Вариации в генната експресия между две двуцветни линии на сорго, различаващи се в реакцията на вроден имунитет

Резюме:

Свързаният с микроби молекулярен модел (MAMPs) предизвикан имунитет (MTI) е ключов компонент на вродения имунен отговор на растението към микробно разпознаване. Повечето от сегашните ни познания за MTI обаче идват от моделни растения (т.е. Arabidopsis thaliana) със сравнително по-малко работа, извършена при използване на културни растения. В тази работа ние проучихме предизвикания от MAMP оксидативен взрив (ROS) и транскрипционния отговор в два двуцветни генотипа на Sorghum, BTx623 и SC155-14E. SC155-14E е линия, която показва висока устойчивост на антракноза, а линията BTx623 е податлива на антракноза. Нашите резултати разкриха ясна вариация в генната експресия и ROS в отговор или на флагелин (flg22), или на предизвикване на хитин между двете линии. Докато транскрипционният отговор към всеки MAMP и във всяка линия беше уникален, имаше значителна степен на припокриване и ние успяхме да дефинираме основен набор от гени, свързани с транскрипционния отговор на MAMP на сорго. Терминът GO и анализът на обогатяване на пътя на KEGG откриха повече DEG, свързани с имунитета и резистентността на патогена, в проби SC155-14E, третирани с MAMP, отколкото в BTx623 със същото лечение. Резултатите предоставят основа за бъдещи проучвания за изследване на пътищата на вродения имунитет при соргото, включително усилия за повишаване на устойчивостта към болести.

Кликнете, за да купитепродукт за подобряване на имунитета

    For more information:1950477648nn@gmail.com

Ключови думи:

Сорго двуцветно; ROS; вроден имунитет; MAMPs; RNA-seq; генната експресия

1. Въведение

Растенията са естествено изложени на различни видове стрес, включително множество бактериални, гъбични и вирусни патогени [1]. Растенията се предпазват от патогени, като използват предварително формирани структури и химикали и предизвикани от инфекция реакции на имунната система. Имунната система на растенията използва двустепенна система за възприятие с два взаимосвързани слоя рецептори.

Първият слой се активира от повърхностно локализирани рецептори за разпознаване на образи (PRRs), които усещат молекули извън клетката чрез разпознаване на нахлуващия патоген чрез откриване на запазени структурни мотиви, наречени микробно-асоциирани молекулярни модели (MAMPs), които предизвикват умерен, но широк, защитен отговор [2]. Флагелин, хитин, липополизахариди, пептидогликани (PGN) и фактор на удължаване Tu са примери за добре проучени MAMP [3–5]. Този защитен отговор се нарича имунитет, предизвикан от MAMP (MTI) [6]. Второто ниво на защита, известно като имунитет, предизвикан от ефектор (ETI), възниква в отговор на специфични ефекторни протеини, произхождащи от патогени, които се разпознават от растението чрез действието на резистентни протеини, което води до силен, но много специфичен имунен отговор. ETI често може да бъде разпознат чрез индукция на локализирана клетъчна смърт, наречена свръхчувствителен отговор (HR) [7]. Системите MTI и ETI усещат патогените и реагират чрез активиране на антимикробна защита в заразената клетка и съседните клетки [3,8]. Растенията също носят имунни рецептори, които разпознават силно променливи патогенни ефектори, те включват NBS-LRR клас протеини [9].

В допълнение, системната придобита резистентност (SAR) е реакция на резистентност на „цялото растение“, която възниква след по-ранна локализирана експозиция на патоген. SAR се свързва с индуцирането на широк спектър от гени (гени, свързани с патогенезата), а активирането на SAR изисква натрупване на ендогенна салицилова киселина (SA) [10].

Проучвания, проведени предимно с Arabidopsis, показват, че MTI може да предизвика различни реакции, включително промени в производството на реактивни кислородни видове (ROS), производство на реактивни азотни видове като азотен оксид (NO), отлагане на калоза, вътреклетъчни нива на калций, йонен поток през плазмата мембрана, индуциране или потискане на експресията на няколко гени, свързани със защитата на растенията, промени в стената на растителната клетка, индукция на антимикробни съединения и синтеза на свързани с патогенезата (PR) протеини [3,11].

Въпреки че няколко от тези реакции на MTI могат да се считат за общи реакции на растенията, тяхната величина може да бъде специфична за растителния вид и дори специфична за сорта [12–17]. Разработени са методи за количествено определяне на реакцията на MTI на растенията. Тези методи включват измерване на производството на ROS или NO, митоген-активирано фосфорилиране на протеин киназа, специфична MAMP-индуцирана генна експресия, инхибиране на растежа на разсад, лигнин и феноли, свързани с клетъчната стена, и MAMP-индуцирана резистентност към бактериални и гъбични патогени [18–20].

Двуцветното сорго (L.) Moench е ключова глобална зърнена култура, която е адаптирана към редица местообитания и се отглежда за различни цели [21]. Очаква се отглеждането на сорго да се увеличи значително в световен мащаб като една от основните култури за производство на храни и биомаса [22].

Тъй като практиките и географските райони, в които се отглежда сорго, се увеличават, неизбежно е натискът от болестта да се увеличи. Соргото се отличава сред другите зърнени култури с необичайно широк спектър от заболявания, което е едно от най-важните ограничения за неговото производство. В световен мащаб широко разпространените гъбични заболявания са най-разрушителните болести по соргото, които водят до огромни загуби в добива, както по отношение на количеството, така и на качеството на зърната [23]. Антракнозата е едно от най-тежките гъбични заболявания, засягащи добива на зърно от сорго и производството на биомаса. Загубите на добив, дължащи се на този патоген, могат да бъдат 50 до 70 процента при чувствителните сортове [24,25]. Растенията са разработили различни защитни стратегии за борба срещу инвазията на патогени. В соргото тези стратегии включват активиране на PR протеини [26], натрупване на водороден пероксид [27] и биосинтез на флавоноидни фитоалексини [28]. Използвани са различни подходи за изследване на реакциите на резистентност на соргото, идентифициране на защитни съединения и идентифициране на физически бариери срещу антракноза (вижте справка [29,30] за преглед). Изследванията на генната експресия бяха широко използвани за идентифициране на кандидат гени за резистентност в растения въз основа на диференциалната експресия между устойчиви и чувствителни сортове или неинокулирани и инокулирани с патогени растения (напр. препратки [31–37]). Wang et al., [37] извършиха транскриптомичен анализ, за ​​да проучат реакцията на сорт сорго BTx623 към C. subline-ola. Те съобщават, че гените, участващи във фенилпропаноидния метаболизъм и биосинтезата на вторични метаболити, са идентифицирани като диференциално експресирани в отговор на инфекция с патогена спрямо неинокулираните контролни растения.

Тези експерименти обаче бяха проведени с разсад от чувствителния сорт BTx623. Допълнителни транскриптомни изследвания за сравняване на отговора на генната експресия към патоген в чувствителните и устойчиви сортове сорго биха били от полза. Следователно е важно да се разбере генетичната архитектура, контролираща резистентността към базална болест на соргото и нейната връзка с количествената резистентност към болести.

Като начална стъпка в тази посока, наскоро скринирахме набор от разнообразна зародишна плазма на сорго за вариации в техния отговор на предизвикване на flg22 и хитин, както и устойчивост на гъбични заболявания [38]. В този случай MTI се определя количествено чрез измерване на производството на ROS при предизвикване на MAMP. Сред резултатите от това по-ранно проучване беше идентифицирането на генотипове на сорго, които показват или силен, или слаб отговор на предизвикването на MAMP.

Следващото поколение високопроизводително секвениране и изследване на транскриптоми може да помогне за изясняване на отговорите на гъбични инфекции в растенията и да подобри разбирането за отговорите на гостоприемника. Транскриптомните анализи бяха широко използвани за изследване на реакциите на растенията към гъбична инфекция в много растителни видове, включително зърнени култури (напр. препратки [31–37]).

Въпреки това, публикуваните данни за сравнителен транскриптомен анализ на зърнени култури са фокусирани предимно върху отговора на различни патогени. При соргото няколко публикации се фокусираха върху сравнения на транскриптоми на растения, третирани с различни патогени, включително антракноза [35,37]. Някои предишни публикации предполагат, че няма значима корелация между отговора на MAMPs и гъбичните заболявания. Например Zhang et al. [17] съобщават за силна корелация между отговора на два MAMPs flg22 и хитин в популация за картографиране на царевица, но няма съответствие с отговора на гъбично заболяване. Кимбъл и др. [38] също съобщават за ниска корелация между flg22-индуцираните ROS резултати за отговор и целевите резултати за устойчивост на листни петна в две RIL популации на сорго, включително популация BTx623/SC155-14E. Следователно, предвид недостига на данни, ние сметнахме, че е важно да профилираме транскрипционно отговора на соргото към лечението с MAMP.

В този настоящ доклад ние разширяваме нашия по-ранен анализ чрез измерване на глобалния транскрипционен отговор на предизвикването на MAMP. Използвахме базиран на Illumina анализ на РНК секвениране, за да изследваме транскрипционните промени в отговор или на flg22, или на лечение с хитин в генотипове BTx623 и SC155-14E на сорго, които преди това характеризирахме съответно като слаби и силни MTI реагиращи. BTx623 е референтната линия на двуцветния геном на Sorghum [22], а SC155-14E е линия, показваща повишена резистентност към антракноза [39]. Патил и др. [39] съобщават, че SC155-14E показва високо ниво на стабилна резистентност (почти без заболяване) към антракноза във всички тествани среди, докато BTx623 е податлив на това гъбично заболяване. Нашият RNA-seq анализ идентифицира 5252 и 8085 диференциално експресирани гени (DEGs) в BTx623, третирани съответно с flg22 и хитин, и 3849 и 5786 DEGs в flg22 и третирани с хитин SC155-14E, съответно, в сравнение с нетретирани фалшиви контроли от тези два генотипа.

Освен това, сравнение на DEG, избрани с помощта на два различни биоинформационни тръбопровода, показа много сходни резултати. Експресионните профили на диференциално експресираните гени, анализът на обогатяване на генната онтология (GO) и анализът на обогатяването на пътя на KEGG показват ясна вариация, базирана на генотип, в генната експресия, свързана с MTI. Терминът GO и резултатите от обогатяването на пътя на KEGG разкриват повече DEG, свързани с имунитета и резистентността на патогените (PR гени, генен отговор на хитин, генен отговор на салицилова киселина, генен отговор на стрес и т.н.), представени в третиран с MAMP SC{{4} }E проби по отношение на третирания с MAMP BTx623. Резултатите осигуряват базова линия за идентифициране на различните компоненти на MTI реакцията на сорго.

2. Резултати и дискусия

2.1. Вариация на окислителния взрив в различни листа от сорго

Нашият предишен анализ на отговора на MTI на различни генотипове на сорго разкри значителна вариация в предизвикания от MAMP оксидативен взрив между генотиповете BTx623 и SC155-14E [38]. Освен това, SC155-14E е линия, показваща висока устойчивост на антракноза, докато линия BTx623 е податлива на антракноза [39]. Поради тези причини тези два генотипа бяха избрани за сравнение с помощта на RNA-seq.

Докато провеждахме по-ранните измервания на ROS, открихме значителна вариация дори в рамките на едно и също растение, което ни накара да проучим по-внимателно източника на тази вариация. По-конкретно, тествахме производството на ROS, като използвахме три комплекта листа, преминавайки от дъното към върха на петнадесетдневни растения BTx623 и SC155-14E. Листата бяха маркирани като #1, #2 и #3, отдолу нагоре, както е показано на Фигура 1А. Резултатите от анализа на ROS (Фигура 1B) разкриват, че: (1) нивото на производство на ROS е по-ниско в по-старите листа (лист #1), докато най-високите нива на производство на ROS в отговор или на flg22, или на хитин са от най-младите листа ( лист №3). (2) Както третираните с MAMP, така и нетретираните най-млади листа на BTx623 2 (лист #2) произвеждат сравнително ниски нива на производство на ROS.

За разлика от това, третираните с MAMP 2-ри най-млади листа на SC155-14E произвеждат значително (на ниво 0.01) по-високи нива на производство на ROS, отколкото нетретирания макет, както и третирания или макет на BTx{ {5}} най-младите листа. (3) Окислителният взрив, предизвикан от приложения на flg22 или хитин, беше открит в листни дискове от най-младите листа (лист #3) и на двата генотипа, въпреки че, както беше отбелязано по-рано, нивата на производство на ROS бяха по-високи в SC, третиран с MAMP 155-14E спрямо BTx623. Времевият ход на flg22-предизвикано и предизвикано от хитин производство на ROS в SC155-14E 2-ри най-млад лист разкри, че предизвиканото от хитин производство на ROS е настъпило по-рано от flg22- задействаното производство на ROS (Фигура 1C ). Подобни резултати са докладвани от Zhang et al. [17] където предизвиканото от хитин производство на ROS се появява по-рано от flg22-задействаното производство на ROS в flg22 и третирани с хитин царевични разсад. Беше съобщено [40], че производството на ROS в отговор на flg22 показва най-високото производство на ROS около 12 минути и е най-ниското на 30 минути в Arabidopsis. Нашите резултати от анализа на ROS в сорго показаха най-високото производство на ROS около 13 минути и най-ниското на 30 минути след третиране с flg22, което е много подобно на резултатите при Arabidopsis. Тъй като нашата цел беше да намерим оптималните условия за сравнение на MTI отговора на двата генотипа, ние избрахме 2-рите най-млади листа на 15-дневни растения за екстракция на РНК и последващ транскриптомичен анализ. Вариацията между листата на единични растения сорго е напомняне, че резултатите могат да варират между експериментите в зависимост от източника, времето и други характеристики на даден експеримент и следователно, че експерименталните параметри трябва да бъдат внимателно контролирани.

Окислителният взрив, бързо, преходно производство на реактивни кислородни видове (ROS), е един от най-ранните наблюдавани аспекти на защитната реакция на растението [41]. Като се има предвид, че избухването на ROS е незабавен отговор, се очаква малко по-късен транскрипционен отговор на гени, свързани с MTI. Събрахме проби 60 минути след третиране с MAMPs за RNA-Seq анализ.

2.2. Диференциално експресирани гени (DEG) на BTx623 и SC155-14E в отговор на лечение с MAMP

За да се оцени нивото на експресия на анотираните Sorghum bicolor протеин-кодиращи гени за всяка проба, броят на чистите прочитания на RNA-seq, които са картографирани към всеки ген, се изчислява и след това се нормализира във FPKM (фрагменти на kb модел на екзон на милион картирани фрагменти). Бяха изследвани промените в експресията на всеки ген в третирани с MAMP листни дискове на BTx623 и SC155-14E в сравнение с фалшиви (водни) обработки. Общо експресираните гени са сходни при всички лечения на двата генотипа: 27 171, 27 283, 27 161, 27 182, 27 512 и 27 175 гени, експресирани в макет на BTx623, flg22-третиран BTx623, третиран с хитин BTx623, макет на SC{ {22}}E, flg22-третирани SC155-14E и съответно третирани с хитин SC155-14E. Използвахме референтния геном BTx623 за картографиране на четене и в двете линии, тъй като конкретната референция за SC155-14E не е налична. Експресираните генни номера, извлечени от BTx623 и SC{{30}}E с всички условия по-горе, разкриха, че и двете линии споделят подобен брой експресирани гени. Общите нива на картографиране на четене на проби от SC155- 14E mock (3 повторения), SC155-14E, третирани с flg22 (3 повторения), SC155-14E, третирани с хитин (3 повторения) , макет на BTx623 (3 повторения), BTx623, третиран с flg22 (3 повторения), BTx623, третиран с хитин (3 повторения) бяха: 93,6 процента, 93,9 процента, 93,9 процента, 93,8 процента, 93,9 процента, 93,6 процента, 93,5 процента, 93,5 процента , 93,1 процента , 96,9 процента , 97.0 процента , 97.0 процента , 97,2 процента , 96,8 процента , 97.0 процента , 96,9 процента , 97.0 процента, съответно 97,0 процента. Тези резултати предполагат, че различните ефекти от лечението с MAMPs върху транскриптомите на BTx623 и SC155-14E не се дължат на разликите в геномната последователност между двата генотипа

PCA диаграмата на генната експресия дава представа за връзката между пробите. За да проучим сходството на нашите проби, направихме PCA анализ. Графика на проби върху PC1 и PC2 (Фигура 2) показа, че четири експериментални условия (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_хитин и SC{ {10}}Е_хитин) са широко разделени. Обратно, трите биологични реплики на всяка линия сорго и всяко третиране с MAMP, както и фиктивното третиране, бяха плътно групирани заедно, съответно, което показва добра възпроизводимост между биологичните реплики (Фигура 2).

Вулканичните графики на фигура 3 показват генна експресия в двете линии сорго, третирани с flg22 или хитин. Графиката на вулкана е вид диаграма на разсейване, която показва статистическа значимост (p-стойност) спрямо величината на промяната (кратна промяна). Той позволява бързо визуално идентифициране на гени с големи промени, които също са статистически значими. Това може да са най-биологично значимите гени. На фигура 3 гени с −log10 (p-стойност), равна на или по-голяма от 3, се считат за DEG. Червените цветни точки представляват DEG, а черните цветни точки представляват не-DEG. Във всеки график гените с log2 (кратно_промяна) по-голямо от 0 са гени с регулиране нагоре, в противен случай гени с регулиране надолу. Най-регулираните нагоре гени са отдясно, най-регулираните надолу гени са отляво, а най-статистически значимите гени са отгоре.

Диференциално експресираните гени (DEGs) бяха избрани от всяко лечение според тяхната значимост на експресия (p-стойност 0.001). Трябва да се отбележи, че използвахме p-стойност от 0.001 като наш праг, но не и FDR (q-стойности), за да изберем DEG в този отчет. FDR (q-стойностите) също бяха значителни на това ниво (Таблици S2–S5). При p-стойност от 0.001, FDR бяха 0.0039, 0.0051, 0.0025 и 0.0035 за BTx623 с лечение с flg22, SC155-14E с лечение с flg22, BTx623 с лечение с хитин и SC{{ 26}}E с лечение с хитин, респ. P-стойностите и q-стойностите на гените на BTx623 и SC155-14E при всички условия са изброени в таблици S2–S5. Чрез анализиране на моделите на експресия на тези гени в третирани с MAMP листа на BTx623 и SC155-14E, ние наблюдавахме голям брой гени (14-30 процента от общо експресираните гени), които показват големи разлики след flg22 или хитин третиране в двете линии сорго. Броят на общите DEG на третирания с хитин BTx623 (8085) беше много близък до този, докладван в предишно изследване на транскриптоми в BTx623, заразен от антракнозния патоген C. subline-ola (8078) [37]. Броят на DEG е по-висок в flg22 (19 процента) или хитин (30 процента) третирани с BTx623 листа в сравнение с SC155-14E (съответно 14 процента и 21 процента).

Въпреки че по-големият брой DEG в третирания с MAMP BTx623 спрямо SC155-14E е противоположен на ROS отговора на тези два генотипа, това може би не е изненадващо, тъй като ROS отговорът и отговорът на генната експресия към лечението с MAMP се появяват при различно време, са до голяма степен независими и са медиирани от различни механизми [42,43]. Терминът GO и обогатяването на пътя на KEGG разкриха повече DEG, свързани с имунитета и резистентността на патогена, представени в третирани с MAMP SC155-14E проби. Нещо повече, фактът, че броят на DEG е по-висок в пробите, третирани с хитин, в сравнение с тези, третирани с flg22, съвпада добре с анализите на реакцията на ROS (Фигура 1B), където видяхме по-силен отговор на ROS при третиране с хитин.

За да проучим до каква степен гените и биологичните процеси се споделят между леченията с flg22 и хитин в BTx623 и SC155-14E, сравнихме техните DEG по-подробно. Диаграмите на Venn на Фигура 4A показват припокриването в DEGs в общите, нагоре и надолу регулирани генни комплекти при p-стойност 0.001. От общо 10 535 DEG, основен набор от 2272 гена реагира както на flg22, така и на лечение с хитин в двете линии на сорго. По подобен начин, от общо 5410 регулирани нагоре гени, основен набор от 1778 гена са регулирани нагоре и в двата генотипа, докато от общо 5125 гени с понижена регулация, основен набор от 474 са регулирани надолу и в двата генотипове.

Данните за RNA seq, представени тук, са анализирани с помощта на биоинформатичния тръбопровод с инструменти Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 и копчета за ръкавели 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) с параметри по подразбиране (тръбопровод #1). За по-нататъшно потвърждаване на резултатите от анализа използвахме друг тръбопровод (тръбопровод #2) с HiSat2, HTSeq и edgeR за извършване на анализа. HiSat2 е следващото развитие на TopHat2. Сравнихме DEG на всяко състояние (т.е. два генотипа, третирани с flg22 или хитин, всички, регулирани нагоре или надолу DEG), избрани с помощта на двата канала. Резултатите (Фигура 5) показват, че DEG числата, избрани с помощта на двата тръбопровода, са много близки.

Общите DEG, избрани с конвейер #1 спрямо конвейер #2, бяха BTx623_flg22: 5241 срещу 5413; SC155-14E_flg22: 3849 срещу 3476; BTx623_хитин: 8085 срещу 8320; SC155-14E_хитин: 5786 срещу 5383. Повишено регулираните DEG, избрани с тръбопровод #1 спрямо тръбопровод #2, са BTx623_flg22: 3074 срещу 3076; SC155-14E_flg22: 2591 срещу 2483; BTx623_хитин: 4156 срещу 4583; SC155-14E_хитин: 3486 срещу 3346. Регулираните надолу DEG, избрани с тръбопровод #1 спрямо тръбопровод #2, са BTx623_flg22: 2152 срещу 2237; SC155-14E_flg22: 1257 срещу 993; BTx623_хитин: 3919 срещу 3757; SC155-14E_хитин: 2296 срещу 2037. В допълнение, резултатите на Фигура 5 също разкриват, че висок процент от DEG, избрани с помощта на двата тръбопровода, се припокриват при всички условия. Процентът на припокрити DEG числа/DEG числа, избрани с помощта на конвейер #1, беше 79,6 процента и 73,7 процента. 80,8 процента и 74,4 процента от общите DEG на BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_хитин и SC155-14E{{73} }хитин, съответно; 83 процента, 80,6 процента, 85,3 процента и 81,1 процента от повишено регулираните DEG на BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_хитин и SC{{ 88}}Е_хитин, съответно; 75,1 процента, 59,5 процента, 75,8 процента и 67,4 процента от регулираните надолу DEG на BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_хитин и SC{{ 105}}Е_хитин, съответно. По този начин тези сравнителни резултати доказаха, че представените данни за RNA seq са правилни, независимо кой от двата метода се използва за анализа.

Топлинната карта на клъстерирани профили на експресия на DEGs на BTx623 и SC155-14E, третирани с flg22 или хитин за трите биологични реплики, е показана на Фигура 6. Стойностите на генната експресия са нормализирани като z-резултати. Цветът се превръща от лилав в червен с увеличаване на стойността, което показва генната експресия от ниска към висока. Тази топлинна карта ясно показва диференциалната регулация на гените в BTx623 и SC155-14E в отговор на flg22 или лечение с хитин. В допълнение, резултатите също показват, че топлинните карти на три биологични реплики във всяко състояние са много близки, което показва добра възпроизводимост между биологичните реплики.

В допълнение, сравнения по двойки (Фигура 7А) между регулирани нагоре и надолу DEGs от flg22 и лечения с хитин показаха, че има голямо припокриване между BTx623 и SC155-14E. Сред 3074 flg22-индуцирани гени в BTx623, 83,8 процента също са индуцирани в BTx623 в отговор на третиране с хитин, докато от 2591 flg22-индуцирани гени в SC155-14E, {{ 16}}.6 процента също са отговорили на третирани с хитин SC155-14E. Това може би не е изненадващо, тъй като предишни работи в Arabidopsis thaliana показаха значително припокриване в гени, отговарящи на различни различни MAMPs, които определят общите пътища на MTI [44–46].

Освен това Zhang et al. [17] също съобщават за значителна корелация между flg22 и хитиновия отговор при царевицата. Наблюдава се по-малко припокриване между BTx623 и SC155-14E листови дискове, третирани със същия MAMP (Фигура 7A). 64,3 процента от индуцираните от flg22-гени в BTx623 са индуцирани в третиран с flg22-SC155-14E и 68,3 процента индуцирани от хитин гени в BTx623 са индуцирани в третиран с хитин SC155-14 д. По подобен начин, от 2152 гена, регулирани надолу при лечение с flg22 на BTx623, висок процент (75,9 процента) също са регулирани надолу от хитин в BTx623. От 1257 гена, регулирани надолу от flg22 в SC155-14E, 70,8 процента също са били регулирани надолу от хитин в SC155-14E. Въпреки това, само 29 процента от гените с понижена регулация на flg22 в BTx623 също са регулирани надолу в третирани с flg22-SC155-14E и 45 процента от гените с понижена регулация на хитин в BTx623 са регулирани надолу в третирани с хитин SC155-14E (Фигура 7А). Следователно, докато имаше значителна конвергенция в MTI пътищата към flg22 и хитин в двата сравнени генотипа, данните също намекват за интересна сложност за това как тези два генотипа реагират на различни MAMPs.

2.3. Генен функционален обогатяващ анализ, сравняващ MTI отговора на BTx623 и SC155-14E

За да определим функционалните категории на гените, регулирани в отговор или на flg22, или на хитин, и диференциалния отговор на двете тествани линии на сорго, използвахме платформата PlantRegMap [47,48], за да извършим анализ на обогатяване на набор от гени въз основа на откритите DEG в биологичните категория процес. Фигура 8A и B показва горните GO термини на гени, обогатени с биологичен процес, с регулирани нагоре DEG и регулирани надолу DEG от BTx623 и SC155-14E. Пълният списък на DEG е предоставен в таблици S6–S13. Много от тези гени са свързани с процеси, включително реакция на стрес, защитни реакции на растенията, реакция на стимул, реакция на биотичен стимул, реакция на бактерия, реакция на друг организъм, клетъчна комуникация, фосфорен метаболитен процес и протеиново фосфорилиране.

Резултатите на фигура 8A и B показват ясни разлики в експресията на гени, обикновено свързани с вродения имунитет между двата генотипа на сорго. В тези обогатени условия на GO бяха открити някои уникални DEG във всяко състояние с припокриване. Например защитният отговор на термина GO (GO 0006952): 91 и 84 повишено регулирани DEG бяха обогатени с BTx623 или SC155-14E, третирани съответно с flg22. В рамките на тези DEG 24 DEG бяха уникални в BTx623 и 15 DEG бяха открити само в SC155-14E, а останалите бяха представени и в двата генотипа на сорго. По подобен начин, 102 и 93 повишено регулирани DEG бяха обогатени с BTx623 или SC155-14E, третирани съответно с хитин. В рамките на тези DEG 20 DEG бяха уникални в BTx623 и 14 DEG бяха уникални в SC155-14E, а останалите бяха представени и в двата генотипа на сорго.

В термина GO на „отговор към хитин (GO: 0010200)“, ние наблюдавахме 18 повишено регулирани DEG от общо 779 гена в тази категория, обогатени в третирани с хитин SC155-14E проби (Фигура 8 ), докато нито един ген не е обогатен в третираните с хитин BTx623 проби. В допълнение, 16 повишено регулирани DEG бяха обогатени с flg22-третирани SC155-14E проби и 12 повишено регулирани DEG бяха обогатени с flg22-третирани BTx623 проби (Фигура 8). Сравнението на DEG списъците на термина GO „отговор на хитин“ във flg22 и третирани с хитин BTX623 и SC155-14E (Таблица S9) разкри, че DEG обогатени с flg22 или третирани с хитин SC155- 14 E бяха същите, с изключение на това, че хитинът индуцира два повече DEG от flg22. Обратно, всичките 12 DEG, обогатени с flg22-третиран BTX623, са различни от DEG, индуцирани от MAMP в SC155-14E. Тези индуцирани от MAMPs DEG могат да допринесат за реакцията на резистентност на антракнозата в SC155-14E, тъй като хитинът е типична молекула на MAMP от гъбични клетъчни стени, която предизвиква имунни отговори на растенията. Стринглис и др. [49] също съобщават, че набор от повишено регулирани DEGs са обогатени с термина GO за „отговор на хитин“ от хитин, flg22 и полезни за растенията rhizobacteria Pseudomonas simiae WCS417 третирани растения Arabidopsis. Матич и др. [33] съобщават, че 21 DEGs са обогатени в термина GO за "отговор към хитин" от RNA-seq анализ на оризови листа на резистентен сорт, но не и от чувствителен сорт след инфекция с гъбичния патоген Fusarium fujikuroi.

PR (свързани с патогенезата) гени участват в имунния отговор на растенията [50] и имат противогъбична активност срещу много фитопатогенни гъби [51]. PR-10 протеините са малки, основно киселинни, вътреклетъчни протеини с противогъбични свойства, които са свързани със защитните реакции при растителни видове, включително сорго [52]. PR-10 членовете на генното семейство са индуцирани от патогенни атаки в голямо разнообразие от растителни видове [53]. При соргото Lo et al. [26] съобщават, че експресията на PR-10 е индуцирана като част от активната защита на гостоприемника на сорго срещу листни гъбични патогени C. heterostrophus и C. sublineolum. Кейти и др. [54] съобщават, че няколко сорта сорго показват значително индуциране на нормализирани относителни количества PR-10 след инокулиране с гъбични спори на C. lunata и F. capsicum при полеви тестове. В условия на оранжерия, черупките на инокулираните растения показват индукция на PR-10 иРНК и отговорът е по-голям при два тествани устойчиви сорта в сравнение с два чувствителни сорта.

Our results revealed that among the DEGs identified, four PR-10 genes were found (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001G401000). In SC155-14E all four PR-10 DEGs were upregulated by flg22 or chitin treatment, by contrast, in BTx623, SORBI_3001G401000 was not found in DEGs, and SORBI_3001G401300 (up-regulated) was only presented in BTx623 with chitin treatment but not with flg22 treatment. This indicated that expression of PR genes could be employed in response to higher ROS product levels after MAMPs treatment and resistance against anthracnose in SC155-14E.

Салициловата киселина (SA) е растителен имунен сигнал, който е от съществено значение както за локалния защитен отговор, така и за придобитата системна резистентност. Играе важна роля в устойчивостта и защитата на растенията срещу атаки на патогени [55]. При соргото Tugizimana et al. [56] съобщават за количествени промени в нивата на жасмонова киселина, конюгати на салицилова киселина и абсцизова киселина в сорго, заразено с C. subline-ola. C. subline-ola е причинителят на антракнозата. Генотипове на сорго с повишени нива на аминокиселини (триптофан и тирозин), жасмонова киселина и салицилови конюгати и зеатин са по-устойчиви на антракноза. В това проучване терминът GO „отговор на салицилова киселина“ (GO: 0009751), включително 19 повишено регулирани DEG, беше специално обогатен само в SC155-14E, третиран с хитин (Таблица S9). Следователно салициловият сигнален път може да играе важна роля в отговор на по-високи нива на производство на ROS след лечение с MAMP и резистентност срещу антракноза в SC155-14E.

Освен това, 169 повишено регулирани DEG бяха обогатени в отговор на термина GO на стрес единствено в SC155-14E, третирани с хитин (Таблица S9). Другите GO термини, открити само в SC155-14E, третирани с MAMPs, но не и в BTx623 със същото третиране, са вторични метаболитни процеси (GO:0019748), биосинтетичен процес на фосфатидилхолин (GO:0006656) и липиден биосинтетичен процес ( GO:0008610).

Освен това, 169 повишено регулирани DEG бяха обогатени в отговор на термина GO на стрес единствено в SC155-14E, третирани с хитин (Таблица S9). Другите GO термини, открити само в SC155-14E, третирани с MAMPs, но не и в BTx623 със същото третиране, са вторични метаболитни процеси (GO:0019748), биосинтетичен процес на фосфатидилхолин (GO:0006656) и липиден биосинтетичен процес ( GO:0008610).

Ние също така изследвахме състава на гените, които се регулират съвместно между двата генотипа след лечение с flg22 или хитин, както и основните набори от DEG във всички лечения и два генотипа чрез анализ на обогатяване на GO (Фигури 4B и 7B). Пълният списък на DEG е даден в таблици S14 и S15. Фигура 4B показва обогатените условия на GO на основните набори от общите, регулирани нагоре и надолу DEG в BTx623 и SC155-14E с всички лечения. Термините GO, свързани с реакцията на MAMPs и защитата на растенията (напр. свързване на хитин, защитна реакция, активност на протеин киназа, протеиново фосфорилиране, активност на протеин серин/треонин киназа), са значително обогатени с повишено регулиране на DEG, докато GO термините на биосинтетичен процес на вторичен метаболит, свързването на железни йони, оксидоредуктазната активност са обогатени само с понижено регулирани DEG. Този резултат е подобен на резултатите при Arabidopsis, където GO термините, свързани с отговора на елиситори (flg22 пептиди от P. simile WCS417 и P. aeruginosa PAO1, хитин и бактериални клетки от P. simile WCS417) са най-значително обогатени в повишено регулиране основен набор от DEG [49].

Фигура 7B показва значително обогатените GO термини на ко-регулирани (т.е. регулирани нагоре или надолу и в двата генотипа) набори от DEGs между BTx623 и SC155-14E след лечение с flg22 или хитин. Резултатите разкриха, че GO термините, свързани с отговора на MAMPs и защитата на растенията (напр. защитен отговор, активност на протеин киназа, протеиново фосфорилиране, активност на протеин серин/треонин киназа) са обогатени само с flg22 или хитин-регулирани нагоре DEG и в двата генотипа, докато термините GO на биосинтетичния процес на вторичния метаболит, свързването на хема, свързването на железни йони, оксидоредуктазната активност на един атом кислород и биосинтетичния процес на фосфатидилхолин са обогатени единствено с низходящо регулирани набори от DEG.

2.4. Анализ на обогатяване на пътя на KEGG на реакцията на MTI на BTx623 и SC155-14E

Фигура 9 показва анализа на обогатяването на пътя на KEGG на повишено регулираните DEG, открити в третирани с MAMP BTx623 и SC155-14E проби, използвайки онлайн инструмента DAVID [57]. Пълният списък на DEG е предоставен в таблици S16–S20. Резултатите идентифицират тези специфични топ пътища на KEGG, обогатени в резултат на активирането на MTI в двата генотипа на сорго. В пътя на KEGG „взаимодействие растение-патоген“ ние наблюдавахме, че 24 регулирани нагоре DEG са обогатени в третирани с хитин SC155-14E проби, докато нито един от DEG не е обогатен в третирани с хитин BTx623 проби. По-силният хитинов отговор на генотип SC155-14E корелира с по-голямата устойчивост на този генотип към гъбичната болест антракноза [39]. Освен това, обогатяването на пътя на KEGG разкрива 28 гена, участващи в биосинтезата на термина фенилпропаноид в SC155-14E, третирани с flg22. Пътят на биосинтеза на фенилпропаноид започва с фенилаланин, който може да се превърне в ароматни съединения като флавоноиди, бензеноиди, кумарин, хидроксицинамати и лигнин [58,59]. Много фенилпропаноиди и флавоноиди участват в реакцията на резистентност към болестта [28,60]. Производството на фитоалексини е основен защитен отговор срещу антракнозния патоген C. subline-ola [28] в соргото. 3- дезоксиантоцианидините са необичайна група флавоноиди, разпознати като фитоалексини в соргото. Фитоалексините са малки молекули с антимикробна активност, произведени след инфекция с патоген [61]. Wang и др. [37] също установиха, че терминът KEGG фенилпропаноидна биосинтеза е значително обогатен в DEG на инфектирани с C. subline-ola растения в тяхното транскриптомично изследване на сорго. Трябва да отбележим, че резултатите от обогатяването на пътя на KEGG (Фигура 9) също показват по-висок отговор на BTx623 след лечение с MAMPs в някои пътища, които могат да играят роля във взаимодействията растение-патоген (напр. в пътищата на биосинтеза на фенилаланин и триптофан, биосинтеза на антибиотици).

Освен това, резултатите от анализа на обогатяването на пътя на KEGG на регулираните надолу DEG разкриват, че десет регулирани надолу DEG са анотирани като „протеини на фотосинтеза-антена“, а 84 DEG са анотирани като участващи в „биосинтезата на вторични метаболити“ са обогатени с третирани с flg22 BTx623. Въпреки това, такива изследвания на генната експресия могат да идентифицират гени, различно експресирани в отговор на лечение с MAMP или патогенна инфекция, но не е задължително да демонстрират, че тези гени са критични за резистентност срещу специфичен патоген. По този начин ще са необходими допълнителни изследвания, за да се разберат причинно-следствените връзки между резистентността към гъбичките и активирането на тези KEGG пътища и в двата генотипа, както се разкрива чрез RNA-Seq анализ.

Ние също така извършихме анализ на обогатяване на пътя на KEGG за основните набори от DEG при всички условия (Фигура 4C), както и ко-регулираните DEG между двата генотипа след лечение с flg22 или хитин (Фигура 7C). Резултатите разкриха, че шест значими пътя, включително пътя на взаимодействие растение-патоген, са обогатени само в регулирани нагоре основни набори от DEG, но не и в регулирани надолу основни набори от DEG. По подобен начин, седем и три пътя, включително пътят на взаимодействие растение-патоген, бяха значително обогатени с високо-регулирани с хитин DEGs и flg22 с повишено регулиране на DEG в BTx623 и SC155-14E, съответно. Обратно, само рибозомната биогенеза в пътя на еукариотите е обогатена с DEG, регулирани надолу с хитин, и в двата генотипа.

2.5. Валидиране на данните за RNA-Seq с помощта на количествена RT-PCR на избрани гени

За да потвърдим данните за профилиране на генната експресия, получени от RNA-seq, извършихме qRT-PCR анализ, за ​​да оценим експресията на девет избрани кандидат-гена. Тези девет гена бяха избрани въз основа на експресията, наблюдавана от RNA-seq в три категории: (a) експресирани по подобен начин в BTx623 и SC155-14E с flg22 или лечение с хитин; (b) експресиран само в третираните с MAMPs SC155-14E, но с изключително ниска експресия в третирания BTx623 и (c) експресиран 2–21-пъти по-високо в третираните с MAMPs SC155-14E спрямо BTx623 . Резултатите от qRT-PCR анализа (Таблица 1) разкриха пълно съответствие с нивата на експресия, определени чрез RNA-seq анализ за всеки от деветте оценени гена. Тези резултати ни дават увереност, че измерванията, направени от RNA-seq, отразяват транскрипционния отговор на линиите на соргото към лечението с MAMP

2.6. Изводи

В това проучване първо открихме оптималните условия за сравнение на реакцията на MTI на двата генотипа чрез тестване на производството на ROS, използвайки три комплекта листа и избрахме вторите най-млади листа на петнадесетдневни растения за екстракция на РНК и последващ транскриптомичен анализ. Времевият ход на flg22-задействано и задействано от хитин производство на ROS в соргова линия SC155-14E (Фигура 1C) разкри, че задействаното от хитин производство на ROS е настъпило по-рано от това, задействано от лечението с flg22. Получихме профилите на експресия на устойчивото на гъбично заболяване антракноза Sorghum bicolor генотип SC155-14E с висок отговор към третиране с MAMPs върху производството на ROS и чувствителния генотип BTx623 с нисък отговор на ROS продукт към третиране с MAMP по време на ранните етапи на отговора на вродения имунитет.

Резултатите демонстрират ясна вариация на генната експресия в генотипове BTx623 и SC155-14E на сорго в отговор на третиране с MAMP. Въпреки че отговорите на двата MAMP показват значително припокриване във всеки ред (86.6–70.8 процента), те са различни. Известно, макар и по-ниско, припокриване (68,3–29 процента) също се наблюдава между отговорите на двете линии към един и същ MAMP. Значителен брой DEG, 2272 от 10 535 DEG, бяха идентифицирани във всичките четири условия и условно определят основния отговор на MAMP. Този списък от гени трябва да бъде полезен за онези лаборатории, които искат да профилират реакцията на генната експресия към лечението с MAMP. Анализът на RNA-seq идентифицира големи набори от диференциално експресирани гени в BTx623 и SC155-14E, третирани с flg22 или хитин в сравнение с нетретирани фалшиви контроли на тези две линии. Освен това, сравнение на DEG, избрани с помощта на два различни биоинформационни тръбопровода, показа много сходни резултати. Подробен анализ на профила на експресия на тези DEGs, анализ на обогатяване на GO и анализ на пътя на KEGG разкрива ясна вариация в отговора на генната експресия на двата генотипа. Терминът GO и обогатяването на пътя на KEGG откриват повече DEGs, свързани с имунитета и резистентността на патогените (PR гени, генен отговор на хитин, генен отговор на салицилова киселина, отговор на стрес, фенилпропаноидна биосинтеза и т.н.) в третирани с MAMP SC{{18} }E проби по отношение на BTx623 със същата обработка. Тази информация предоставя важна базова информация за това как вродената имунна система на това ключово културно растение реагира на предизвикването на MAMP. Като се има предвид общата липса на информация за вродения имунен отговор на културните растения, по отношение на модела Arabidopsis, описаните генни списъци и методи предоставят ресурс за по-нататъшно изследване на отговора на соргото към патогени и трябва да улеснят усилията за окончателно подобряване на резистентността към болести в тази важна култура за храна и биомаса.

3. Материали и методи

3.1. Растителни материали

Две линии сорго, предоставени от д-р Уилям Рууни (Тексаски университет A&M, College Station, САЩ) и д-р Стивън Кресович (Университет Клемсън, Клемсън, САЩ) бяха използвани в това изследване. BTx623 е стандартна линия на сорго с налична последователност на целия геном [22], а SC155-14E е линия, разработена за устойчивост на антракноза [39].

3.2. ROS анализи

Семената от сорго на BTx623 и SC155-14E бяха повърхностно стерилизирани (70 процента етанол за 1 минута и след това 10 процента белина за 10 минути, изплакнати с автоклавирана ddH2O) и засадени в автоклавирана смес за саксии Sunshine и покълнати в камери за растеж ( 16 часа/8 часа светло/тъмно, 28/26 ◦C, 60–70 процента влажност). За експерименти са използвани петнадесетдневни растения.

Два MAMPs, flg22 (Genscript каталог # RP19986) и хитин от черупка на рак (Sigma-Aldrich, каталог # C3641), бяха използвани в това изследване. Flg22 е пептид, получен от N-края на флагелина на патогенни за растенията бактерии и е добре известно, че предизвиква специфичен вроден имунен отговор в растенията [62]. Хитинът е типична MAMP молекула, получена от гъбични клетъчни стени, която предизвиква имунни реакции на растенията [3]. ROS анализите са извършени съгласно Kimball et al. [38]. За да се оцени вариацията в отговора на MAMP в рамките на отделните генотипове, както и позицията на листата, всичките три напълно разширени листа на растенията от всеки генотип бяха оценени индивидуално. Листата от дъното до върха на петнадесетдневните растения сорго от всеки генотип бяха маркирани като лист #1, #2 и #3. Използвахме само средната част на листа за вземане на проби за измерване на производството на ROS. Веднага след третирането хемилуминесцентният сигнал на всяка проба се записва в продължение на 30 минути с помощта на CCD камера Photek (Photek Ltd., Източен Съсекс Обединеното кралство). Осем ямки се състоят от фалшиво лечение (без MAMP) и осем ямки се състоят от лечение (с MAMPs). Във всеки случай бяха сравнени три биологични реплики с общо 8 проби за всяко третиране.

3.3. Примерно лечение с MAMPs

За експерименти са използвани петнадесетдневни растения. Лечението с MAMPs се извършва, както е описано във Valdes-Lopez et al. [12] с малки модификации. Накратко, вторият лист (от върха, т.е. вторият най-млад лист) от пет растения за всяка линия на сорго се отделя и след това се инфилтрира под вакуум с автоклавирана ddH2O за 2 минути. Около петдесет листни диска с диаметър 1 cm бяха изрязани от инфилтрираните с вода листа на всеки генотип и събрани. Четиридесет и пет листни диска от всеки генотип бяха прехвърлени в три различни петриеви панички (15 листни диска във всяко петриево блюдо) и след това плаваха една нощ при стайна температура върху автоклавирана ddH2O с плочите, покрити с алуминиево фолио. На следващия ден водата се отстранява от всички петриеви панички и се заменя с 10 mL ddH2O (макет), 10 mL 1 µM flg22 или 10 mL 20 mg/mL разтвор на хитин. След 60-минутно третиране, фиктивно и MAMP-третирани листни резени бяха събрани в различни епруветки и незабавно замразени в течен азот. Пробите от листни срезове (за 101 секвенирани "ies ied-11272) имунитетBTx623 и SC155-14E с фалшиви, flg22 или хитинови обработки, три биологични реплики) се съхраняват при -80 ◦C за екстракция на РНК. Всички описаните по-горе процедури бяха извършени при тъмни условия, за да се елиминира всеки възможен ефект на фотосинтеза.

3.4. Екстракция на РНК, секвениране и конструиране на библиотека

Екстракцията на РНК се извършва с помощта на комплекта Direct-zol RNA Miniprep Plus от Zymoresearch (каталог #R2071) съгласно инструкциите на производителя

Високопроизводителното секвениране беше извършено в ДНК ядрото на Университета на Мисури. Бяха конструирани осемнадесет библиотеки, следвайки протокола на производителя с реагенти, доставени в комплекта за приготвяне на пробите TruSeq mRNA на веригата на Illumina. Концентрацията на пробата се определя чрез флуорометър Qubit (Invitrogen), като се използва комплектът за анализ на Qubit HS RNA, а целостта на RNA се проверява с помощта на автоматизираната система за електрофореза на Fragment Analyzer. Накратко, поли-А съдържащата тРНК се пречиства от обща РНК (1 µg), РНК се фрагментира, двойноверижна сДНК се генерира от фрагментирана РНК и адаптерите, съдържащи индекс, се лигират към краищата. Амплифицираните cDNA конструкции бяха пречистени чрез добавяне на Axyprep Mag PCR Clean-up гранули. Крайният конструкт на всяка пречистена библиотека беше оценен с помощта на автоматизирана система за електрофореза Fragment Analyzer, количествено определен с флуорометър Qubit, използвайки комплекта за анализ на Qubit HS dsDNA, и разреден съгласно стандартния протокол за секвениране на Illumina за секвениране на NextSeq 500. Дължината на секвенирането беше единична прочетено на 75 бази.

3.5. Картиране и обработка на четения на RNA-Seq

Данните за последователността представляват шест различни състояния: BTx623 с макет, flg22 или лечение с хитин и SC155-14E с макет, flg22 или лечение с хитин. Всяко състояние беше представено от три биологични повторения, което доведе до общо 18 проби. Първо, 30 края на показанията бяха „подрязани“ за адаптери на Illumina, за двусмислени нуклеотиди (N) и (поради технологията NextSeq) за изкуствен поли-G (представен като G{100}) с помощта на cutadapt версия 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, достъпна на 21 август 2019 г.) за четения, чиито 30 края се припокриват с адаптера за минимум 3 бази с 90 процента идентичност. Ако след това изрязване, четене съдържа по-малко от десет бази, то се отхвърля (заедно със сдвоеното четене, ако е приложимо). Резултатите за качество за данните за RNA seq след подрязване бяха изследвани с помощта на FASTQC (версия 0.11.9) [63]. За всички позиции в четенията средният резултат за качество е около 34, което показва, че основната точност на извикване е по-висока от 99,9 процента. Отчитанията за всяка проба бяха приведени в съответствие с референтния геном (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. най-високо ниво. fa) с Tophat 2.1.1. Получените файлове за подравняване бяха предоставени на Копчета за ръкавели 2.2.1 за сглобяване на преписи за всяка проба. Версията на анотацията, използвана в това изследване, беше Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Проби от едно и също състояние бяха обединени с помощта на Cuffmerge. Целта беше да се осигури еднаква основа за изчисляване на експресията на ген и транскрипт при всяко състояние.

3.6. Биоинформационен анализ на RNA-Seq данни

Данните за RNA seq бяха анализирани с помощта на инструменти за биоинформатика Bowtie{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 и копчета за ръкавели 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) с параметри по подразбиране. Използвахме същия тръбопровод с тези инструменти, както е описано в Trapnell et al. [64]. За по-нататъшно потвърждаване на резултатите от анализа използвахме друг конвейер с HiSat2 (версия 2.1.0), HTSeq (версия 0.12.4) и edgeR (версия 3.26.8), за да извършим анализа. HiSat2 е следващото развитие на TopHat2. Първо, използвахме HiSat2, за да направим подравняването, използвайки референтния геном на Sorghum. След това използвахме HTSeq, за да преброим колко прочитания са картографирани към всеки ген. За целта се нуждаехме от bam файловете, генерирани от предишната стъпка, и анотацията на генома (gif файл). Имайте предвид, че референтният геном и файловете с анотации са същите, които използвахме в оригиналния конвейер. И накрая, използвахме R пакет edgeR, за да определим диференциално експресираните гени във всяко състояние

3.7. Идентифициране на диференциално експресирани гени
Обединеният комплект беше подаден към Cuffdiff, който изчислява нивата на експресия и тества статистическата значимост на наблюдаваните промени между две условия. Сравнихме условията между макет срещу flg22 и макет срещу хитин съответно за BTx623 и SC155-14E. Диференциално експресираните гени бяха извлечени с помощта на 0.001 прагове на p-стойност. Графиките на вулкана бяха направени с помощта на пакета R (ggplot2 V3.3.0), за да се покаже значението на промяната на генната експресия в условия BTx623, третирани с flg22 или хитин и SC155- 14E, третирани съответно с flg22 или хитин. Генните точки с -log10 (p-стойност), равна или по-голяма от три, се считат за DEG. Във всеки график генните точки с log2 (кратно_промяна) по-големи от нула са били регулирани нагоре гени, в противен случай те са регулирали надолу гени.

3.8. PCA сюжет

За да се изследва връзката между стойностите на генната експресия на три биологични реплики на всяка линия сорго и всяко третиране с MAMP, бяха генерирани диаграми за анализ на главните компоненти (PCA) с помощта на R пакети (ggfortify V{{0}}).4.10, ggplot2 V3 .3.0). Всяка точка представлява състояние след картографиране от оригиналното пространство на характеристиките (генна експресия) към първите два основни компонента. Точките, принадлежащи към едно и също състояние, са склонни да се групират заедно

3.9. Топлинна карта на DEG

1 Отдел за растителна наука и технологии и биохимия, CS Bond Life Sciences Center, Университет на Мисури, Колумбия, MO 65211, САЩ; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 Катедра по електротехника и компютърни науки, CS Bond Life Sciences Center, Университет на Мисури, Колумбия, Мисури 65211, САЩ; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Отдел за изследване на растенията, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, САЩ

* Correspondence: staceyg@missouri.edu