Каква е разликата между диво растящата цистанша и изкуствено култивираната цистанча относно активността за повишаване на имунитета

За контакт: Одри Хуaudrey.hu@wecistanche.com

Джао Бинг; Ян Сюмей; У Даочън; Ба Ксуели; Ли Куансяо; Тан Ячао; Джан Айлян

Резюме:

Обективен:За сравняване на ефектите за повишаване на имунитета на диво растящата цистанша и изкуствено култивираните полизахариди от цистанша (наричани съответно: WCDPS и CCDPS).

Методи:Различни дози (ниски, средни и високи) на WCDPS и CCDPS и овалбумин (OVA) бяха подкожно имунизирани с ICR мишки, OVA-специфично антитяло IgG и подтипове на антитела IgGl и IgG2a бяха открити чрез ELISA и чрез MTT метод. OVA-специфична активност на лимфоцитна пролиферация, поточна цитометрия за откриване на нивото на експресия на CD4 плюс Т клетки и CD8 плюс Т клетки.

Резултати:Както WCDPS, така и CCDPS могат значително да повишат нивата на експресия на OVA-специфично антитяло IgG и типизиращо антитяло IgG1 и IgG2a (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); WCDPS и CCDPS също могат значително да увеличат процента на CD4 плюс Т и CD8 плюс Т клетки Подсъдържание (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), WCDPS и CCDPS нямат ефект върху теглото на имунизираните мишки.

Заключение:Както WCDSP, така и CCDPS могат значително да подобрят OVA-специфичните хуморални и клетъчни имунни отговори и няма статистически значима разлика между двете и те имат добра безопасност.

Ключови думи: цистанче; полизахариди от цистанх; овалбумин; адювант

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),известен също като Cunyun и Dayun, е паразитно тревисто растение от Lydanaceae в продължение на много години. Това е рядък и ценен китайски медицински материал. Неговите основни съставки включват полизахариди от цистанче, фенилетаноидни гликозидни съединения на цистанче, органични киселини, алкалоиди и др.⑷, имат множество функции като подхранване на есенция и кръв, подпомагане на ян и тонизиране на бъбреците и облекчаване на стареенето⑸. Поради изключително високата медицинска стойност на цистанче, свръхексплоатацията на диви видове е на ръба на изчезване, а изкуствено култивираният цистанч е успешен. Изследователи в страната и чужбина са направили много изследвания върху химическите компоненти и активните съставки на диво растящата цистанча и изкуствено култивираната цистанча, но има малко доклади за сравнението на полизахариди от дива и култивирана цистанче от адювантна активност на цистанче (WCDPS/CCDPS). . Голям брой изследвания показват, че растителните полизахариди от цистанче като адювант могат да регулират имунния отговор на организма. Много изследователи са използвали китайската билкова медицина като адювант на ваксината и са постигнали добър напредък".

Това проучване се основава на предишно изследване (6) за сравнение наимуноподсилващидейности на Xinjiang WCDPS и CCDPS. Главно чрез експерименти с имунизация на мишки, различни дози WCDPS и CCDPS бяха подкожно имунизирани с OVA в ICR мишки и техните ефекти върху нивото на хуморалнияимунитети клетъчен имунитет, индуциран от OVA след имунизация, са тествани. Сравнетедиво растат цистанчеиизкуствено култивирана цистанчеполизахариди Повишаващата имунитета активност на полизахаридите в цитрусовите плодове може да предостави ориентир за по-добро развитие и използване на изкуствено култивирана цистанче в Синцзян.

Материали и метод

Експериментални материали:

Диворастяща цистанче и култивирана цистанче (достъпни в търговската мрежа). RPMI 1640 културална среда е закупена от GIBCO; Фетален говежди серум е закупен от Israel Bioind; Антитела за поточна цитометрия: PE плъх-анти-миши CD3, APC плъх-анти-миши CD4, FITC плъх-анти-миши CD8a бяха закупени от American BD company, яйчен белтък Протеин (Ovalbumin, OVA) Sigma продукт, кози анти-миши, белязан с хрян пероксид IgG, IgGl и IgG2a бяха закупени от Southbiotech, САЩ. Другите експериментални химически реагенти са всички местни аналитични реактиви.

Експериментални животни:

Женски ICR мишки с чист клас (6-8 седмици, 18-22 g) бяха закупени от Центъра за експериментални животни на Медицинския университет в Синдзян. Животните бяха държани в помещението за животни на нашата лаборатория и експериментът започна 7 дни след като животните бяха аклиматизирани.

Подготовка на WCDPS и CCDPS:

Справка [17] използва метода на водна екстракция и алкохолно утаяване. Кратките стъпки са както следва: Вземете сух прах от култивирана и дива цистанче в Синцзян, добавете 10 пъти обема вазелин и абсолютен етанол към ултразвук за 1 час; след филтриране чрез изсмукване, запазете остатъка от лекарството и го изсушете, добавете 10 пъти обема на дестилирана вода 37T ултразвук два пъти, центрофугирайте при 4 000 r/min за 10 минути, комбинирайте супернатантите, изпарете на ротационен принцип и концентрирайте и утаете за една нощ с алкохол; след вакуумно филтруване и сушене се получава суровият екстракт на прах; Методът Savage ⑻ премахва протеин от WCDPS и CCDPS. Съдържанието на полизахариди от цистанх в WCDPS и CCDPS, определено по метода на лук-сярна киселина, е съответно 76,82% и 59,58%.

Имунизация на мишка и вземане на серум:

Женските ICR мишки на възраст {{0}} седмици бяха използвани като експериментални животински модели. Експериментът беше разделен на 9 групи, по 5 във всяка група: 0.9 процента NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 net, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 net. Разтворете с 0,9 процента NaCl преди имунизация и имунизирайте мишките подкожно два пъти с интервал от 2 седмици. Кръвта се събира преди имунизация, а серумът-80Y се приготвя и съхранява за по-късна употреба.

Ефектите на WCDPS и CCDPS върху растежа на мишки:

За да се наблюдават ефектите на WCDPS и CCDPS върху растежа на мишките, теглата на мишките във всяка група бяха претеглени на 0 d преди първоначалната имунизация, 14 d и 21 d след имунизацията.

Откриване на миши серумни антитела IgG и типизиране след WCDPS и CCDPS имунизация:

Индиректният метод ELISA се използва за определяне на серумни антитела. Плаката ELISA се покрива с 2,5 jig/ml OVA, 4Y за една нощ; промито с PBST 3 пъти и след това добавено 5 процента обезмаслено мляко на прах 37L за блокиране за 1 час; промити 3 пъти с PBST и добавено първично антитяло към мишките след имунизация във всяка група Серум, съотношението на разреждане на първичното антитяло е 1: 100, 100 таблетки на ямка, 37Tl h; след промиване 3 пъти с PBST, добавете вторични антитела: кози анти-миши IgG, IgGl, IgG2a (l: 5 000), белязани с HRP 37 Инкубирайте дракона за 1 час; след промиване 4 пъти с PBST, добавете тетраметилбензидин (TMB) субстратен разтвор, за да избегнете светлина за 15 минути. Добавете 50 към всяка ямка, за да спрете реакцията с 2 mol/L H2SO4, и измерете стойността A45O/655. Сравнете нивата на антителата във всяка група.

Откриване на пролиферация на лимфоцити в далака на мишка след имунизация с WCDPS и CCDPS:

Методът МТТ беше използван за откриване на пролиферацията на лимфоцити в далака на мишки, имунизирани с CCDPS и WCDPS. Далакът на мишките се изолира при асептични условия 21 дни след първоначалната имунизация и клетките от далака се разреждат с 10 процента FBS-съдържаща RPMI 1640 среда, за да се направят суспензии на единични клетки, преброяване и коригиране на клетките (r клетки/ml разпръснете в 96-плака за клетъчна култура с гнезда, добавете съответно 20 OVA (крайна концентрация 10 |xg/ml) и ConA (крайна концентрация 5 pig/ml) Стимулирайте, задайте празна клетъчна контрола и празен серум контрола по едно и също време, поставете го в 37Y клетъчен инкубатор за 48 часа, добавете 20 MTT към всяка ямка, 37^ и продължете да инкубирате в продължение на 4 часа, добавете 100|±1 DMSO към всяка ямка, за да разтворите и тествате сърцето 0 / 63. Стойност, изчислете индекса на стимулация (SI) на всяка група мишки.

Експресията на CD4 и CD8 върху CD3 плюс Т клетки след WCDPS и CCDPS имунизация:

Използва се поточна цитометрия за откриване на експресията на CD4 плюс Т и CD8*T клетки на повърхността на CD3 плюс Т клетки. Далакът на мишката се изолира при асептични условия 21 дни след първичната имунизация и далакът се третира с RPMI 1640 среда, съдържаща 10 процента FBS. Пригответе единична клетъчна суспензия, пребройте и регулирайте броя на клетките до 1x106 клетки/проба, извършете CD4 и CD8 оцветяване на повърхността на CD3 плюс Т клетките, предпазете от светлина при стайна температура за 25 минути и използвайте 10 ml от фосфатно буфериран разтвор, съдържащ 0,5 процента FBS (фосфатно буфериран разтвор). физиологичен разтвор, PBS) 1 200 r/min 7 минути промиване веднъж, добавете 250 |jil PBS, прекарайте 200 меша медна мрежа, поточна цитометрия за откриване на експресията на CD4 и CD8 на повърхността на CD3*T клетки.

Статистически методи:

Софтуерът Flowjo 7.6 обработва резултатите от теста за поточна цитометрия; GraphPad Prism 5.0 се използва за анализ на данни и всички данни са базирани на средно ± стандартно отклонение. Използвайте ученик и тест, за да сравните данните между експерименталните групи. П<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Резултат

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. Ефектът на WCDPS и CCDPS върху OVA-специфично антитяло IgG: WCDPS и CCDPS бяха подкожно имунизирани с OVA за откриване на експресията на OVA-специфично антитяло IgG в серума след 14 дни и 21 дни имунизация. Резултатите са показани на фигура 1, WCDPS и CCDPS насърчават експресията на антитяло IgG в серума по дозозависим начин; OVA плюс WCDPS 50 p,g в сравнение с OVA плюс CCDPS 50 |xg може значително да стимулира OVA-специфичните антитела в сравнение с OVA плюс CCDPS 50 |xg. Експресията на IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. Ефектът на WCDPS и CCDPS върху OVA-специфично типизиране на антитела: 21 дни след имунизацията, експресията на OVA-специфично антитяло типизиращо IgG1 и IgG2a в серума беше открито. Резултатите са показани на фигура 2. OVA-WCDPS 50 jig и OVA-WCDPS 100 |xg Mumu значително стимулират експресията на антитяло IgG2a в серума, отколкото OVA групата самостоятелно (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. Ефектът на WCDPS и CCDPS върху пролиферацията на миши OVA-специфични лимфоцити: За да се открие ефектът на WCDPS и CCDPS върху далачните лимфоцити, полизахаридите от цистанхе бяха подкожно имунизирани с OVA и клетките от далака бяха отделени 21 дни след имунизацията , и методът MTT беше използван за тяхното откриване Насърчаване на OVA-специфична лимфоцитна пролиферация. Резултатите са показани на Фигура 3. WCDPS и CCDPS засилват OVA-специфичната лимфоцитна пролиферация по дозозависим начин. Комбинацията от WCDPS и CCDPS с OVA групата може значително да стимулира OVA-специфичната лимфоцитна пролиферация в сравнение с OVA групата самостоятелно. Лимфоцитна пролиферация (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. Ефектът на WCDPS и CCDPS върху CD3 плюс CD4 плюс Т и CD3 плюс CD8 плюс Т клетки: 21 дни след като WCDPS и CCDPS бяха подкожно имунизирани с OVA, експресията на CD4 и CD8 в CD3 плюс Т клетки беше открита чрез поточна цитометрия , както е показано на Фигура 4А. Показано е, че OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 jig и OVA-WCDPS 100 могат значително да стимулират пролиферацията на CD3 плюс CD4 плюс Т клетки (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

Дискусия

Многобройни проучвания показват, че китайската билкова медицина има имуномодулираща функция "Da], а също така има голям брой доклади, доказващи, че полизахаридите от китайската билкова медицина от цистанче могат да се използват като адювант за подобряване на имунния ефект на ваксините"3], и пустинното месо от Синдзян от Конгронг, избрано в това проучване, е уникален лечебен материал в Синдзян, а дивите видове са на ръба на изчезване, съчетано с тяхната по-висока медицинска стойност, култивирането на култивирани видове е особено важно за развитието и използването на лечебни растителни ресурси . Новите ваксини на текущия пазар имат добра антигенна специфичност, но слаба имуногенност. Растителните полизахариди от цистанче могат да компенсират този дефицит. моята страна има голямо предимство в изследванията на китайската билкова медицина. Ние проверяваме адювантите на ваксината от естествените китайски билкови лекарства. Висока осъществимост. Проучванията показват, че китайските билкови полизахариди от цистанче имат различна степен на регулиране на специфичния имунитет и неспецифичния имунитет, като полизахариди от Ganoderma от цистанче, полизахариди на Radixisatidis от цистанче, полизахариди на Poria cocos от цистанче коджи, инулинови полизахариди от цистанче 27] и др. Може да засили имунния ефект на ваксината.

Поради бързото увеличаване на търсенето на цистанче, неговите диви видове са изчезнали и сега са включени в списъка на застрашените и защитени растения в моята страна. Въз основа на успеха на изкуственото засаждане на пустинята Caulis Carlsbad се очаква култивираните видове да заменят дивите видове. В този експеримент, диво отгледани цистанхи и култивирани изкуствени култивирани цистанхи полизахариди бяха използвани като OVA адюванти за провеждане на in vivo експерименти за имунизация на мишки. Чрез тестване на различни показатели първоначално беше оценен имунният ефект на дивата и култивираната цистанча, което предостави справка за ефективното използване на култивираната цистанча в Синдзян.

За да се разбере безопасността на диво растящата цистанче и култивираната изкуствено култивиранацистанхеви захаридиот cistanche, експерименти с имунизация на животни in vivo са наблюдавали характеристиките на външния вид на мишките и са установили, че мишките нямат диария, изправена коса или сълзи след имунизацията и техните дейности и дишане са нормални и няма мускулни потрепвания. Няма значителна разлика в телесното тегло на мишките във всяка група поради феномена на разстройството, което показва, че имунизацията с WCDPS и CCDPS не е повлияла на растежа на мишките и има определена степен на безопасност. Антитяло IgG и резултатите от теста за типизиране показват: WCDPS и CCDPS могат значително да повишат експресията на OVA-специфично антитяло IgG след съвместна имунизация с OVA и ефектът е еквивалентен на алуминиев адювант; може значително да подобри експресията на OVA-специфично антитяло тип IgG2a и IgGl. Това показва, че полизахаридите от цистанхе усилват Th1 и Th2 имунния отговор едновременно и няма значителна разлика между WCDPS и CCDPS. Резултатите от типизирането на антитела IgG2a установиха, че коимунизиращата група с WCDPS и CCDPS и OVA може значително да подобри експресията на IgG2a в сравнение с групата с алуминиев адювант, алуминиевият адювант е по-слаб в насърчаването на Т клетъчната експресия, което доказва, че се използват WCDPS и CCDPS като адюванти Способността за насърчаване на клетъчния имунитет е значително по-висока от тази на алуминиевите адюванти.

Резултатите от откриването на лимфоцитна пролиферация чрез МТТ метода показват, че клетките на далака на мишки във всяка група са стимулирани от OVA. Индексът на стимулация (SI) на лимфоцитна пролиферация в WCDPS и CCDPS, комбинирани с OVA, беше значително по-висок от този в групата на имунизация само с OVA. OVA- Индексът на стимулация на групата с WCDPS 50 Ah и OVA-CCDPS 50 jig беше значително по-висок от този на групата с алуминиев адювант; това показва, че WCDPS и CCDPS, комбинирани с OVA групата, могат значително да увеличат пролиферацията на OVA-специфични лимфоцити в сравнение с OVA групата и групата с алуминиев адювант.

Има различни подгрупи Т-лимфоцити. CD3 е повърхностната молекула на всички Т лимфоцити. Според различните фенотипове те могат да бъдат разделени на CD8 плюс Т клетки и CD4 Т клетки. CD4 плюс молекулите могат да се образуват под действието на MHC fl молекули, които се използват главно като помощни (Th) клетки след активиране. Молекулите CD8 plus трябва да се образуват под действието на молекулите MHC I. След активиране те се превръщат в клетки убийци (TC или CTL), които играят важна роля в имунитета срещу вирусни инфекции и туморния имунитет. 3". Проточната цитометрия открива CD3PD4 плюс Т и CD3 плюс CD8 плюс Т клетъчна експресия, резултатите показват, че WCDPS и CCDPS могат значително да насърчат пролиферацията на CD4 плюс Т и CD8 плюс Т клетки в рамките на определен диапазон на дозата и няма значителни разлика между WCDPS и CCDPS при една и съща доза Комбинацията от CCDPS и OVA може да стимулира експресията на CD3 плюс CD4 плюс Т и CD3 плюс CD8 плюс Т клетки и двата ефекта са еквивалентни.

В обобщение, WCDPS и CCDPS са безопасни като адюванти. След като бъдат имунизирани с OVA, те могат едновременно да повишат специфичния хуморален имунитет и клетъчния имунитет. В сравнение с алуминиевите адюванти, WCDPS и CCDPS имат по-добър ефект върху подобряването на клетъчния имунитет и няма разлика в ефектите на подобряване на двата полизахарида от цистанхе. Тези резултати от изследване предоставят материални справки за изкуствено култивирани полизахариди от цистанхе в Синдзян като адюванти и също така предоставят материалната основа за скрининг на безопасни и ефективни имунни адюванти от пустинята Синдзянцистанче.

Препратки

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, et al. Имунен адювантен отговор на полизахариди от Atractylodis macrocephalus Koidz при пилета, ваксинирани срещу нюкасълска болест (ND) [J]. Carbohydr Polym, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. въглехидрати поп. 2016. 01.033.

[2] Li J, Wang X, Wang W и др. Водният екстракт от Pleurotus ferulate подобрява съзряването и функцията на дендритни клетки, получени от миши костен мозък чрез TLR4 сигнален път [J]. Vaccine, 2015, 33(16): 1923-1933. DOI: 10.1016/j. ваксина.2015.02. 063.

[3] Zhao H, Luo Y, Lu C, et al. Имунният отговор на чревната лигавица може да задейства имуномодулиращата активност на Ganoderma полизахарид при мишки [J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.