Тубулозид B от Cistanche Salsa спасява PC12 невронните клетки от 1-метил-4-фенилпиридиний йон-индуцирана апоптоза и оксидативен стрес

Въведение

Патологично, спорадичната болест на Паркинсон (PD) обикновено се характеризира със загуба на катехоламинергични неврони, особено допаминергични неврони на substantia nigra pars compacta (SNc), и наличието на характерни intraneurona| включвания, наречени телца на Lewy в засегнатите области на мозъка. Въпреки различни фактори, които са замесени в патогенезата на PD, механизмите, включени в началото и прогресията на PD, остават несигурни. Въпреки че причината за PD остава отговорена, няколко линии доказателства категорично предполагат участието на оксидативния стрес, което накрая води до до невронална смърт или апоптоза от прекомерното генериране на свободни радикали. Фактът, че нигралната допаминергична система може да произведе високи нива на свободни радикали и има относително ниски нива на окислителна защитна система, допълнително подкрепя тази хипотеза. Както in vivo, така и in vitro проучвания показват медиирана от оксидативен стрес невротоксичност на MPP ＋, активен метаболит на l-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридин (MPTP) върху допаминергичните неврони. Участието на свободните радикали, прекомерно произведени от оксидативния стрес, като непосредствена причина за невродегенеративни разстройства като PD, предполага централна роля на антиоксидантите. Тубулозид В (фиг. 1) е едно от фенилетаноидните съединения, изолирани от стъблата на Cistanche salsa. Предишни проучвания са открили, че много фенилетаноиди, включително тубулозид B, показват силна активност на освобождаване от свободни радикали.

Имайки предвид тези констатации, ние изследвахме в настоящото проучване ефекта на tubu]nside B върху MPP+-индуцираната невротоксичност in vitro, използвайки клетъчната линия PC12 на феохромоцитома на симпатиковия нерв, която успешно се използва през годините за изследване на невронната функция.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПРЕДОТВРАЩАВАНЕ НА БОЛЕСТТА НА ПАРКИНСОН PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Материали и методи

Материали

Тубулозид B от Cistanche Salsa беше любезно предоставен от д-р Li Lei (Катедра по естествени продукти, Факултет по фармацевтични науки, Пекински университет, Пекин, Китай). Чистотата на съединението е повече от 98% чрез HPLC анализ. Модифицираната среда на Eagle на Dulbecco (DMEM), конски серум и фетален телешки серум са закупени от GIBCO BRL, 1-метил~-фенилпиридониев йон (MPP+), поли-L-лизин, 3-(4,{ {8}}диметил тиазол-2 -ил)-2,5- дифенилтетразолиев бромид (МТТ), пропидиев йодид (PI), РНКаза А, протеиназа К и 2; 7'-дихлорофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) са закупени от Sigma.

Клетъчна култура

PCI2 клетките се поддържат в DMEM, допълнен с 10% конски серум, 5% фетален телешки серум, 100U/ml пеницилин и 100ug/ml стрептомицин. Клетките се култивират във влажен инкубатор, аериран с 95% въздух и 5% CO2 при 37 градуса. Всички експерименти бяха проведени 24-48 h след посяването на клетките. Клетките се събират рутинно чрез трипсинизация 0,25%, когато клетките се доближат до субфлуентния стадий и се поставят в 25 cm колби за култура, разделени при 1:8.

Анализ на жизнеспособността на клетките

Жизнеспособността на клетките се определя с помощта на модифициран МТТ анализ, както е описано по-рано [10], Накратко, PC12 клетки се посяват в 96-плаки с ямки при плътност от I × 104 клетки на ямка. Културите се отглеждат в продължение на 48 часа и след това средата се променя на такава, съдържаща различни концентрации на бърнсайд B или MPP＋. След инкубиране до 48 часа и 72 часа, разтвор на MTr (5 mg/ml в DMEM) се добавя към 96-ямковите плаки и клетките се оставят да се инкубират за 4 часа при 37 градуса. След като средата беше отстранена, клетките и кристалите на багрилото бяха разтворими чрез добавяне на 200 μL DMSO и абсорбцията беше измерена при 570 nm (540 nm като референтна) с модел 550 четец на микроплаки (Bio-Rad). Клетъчната жизнеспособност също беше анализирана с помощта на метода за изключване на трипаново синьо. Клетките се събират, внимателно се пелетират и се оцветяват с 0,6% разтвор на трипаново синьо за 3 дъжда. Процентът на неоцветените клетки впоследствие се оценява в десет произволно избрани микроскопски полета. Като положително лекарство се използва 100 ng/ml епидермален растежен фактор (EGF).

ЕСТЕСТВЕНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА АКТИВНОСТ ЗА ПОЧИСТВАНЕ НА СВОБОДНИ РАДИКАЛИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Откриване на апоптоза чрез поточна цитометрия

Апоптозните клетки бяха открити чрез поточна цитометрия с помощта на пропидиев йодид (PI) [11]. Накратко, около 1 × 106 клетки, инкубирани с изпитвани вещества, бяха събрани чрез центрофугиране и бяха промити веднъж с PBS. Клетките се фиксират със 70% етанол за 24 часа при - 20 градуса и се промиват веднъж с PBS. След това клетките се ресуспендират в 300 μL PBS, съдържащ 0.5 mg/ml RNaseA и 0.5 mg/ml PI. След допълнителна инкубация в продължение на 30 минути на тъмно, беше извършена поточна цитометрия с FACScan (Becton Dickinson, Хайделберг, Германия).

Анализ на фрагментация на ДНК чрез електрофореза

Приложихме протокола на Мур [12], който изолира само фрагментирана ДНК и експериментите бяха нормализирани чрез използване на равен брой култури от всяка тестова група. Накратко, 3 × 106 неврона от всяка от третираните проби бяха промити в балансиран солев разтвор на Ханк (1000g за 10 минути) и пелетите, образувани на дъното на епруветката, бяха хомогенизирани с 1 ml лизисен буфер (10 mM Tris при рН 7.4. 5 mM EDTA, 1% Triton X -100) за 20 минути върху лед. След центрофугиране при 11, 000 g за 20 дъжда при 4 градуса, супернатантите, съдържащи фрагментирана ДНК, се отстраняват и усвояват с 20 mg/ml РНКаза А при 37 градуса за 1 час и 0,1 mg/ml протеиназа К при 56 градуса за допълнителен 1ч. Фрагментираната ДНК се екстрахира с помощта на фенол и хлороформ и се центрофугира при 10,000g за 1 дъжд при 4°С. Водната фаза се прехвърля в нова епруветка на Eppendorf, смесва се с 2 обема леденостуден етанол и след това поставени при 20 градуса за поне 1 час, за да се утаи ДНК. След центрофугиране при 15,{38}}g за 20 минути при 4 градуса, супернатантите се отстраняват и ДНК пелетите се промиват с 80% етанол веднъж (15 000 g за 15 минути при 4 градуса), изсушават се на въздух и се разтварят в 20 μL ТЕ буфер при рН 7,6. След това цялата проба беше подложена на електрофореза върху 1,5% агарозен гел в продължение на 1 час при 85 V. Гелът беше изследван и фотографиран от Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Измерване на вътреклетъчното образуване на ROS

Образуването на вътреклетъчни пероксиди се открива с конфокален сканиращ лазерен микроскоп, като се използва нефлуоресцентно съединение, 2"7"-дихлорофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) [13], което е деестерифицирано в клетките от ендогенни естерази до йонизирани свободни киселина, 2;7"-дихлорофлуоресцеин. 2",7-Дихлорофлуоресцеинът може да се окислява до флуоресцентен 2"7"-дихлорофлуоресцеин (DCF) от хидроантиоксиданти. Клетките се инкубират с 10 цМ DCFH-DA за 30 минути при 37 градуса. Културите се промиват два пъти с балансиран солев разтвор на Ханк и се изобразяват в същата среда. Изобразяването беше направено с помощта на конфокален сканиращ лазерен микроскоп, DCF беше възбуден при 488 nm и емисионният филтър беше 510nm бариерен филтър. За да се осигури валидно сравнение, същите параметри на придобиване бяха използвани за всички наблюдения. Беше зададена оптималната вертикална позиция в средата на клетките и след това полето беше бързо сканирано. Тъй като осветяването при дължина на вълната на възбуждане от 488 nm причинява повишена флуоресценция поради окисляването на това багрило, всяко поле е изложено на светлина за едно и също време. Изходните стойности от нестимулирани клетки бяха използвани като контролни стойности за сравнение с MPP＋ третирани клетки в присъствието или отсъствието натубулозид Б. След сканиране, средният относителен интензитет на флуоресценция в 15-20 невронни клетъчни тела на микроскопско поле беше количествено определен в четири отделни култури за условие за лечение.

Статистически анализ

Всички получени стойности бяха изразени като средно ±SD. Статистическата значимост на разликите между групите се определя чрез t-теста на Student; Изчислените p стойности по-малки от 0.05 се считат за статистически значими.

Резултати

Както е показано на Фиг. 2, MPP+ предизвиква зависимо от дозата намаляване на жизнеспособността на PCI2 клетките. Обратно, EGF, добре известен невротрофичен фактор, произвежда значителна защита на клетъчната жизнеспособност при 100 ng/mL MPP＋-индуцираните цитотоксични ефекти също са отслабени в присъствието на тубулозид В (5, 10, 50 или 100 ug-ml{{12} }), макар и с по-малка сила от препратката

лекарство (фиг.3). Тубулозид В при тези концентрации проявява цитопротективни ефекти по дозозависим начин и самото съединение не предизвиква видима цитотоксичност (данните не са показани). Гел електрофореза на ДНК екстракт от PCI 2 клетки, третирани с 200 µM MPP+ в продължение на 48 часа, показва ДНК стълби. класически отличителен белег на апоптозата, тубулозид B, при дози от 10 и 100 μg·ml-1предизвика образуване на стълбата на ДНК (Фиг.．4) ． Фигура．5 показва типични хистограми на поточния цитометричен анализ на апоптотична клетъчна смърт, индуцирана от MPP＋ в PC12 клетки в присъствието или отсъствието на тубулозид B．Количественото определяне на профила на клетъчния цикъл с PI разкрива броя на клетките със субдиплоидни характеристики (М1 област) показателно за апоптотична фрагментация на ДНК. В нетретираните клетки апоптотичната субдиплоидна фракция е минимална до 5．94％от общо 10 000 клетки (Фигура．5 A)． След 48 часа излагане на MPP＋, процентът на апоптоза се повишава до 43．02;j;(Фигура．5 B)． Когато се добави към клетъчната култура, тубулозид Bинхибира MPP+-индуцирана апоптозапо дозозависим начин. При концентрация от 10 ug·ml-1защитата от тубулозид B не е статистически значима, но при 50 и 1 00ug·ml-1, съответно 45 ½ и 63% намаление．, бе наблюдаван. увеличаване на процента на оцелелите клетки (Фигура．5D, E)．

Натрупването на вътреклетъчни ROS може да бъде открито чрез използване на DCFH-DA．PC12 клетки, третирани с 200 uM MPP＋ за 48 часа, показват интензивна флуоресценция вътре в клетката след оцветяване с DCFH-DA багрило (Фигура．6)． Едновременното лечение с тубулозид B (в дози от 10 и 100 ug·ml.) инхибира производството на ROS, индуцирано от MPP＋一 (намаленият процент е съответно 24．52％и 55．63％)．

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА БОЛЕСТТА НА ПАРКИНСОН PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Дискусия

Патогенезата на PD включва силен оксидативен стрес, намалени нива на антиоксиданти и митохондриални дефекти. за всички е известно, че индуцират апоптоза в няколко клетъчни системи. По-специално е доказано, че свободните радикали предизвикват активна клетъчна смърт в невроните[14]. MPTP предизвиква необратим и тежък синдром, подобен на Паркинсон, който причинява селективна дегенерация на нигростриарните допаминергични неврони при хора. Този невротоксин е използван за създаване на. ядат животински модели на PD[15].MPTP се превръща от моноаминооксидаза B в Mpp＋, който се натрупва в митохондриите． където инхибира митохондриалния комплекс I и тази митохондриална дис． функция причинява апоптоза [16]． Следователно, индуцираната от MPP+一 невротоксичност в допаминергичните неврони е широко използвана като етиологичен модел на PD за скрининг на невропротективни агенти.

В настоящото проучване ние показахме, че индуцираната от MPP+-клетъчна смърт чрез оксидативен стрес в PC12 клетки е намалена от тубулозид B. Освен това, ние демонстрирахме, че тубулозид B също така защитава по дозозависим начин срещу MPP{{ 3}}индуцирана ДНК стълба и апоптоза, както е измерено с помощта на ДНК гел електрофореза и поточен цитометричен анализ. Освен това, едновременното лечение с по-високи концентрации на тубулозид В инхибира MPP-индуцираното производство на ROS. По този начин тубулозид B е показал многофункционални неврозащитни ефекти. Няколко механизма, поотделно или в комбинация, могат да участват в действията на тубулозид В. Антиоксидантният ефект е възможен механизъм за невропротекция, медиирана от тубулозид В. Xiong Q откри, че тубулозид B показва силна активност на освобождаване на свободни радикали върху 1,1-дифенил-2-пикрилхидразил радикал и ксантин]ксантин оксидаза, генериран супероксиден анион радикал.

Наскоро беше съобщено, че няколко фенилетаноида притежават свойства за поглъщане на свободни радикали и предпазват от токсични увреждания, предизвикани от оксидативен стрес. ROS, произведени от MPP+, като водороден пероксид, супероксиден анион и хидроксилен радикал, лесно увреждат биологичните молекули, което в крайна сметка може да доведе до апоптотична или некротична клетъчна смърт. По този начин, тубулозид B може да има директни очистващи ефекти срещу ROS. Въпреки че нашите данни не установяват точното място, на което тубулозид B действа за потискане на натрупването на ROS, те предполагат, че невропротективният механизъм включва стимулиране на антиоксидантни пътища. Изследване на молекулярната структура на тубулозид B също показва, че той притежава мощен капацитет запречистване на свободните радикали(лична комуникация).

Други механизми също могат да бъдат уместни. Например, тубулозид B може да има способността да противодейства на токсичността на MPP＋ чрез инхибиране на отварянето на преходните пори на митохондриалната пропускливост и дисфункцията. Освен това трябва да се има предвид дали тубулозид B има директен стимулиращ растежа ефект върху невронните клетки. Точният механизъм на невропротективното действие на тубулозид В остава неясен. Необходими са допълнителни изследвания, за да се изясни пълната картина на неговия невропротективен ефект.

В заключение, тубулозид B отЕкстракт от цистанче салсаима очевидни защитни ефекти върху MPP+-индуцирана апоптоза и оксидативен стрес. Невропротективните му ефекти срещу MPP ＋ токсичността може да са важни и предполагат, че може да има терапевтичен потенциал при превенцията и лечението на PD.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА БОЛЕСТТА НА ПАРКИНСОН PHGS75% ECH 30% ACT 12%