LN (лупусен нефрит).

(A) Съотношението албумин към креатинин в урината се изчислява в MRL/LPR мишки, на които е даден или не е даден инхибитор на GSDMD.

(B) Серумен креатинин в MRL/LPR мишки, на които е даден или не е даден GSDMD инхибитор.

(C) Представителни изображения на проби от бъбреци, оцветени с Периодна киселина-Шиф (PAS) и количествен процент на гломерулосклероза.

(D) Имунохимично оцветяване на CD3, CD4, F4/80 и GSDMD. (E) Количествено определяне на серумните концентрации на IL-1b в MRL/LPR мишки, на които е даден или не е даден GSDMD инхибитор.

Данните са показани като средна стойност ± SEM. #p < {{0}}.05,="" ##p=""><>

ДИСКУСИЯ

Комбинираната терапия е обещаваща стратегия поради по-високите CR и общите нива на отговор, по-краткото време до ремисия и по-малко странични ефекти. Досега основните молекулярни механизми на комбинираната терапия не бяха известни. Наскоро Fu et al. (6) третираха MRL/LPR мишки с монотерапии или комбинирана терапия и извършиха цялостен транскриптомичен анализ на цели бъбреци. Интересното е, че те откриха, че комбинираната терапия, но не и монотерапиите, специфично и уникално потиска експресията на каспаза-1.

Инфламазомата NLRP3/ASC/caspase-1 сега се признава за ключов фактор за патогенезата на LN (лупуснефрит). NLRP3 инфламазомите в подоцитите се активират при предразположени към лупус мишки, а също и при пациенти с LN (лупуснефрит). Когато инфламазомите на NLRP3 бяха потиснати с инхибитор на каспаза-1, беше установено, че протеинурията, бъбречните хистологични лезии и изтриването на процесите на подоцитното краче се подобряват при предразположени към лупус мишки (8). Хуанг и др. (27) съобщават, че NLRP3 се експресира в тубулни клетки на LN (лупуснефрит) клас IV и че активирането на NLRP3 е положително корелирано с резултата на индекса на активност за пациенти с LN. Доказано е, че каспаза-1 играе жизненоважна роля при лупус и съдова дисфункция и по този начин е потенциална цел за нови терапевтични интервенции (28). Нововъзникващите експериментални лекарства като RIP3 (29), P2X7 рецепторни антагонисти (30), GSK-3 инхибитори (31) и Nrf2 агонист (32) инхибират развитието на LN (лупуснефрит) при MRL/LPR мишки чрез модулиране на NLRP3/ASC/caspase-1 възпалителната активност, което подчертава важността и критичността на NLRP3/ASC/caspase-1 възпалителната активност в LN. Повишените серумни концентрации на IL-18 корелират с тежестта на заболяването и степента на бъбречно увреждане/засягане при пациенти със СЛЕ (33). Доколкото ни е известно, изглежда, че семейството gasdermin може да е от съществено значение за развитието напироптоза, но има оскъдни доказателства за наличието на GSDMD/GSDME при пациенти със СЛЕ.

Като цяло, ние изследвахме активирането и експресията на GSDMD в проби от бъбречна биопсия, взети от LN (лупуснефрит) пациенти и MRL/LPR мишки. GSDMD беше силно индуциран и разцепен в гломерулни подоцити и тубулни клетки и инфилтрирани интерстициални клетки. Впоследствие на MRL/LPR мишки беше дадена комбинация от MMF, такролимус и преднизон или носител. В сравнение с контролната група на носителя, активирането на каспаза-1 и GSDMD е намалено в групата на комбинирано лечение. Степента напироптозав периферната кръв също е много по-ниска в LN (лупуснефрит) пациенти след прилагане на комбинирана терапия. Освен това,пироптозав периферната кръв корелира положително със SLEDAI, което предполага, чепироптозав периферната кръв може да действа като значим маркер за активността на SLE. По този начин ние предположихме, че комбинираната терапия може да доведе до благоприятни ефекти при LN (лупуснефрит) чрез инхибиранепироптозаиндуцирани от каспаза-1/GSDMD. Предишни изследвания на кристална структура на каспаза-1 в комплекс с Ac-FLTD-CMK разкриха много взаимодействия ензим-инхибитор, които предотвратяват разпознаването на GSDMD от каспаза-1. Ние обаче открихме, че Ac-FLTD-CMK, който действа като инхибитор, получен от GSDMD, инхибирапироптозав LN (лупуснефрит), което може да бъде предизвикано от различен механизъм.

Наскоро, в индуциран от TLR{0}}миши модел на SLE(34), GSDMD-/-мишки развиха по-висока степен на увреждане на бъбреците и повишена смъртност, което първоначално предполагаше, че делецията на GSDMD ще има защитен ефект и ще бъде свързана с системно възпаление и производство на автоантитела със свързана повишена смъртност. Мишките с дефицит на GSDMD развиват по-забележимо отлагане на гломеруларен имунен комплекс в бъбречни проби и по-висока протеинурия в сравнение с мишки от див тип. Повишена секреция на извънклетъчен HMGB1 също беше открита в GSDMD-/лимфоцити, което предполага, че некрозата/пироптозавъзникна, когато GSDMD отсъстваше.

Caspase-1 задействапироптозачрез разцепване на GSDMD. Обратно, в GSDMD-дефицитни или GSDMD-ниски клетки, каспаза-1 предизвиква апоптоза и след това GSDME-зависима вторична некроза ипироптоза. Когато активността на GSDMD отсъства след терапията, GSDME може също да превключи каспаза-3-медиирана апоптоза къмпироптоза(35,36). В допълнение, активирането на каспаза -8 е значително подобрено в макрофаги, които са с дефицит на GSDMD. Значително активиране на каспаза-8 също беше установено в TLR7-индуцирана GSDMD-дефицитна LN (лупуснефрит) мишки (34). По този начин, в отсъствието на GSDMD, е вероятно каспаза-1 да си сътрудничи с каспаза-8, за да предизвика каспаза-3-GSDME-медиирана апоптоза да премине къмпироптозав LN (лупуснефрит), хипотеза, която изисква по-нататъшно експериментално изследване.

Има няколко ограничения в настоящото проучване. Първо, въз основа на текущите данни, ние потвърдихме, че комбинираната терапия може да потиснепироптоза, но други лечения като двойна терапия със стероиди и MMF, стероиди и такролимус или анти-CD20 антитяло също могат да имат сравними ефекти. Второ, точният молекулен механизъм на инхибиращия ефект на комбинираната терапия върху каспаза -1 не е добре проучен. Не на последно място, ние наблюдаваме връзката между каспаза-1/PI двойно положителни клетки в периферната кръв със SLE-DAI и промяната преди и след лечението с комбинирана терапия в ретроспективен LN (лупуснефрит) група пациенти. Клиничната прогнозна стойност на каспаза-1/PI двойно положителни клетки за активността на заболяванията и отговора на лечението трябва да бъде допълнително проучена в по-голяма проспективна кохорта.

Като цяло установихме, че комбинираната терапия дава своите благоприятни ефекти чрез потискане на индуцирания от каспаза-1/GSDMDпироптозав LN (лупуснефрит), което предостави нов поглед върху участващите клетъчни механизми. Наистина комбинираната терапия потиска експресията на каспаза-1 специфично и уникално. Фармакологично или генетично инхибиране на NLRP3 и каспаза-1 подобрява бъбречната функция и потиска автоимунитета при LN (лупуснефрит). Патофизиологичната роля на каспаза-1 в LN (лупуснефрит) е достоен за по-нататъшно проучване и терапии, насочени към GSDMD при пациенти с LN (лупуснефрит) трябва да бъдат много внимателно оценени.

Метод за лечение напироптоза

ПРЕПРАТКИ

1. Саксена Р, Махаджан Т, Мохан С.Лупуснефрит: Текуща актуализация.Arthritis Res The (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Индивидуализираща терапия вЛупуснефрит. Kidney Int Rep (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H, Liu ZH, Xie HL, Hu WX, Zhang HT, LiLS. Успешно лечение на клас V плюс IVЛупуснефритС многоцелева терапия. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z и др. Многоцелева терапия за индукционно лечение наЛупуснефрит: Рандомизирано проучване, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C и др. Многоцелева терапия за поддържащо лечение наЛупуснефрит. J Am Soc Nephrol (2017) 28: 3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al. Транскриптомният анализ разкрива нови синергични механизми в комбинираната терапия заЛупуснефрит. Kidney Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Умарино Д.Лупуснефрит: Инфламазомата на NLRP3 възпламенява дисфункцията на подоцитите. Nat Rev Rheumatol (2017) 13: 451. doi: 10.1038 / Orpheum. 2017.9