Cistanche за лечение на възпаление и бъбречно заболяване: каква е причината за патогенната роля на възпалението при бъбречно засягане при цистинопатия?
Mar 13, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com
Взаимодействието между галектин-3 и цистинозин разкрива патогенната роля на възпалението при засягане на бъбреците при цистиноза
Татяна Лобри1,2 и др
Възпалениеучаства в патогенезата на много заболявания. Основните механизми обаче често са неизвестни. Тук проверяваме далицистиноза, протеинът, участващ вцистиноза, е критичен регулатор на галектин-3, член на семейството на b-галактозидаза свързващи протеини, по време навъзпаление. цистинозае нарушение на лизозомното съхранение и въпреки повсеместното изразяване на цистиноза,бъбреке основният орган, засегнат от болестта.цистинозаустановено е, че подобрява лизозомната локализация и разграждането на галектин-3. В Ctns–/–мишки, модел на мишкацистиноза, галектин-3 е свръхекспресиран вбъбрек. Липсата на галектин-3 при цистинозни мишки подобрява патологичната бъбречна функция и структура и намалява инфилтрацията на макрофаги/моноцити в бъбрека на Ctns–/–Gal3–/–мишки в сравнение с Ctns–/– мишки. Тези данни категорично предполагат, че галектин-3 посредничивъзпалениеучаства вбъбрекпрогресия на заболяването при цистиноза. Освен това беше установено, че галектин-3 взаимодейства с провъзпалителния цитокин MonocyteChemoattractant Protein-1, който стимулира набирането на моноцити/макрофаги, и се оказа значително повишен в серума на Ctns–/– мишки а също и пациенти сцистиноза. По този начин нашите открития подчертават нова роля на взаимодействието на цистинозата и галектин-3 при възпаление и предоставят допълнително механично обяснение забъбрекзаболяване на цистиноза. Това може да доведе до отлагане на идентифицирането на нови лекарствени целицистинозапрогресия.
КЛЮЧОВИ ДУМИ:хронично бъбречно заболяване; цистиноза; галектин-3;възпаление; моноцит хемоатрактант протеин–1
cistanche може да лекува хронично бъбречно заболяване и цистиноза
Основната причина за възпалението е, че азотният оксид може да доведе до производството на възпалителни клетки.Цистанчее ценно китайско билково лекарство. Неговите активни съставки могат да инхибират секрецията на азотен оксид и да играят роля в предотвратяването и лечението на възпаления и бъбречни заболявания.
Преводна декларация
Въпреки лечението, пациентите все още прогресират до краен стадий на бъбречна недостатъчност. В това проучване ние показахме, че липсата нацистинозаводи до нарушено лизозомно разграждане на галектин-3 (Gal-3), което води довъзпалениеи прогресията нахронично бъбречно заболяваневцистиноза. Тези открития отварят нови перспективи за потенциални терапевтични цели, които биха могли да ограничат или забавят бъбречната дегенерация при пациенти сцистиноза. Като такива, противовъзпалителни лекарства и инхибитори на Gal-3 като нестероидни противовъзпалителни лекарства или индометацин могат да подобрят бъбречната патогенеза при цистиноза.
Възпалениее нормален остър отговор на организма към нараняване или инфекция,1но хрониченвъзпалениее свързано с увреждане на тъканите. В случай на хронични заболявания, като диабет, увредените тъкани активират имунната система, което води до продължителен възпалителен отговор и в крайна сметка до дегенерация на тъканите.2 Цитокините са ключови модулатори навъзпалениеи са способни да активират или разрешаватвъзпалениепроцес.3 При пациенти схронично бъбречно заболяване(CKD), повишена плазмена концентрация на цитокини (интерлевкин [IL]-6 и тумор некрозисфактор-a) ивъзпалениемаркери (С-реактивен протеин, IL-6, хиалуронан и неоптерин) са свързани с прогресия до краен стадий на бъбречно заболяване.4 Разбирането на специфичните медиатори, които предизвикват възпалителни реакции, улеснява откриването на подходящи лекарствени цели за предотвратяване на дегенеративни увреждания .
цистинозае автозомно-рецесивно метаболитно заболяване, което принадлежи към семейството на лизозомните нарушения на съхранението и се характеризира с натрупване на цистин във всички органи.5 Дефектният ген вцистиноза, CTNS, кодира лизозомния цистин/протонен ко-транспортер, цистиноза.6,7 Въпреки че CTNS се експресира повсеместно,бъбреке първият засегнат орган при лица сцистиноза. Пациентите обикновено се появяват през първата си година от живота със синдром на Fanconi, характеризиращ се с тежки водни и електролитни нарушения, слаб растеж и рахит.8Впоследствие се развива ХБН, която прогресира до краен стадий на бъбречно заболяване и изисквабъбректрансплантация. Натрупването на цистин във всички тъкани в крайна сметка води до мултиорганна дисфункция; пациентите изпитват фотофобия и слепота, хипотиреоидизъм, хипогонадизъм, диабет, миопатия и влошаване на централната нервна система.9 На фона на C57BL/6, нокаут модел на мишка (Ctns–/–) 10 възпроизвежда бъбречния фенотип на цистинозни пациенти,11 както и отлагане на цистинови кристали в роговицата12и дисфункция на щитовидната жлеза.13
В настоящото изследване разкриваме нова роля зацистинозаввъзпалениечрез взаимодействието си с Gal-3. Gal-3 е член на семейството на лектин и b-галактозид-свързващи протеини 21 и участва в множество биологични функции, включителновъзпаление.22В контекста набъбрекзаболявания, доказано е, че инхибирането на Gal-3 намалява експресията на провъзпалителни маркери и бъбречната фиброза и предотвратява намаляването на скоростта на гломерулна филтрация при модели на хипералдостеронизъм, хипертония или затлъстяване.23–26Тук предоставяме доказателства, че вцистиноза, липсата нацистинозаводи до свръхекспресия на Gal-3 вбъбреци, засилване на инфилтрацията на макрофагите и прогресията на ХБН. В допълнение, ние идентифицираме моноцитния хемоатрактантен протеин–1 (MCP-1) като потенциален медиатор, разкриващ нови генни мишени за лекарствена терапия. РЕЗУЛТАТИ Gal-3 взаимодейства с цистинозата чрез своя домейн за разпознаване на въглехидрати За идентифициране на специфично взаимодействие партньори, използващи количествена масова спектрометрия, кучета Madin-Darbyбъбрек(MDCK) клетките бяха трансдуцирани с лентивирусна конструкция за стабилна експресия на слетия протеин на цистиноза-зелен FL флуоресцентен протеин (GFP). В допълнение към 9-те субединици на вакуоларен тип Hþ аденозин трифосфатаза, публикувани по-рано,19Gal-3 беше идентифициран като един от протеините, взаимодействащи сцистиноза(Фигура 1а). Това взаимодействие беше допълнително потвърдено чрез ко-имунопреципитация, последвано от Western blotting (Фигура 1b и c). Освен това показахме, че взаимодействието между Gal-3 ицистинозасе медиира от домена за разпознаване на въглехидрати Gal-3 (CRD), локализиран в С-терминалната опашка на протеина. Взаимодействието се инхибира от тиодигалактозид, мощен инхибитор на взаимодействията галектин-въглехидрат (Фигура 1d). Подобно на всички галектини, Gal-3 има афинитет към гликозилирани протеини,21 така че е вероятно взаимодействието с Gal-3 да се осъществява чрез цистинозно гликозилираната част, разположена в интрализозомалната N-терминална опашка на протеина.27
Цистинозинът подобрява лизозомната локализация и разграждане на Gal-3
За да се провери потенциалната лизозомна локализация на Gal-3 при взаимодействие сцистиноза, ние показахме, че Gal-3, подобно на катепсин D (интрализозомна протеаза), е защитен от смилане от протеиназа К, докато и двата протеина се усвояват, когато лизозомите се пермеабилизират с Triton X- 100 (Фигура 2а и Допълнителна Фигура S1). Подобни данни са получени в лизозоми, изолирани от черен дроб на мишка, потвърждавайки лизозомната локализация на Gal-3 in vivo (Фигура 2b и c). Поради липсата на надеждно антитяло за откриванецистиноза, беше извършено имунооцветяване нацистиноза-GFP–експресиращи MDCK клетъчни линии с анти-Gal{1}} антитяло. Той потвърди наличието на Gal-3 в лумена на лизозомите, докато цистиноза-GFP и Lamp-2 (лизозомален трансмембранен протеин) бяха открити само в мембраната на везикулите (Фигура 2d).
Да проучи далицистинозине участвал в трафика на Gal-3, ние анализирахме динамиката и на дветецистинозаи Gal-3-позитивни везикули с помощта на двуцветна флуоресцентна микроскопия с общо вътрешно отражение на живи клетки FL в миши ембрионални фибробласти (MEF) от див тип (WT) и Ctns–/–мишки, експресиращи както CTNS-DsRed, така и Gal-3–GFP. Нашият анализ потвърди товацистинозаи Gal-3 претърпяват истинска колокализация в Ctns–/– MEFs, както е потвърдено от подобно пространствено-времево разпределение на тези молекули в зоната на флуоресцентна микроскопия на FL с пълно вътрешно отражение (Фигура 2e). Данните в WT MEFs бяха подобни (данните не са показани). Освен това, когато се анализират MEFs, трансфектирани само с Gal- 3-GFP, Gal-3-GFP се открива в цитоплазмата и не се наблюдава ясно изразена везикуларна структура, противно на ко-трансфекцията с CTNS-DsRed ( данните не са показани).
Тези данни бяха потвърдени в 293T клетки, в които се наблюдава силен GFP сигнал в цитоплазмата в клетки, експресиращи само Gal-3–GFP, докато в клетки, експресиращи както Gal-3–GFP, така ицистинозин-DsRed, Gal-3–GFP е локализиран главно в лизозоми, експресиращи цистиноза-DsRed (Фигура 3а). Освен това, количествено определяне на експресията на Gal-3 протеин в клетки, трансфектирани само с Gal-3–GFP или Gal- 3–GFP и CTNS-DsRed, и Gal-3–GFP и DsRed като контрола, показват значително по-малко Gal-3–GFP протеини в клетки, ко-трансфектирани с CTNS-DsRed, в сравнение с клетки, трансфектирани само с Gal-3-GFP или ко-трансфектирани с DsRed (Фигура 3b). Като цяло тези резултати предполагат, чецистинозинподобрява лизозомната локализация и разграждането на Gal-3. Показано е, че цистинозин участва в CMA.28 Протеинът на топлинен шок 70 kDa (Hsc70) участва в CMA чрез подпомагане на разгъването и транслокацията на субстратни протеини през мембраната в лизозомния лумен по LAMP2A-зависим начин.29,30 Тъй като Gal{ {8}} беше предложено да бъде разграден от CMA,31 ние изследвахме локализацията на Gal-3 спрямо Hsc70 в цистинозни MEFs. Конфокалният микроскопски анализ потвърди колокализацията на Gal-3–GFP при Hsc70- положителни структури както в WT (данните не са показани), така и в Ctns–/–клетки (Фигура 3в), поддържайки съвместния транспорт на Gal-3 с Hsc70 и предполагайки, че лизозомната интернализация, но не и разпознаването на Gal-3 от шаперона, е дефектна вцистиноза.
Gal-3 участва във възпалението на бъбреците при Ctns–/–мишки
За да проучите ролята на Gal-3 вцистинозаin vivo, ние генерирахме двоен нокаут модел на мишка с дефицит и на дветецистинозини Gal-3 (Ctns–/–момиче-3–/–мишки). WT, Ctns–/–и Гал-3–/–мишките бяха използвани като контролни субекти. В C57BL/6 Ctns–/–мишки, бъбречните аномалии се появяват около 10-месечна възраст.11 Следователно проучванията са проведени на 8 до 9 месеца, когатобъбрекзапочват да се откриват аномалии и на 12 до 15 месец, когато бъбречните аномалии прогресират. Тъй като е установено, че съдържанието на цистин е различно при мъжки и женски Ctns–/– бъбреци, те бяха анализирани поотделно. Ако съдържанието на цистин се увеличава с възрастта и в двата генотипа, не се наблюдава значителна разлика в мъжките и женските бъбреци между мишките Ctns–/– Gal-3–/– и Ctns–/– мишки на възраст от 8 до 9 месеца и от 12 до 15 месеца (Фигура 4а).
Бъбречната функция се оценява в серум и урина и не се наблюдава значима разлика между WT и Ctns–/–мишки на 8 до 9 месеца (данните не са показани), но на 12 до 15 месеца, Ctns–/–мишки показват значително по-високи нива на серумен креатинин и урея в сравнение с WT мишки. Интересното е, че Ctns–/–момиче-3–/–мишки показват подобрена бъбречна функция в сравнение с Ctns–/–мишки на 12 до 15 месеца, с по-нисък серумен креатинин (P <{2}}.05) и урея (P <0,05; Таблица 1).
Хистологични изследвания на мишки на възраст от 8- до 9- месеца и от 12- до 15- месецабъбрексрезове разкриха наличието на тежки аномалии в Ctns–/– бъбреци, включително тубулна атрофия, ретрахирани гломерули и мононуклеарни инфилтрати. Слепият анализ на бъбречни срезове варира степента на кортикално увреждане от 1 (запазена тъканна структура) до 6. Средният резултат за Ctns–/–мишки е 2.64 - 0.36 на възраст 9 месеца (n=7) и 4.12 0.37 на възраст от 12 до 15 месеца (n=16). В бъбреците на Ctns–/–момиче-3–/–мишки на същата възраст, тези аномалии са значително по-малко обширни: 1.62 - 0.11 на 9 месеца (n=21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" тест)="" и="" 3.04="" -="" 0.22="" на="" 12="" до="" 15="" месеца="" (n="33;" p=""><0,05, t-тест="" на="" mann-whitney)="" (фигура="" 4b="" и="" допълнителна="" фигура="" s2).="" освен="" това,="" процент="" на="" тубулна="" атрофия="" беше="" определен="" за="" всяка="" тъкан="" и="" средната="" стойност="" за="">–/–мишки и Ctns–/–момиче-3–/–мишките са съответно 66 процента и 42 процента на 12 до 15 месеца (P=0.01). Освен това, забележителна разлика между Ctns–/–и Ctns–/– момиче-3–/– бъбрексрезове беше наличието на малко мононуклеарни инфилтрати в Ctns–/–момиче-3–/–участъци, докато тежки инфилтрати се наблюдават постоянно в Ctns–/– бъбрек(Фигура 4b).
Ние характеризирахме мононуклеарните инфилтрати, наблюдавани чрез хистологично изследване при Ctns на възраст от 8- до 9- месеца–/– бъбрецикато макрофаги/моноцити чрез съвместно имунооцветяване с CD68 и CD45 и с CD68 и основен клас на хистосъвместимост II (допълнителна фигура S3), но не и с CD68 и CD163, което предполага, че тези макрофаги имат провъзпалителен профил, подобен на M1-.32 ,33 Количественото определяне на CD68- положителните клетки разкри значително по-малко макрофаги/моноцити в WT, Gal-3–/–и Ctns–/–момиче-3–/– бъбрецив сравнение с Ctns–/– бъбреци(Фигура 4c), потвърждавайки хистологичните данни (Фигура 4b).
Като цяло тези открития предполагат, че Gal-3 участва в набирането на макрофаги/моноцити в цистинозниябъбреции че липсата му облекчава бъбречните заболявания при Ctns–/–мишки. Следователно това предполага, чевъзпалениее отговорен, поне отчасти, за влошаването на бъбреците при Ctns–/– мишки.
Бъбреците с дефицит на Ctns показват свръхекспресия на Gal-3
С помощта на Western blot анализ открихме, че експресията на Gal-3 е значително повишена вбъбрецина 12--месечен Ctns–/–мишки в сравнение с WT мишки (Фигура 5а и b). За да се изследва дали тази повишена експресия на Gal-3 е специфична за Ctns–/– бъбреци, количествено определихме експресията на Gal-3 на нивата на транскрипта и протеина вбъбрециот мишки с ХБН, предизвикана от стандартна междинна 2-етапна операция на нефректомия и от животни, които са претърпели фиктивна операция. WT и Ctns–/–мишките бяха използвани като контролни субекти. Транскриптите на Gal-3 са значително повишени при Ctns–/– и фалшиви бъбреци, но силно увеличени при ХБНбъбрецив сравнение с WT мишки (Фигура 5в). Обратно, на ниво протеин, Gal-3 беше открит само в Ctns–/–бъбреци, което силно предполага, че само Ctns–/–бъбреците не са успели да разградят протеин Gal-3 (Фигура 5d). Имунофлуоресцентно оцветяване на Gal-3 в мишкабъбрекна 8 до 9 месеца също демонстрира свръхекспресия на Gal-3 в Ctns–/– бъбрецив сравнение с WTбъбреци(Фигура 5д). Освен това Gal-3 се експресира от CD68þ макрофаги, както и от бъбречни клетки в Ctns–/– бъбрецина 8 до 9 месеца (допълнителна фигура S4). Като цяло тези данни са в съответствие с намаленото разграждане на Gal-3 в отсъствието нацистинозакакто е демонстрирано in vitro (Фигура 3a и b), което води до натрупване на протеин Gal-3 в Ctns–/– бъбреци.
Липсата на цистинозин води до повишен серумен MCP-1 чрез Gal-3 регулация
Гал-3 регулиравъзпалениечрез различни механизми.34 По този начин, за да придобием по-нататъшна представа за механизма вцистиноза, ние изследвахме експресията на различни провъзпалителни или противовъзпалителни цитокини в серума на 12- до 15-месечни WT, Ctns–/–, Гал-3–/–и Ctns–/–момиче- 3–/–мишки. Шест нива на цитокини бяха измерени чрез масив от миши цитометрични зърна, MCP-1, интерферон-g, фактор на туморна некроза и IL-10, IL-6 и IL-12p70. Само експресията на MCP-1 е значително повишена в серума на Ctns–/– мишки в сравнение с WT и Gal-3–/– мишки, а също и с Ctns–/–момиче-3–/–мишки, чиито серумни нива на MCP-1 са сравними с WT мишки (Фигура 6а). MCP-1 се произвежда от различни типове клетки, като основният източник на MCP-1 са макрофагите и моноцитите,35 и действа като хемоатрактант за моноцитите и макрофагите, регулирайки тяхната миграция и инфилтрация. Обратно, на същата възраст беше установено, че експресията на Gal-3 е сходна в серума на Ctns–/– мишки (44,33 9,81 ng/ml; n=5) и WT мишки (40.{{12} }.41 ng/ml; n=7).
Връзката между Gal-3 и MCP-1 беше допълнително изследвана чрез съвместна имунопреципитация с помощта на Gal-3–GFP и MCP-1–DsRed– или Gal-3– GFP и CTNS-DsRed– (като положителна контрола), експресиращи 293T клетки. Беше наблюдавано взаимодействие между Gal-3 и MCP-1 (Фигура 6b), което предполага директно индуциране на MCP-1 от Gal-3. Инкубирането с N-ацетил-D-лактозамин (LacNAc), инхибитор на Gal-3 CRD, показа, че за разлика отцистинозинвзаимодействие, CRD не участва във взаимодействието между Gal-3 и MCP-1 (Фигура 6в).
За да преценим дали това откритие е приложимо при хора, ние измерихме нивата на Gal-3 и MCP-1 при пациенти сцистинозакоито не са били подложени на имуносупресивна терапия или приемали противовъзпалителни лекарства. Въпреки че беше установено, че нивото на Gal-3 е леко повишено в серума на пациенти с цистиноза в сравнение със здрави донори, разликата не е значителна (Фигура 6e), потвърждавайки нашите резултати, получени в Ctns–/–мишки. Само 2 пациенти са имали високо ниво на Gal-3 (25,34 и 39,54 ng/ml); те бяха считани за извънредни стойности и следователно не бяха включени във Фигура 6e. Обратно, при използване на ензимно-свързан имуносорбентен анализ, насочен срещу човешки MCP-1 (Фигура 6d), беше установено, че серумните нива на MCP-1 са значително повишени при пациенти сцистиноза(252.1 - 18.4 pg/ml; n=19; възрастов диапазон 1–23 години) въпреки лечението с цистеамин в сравнение със здрави контролни субекти (166.9 -13.5 pg/ml; n=1). 0; възрастов диапазон 8–63 години) (P <0,001). не="" е="" открита="" корелация="" между="" възрастта="" и="" нивото="" на="" mcp-="" 1="" и="" при="" двамата="" пациенти="">цистинозаи здрави донори (данните не са показани).
ЦистанчеимапротивовъзпалителноИмоти
ДИСКУСИЯ
Въпреки факта, че цистинът се натрупва във всички тъкани при пациенти, засегнати отцистиноза, бъбреците са органите, които са най-уязвими към увреждане. Следователно ние вярваме, че натрупването на цистин не е единствено отговорно за бъбречната дегенерация. Тук описваме нова роля зацистинозинв регулацията навъзпалениеучастващи в прогресирането на хронично бъбречно заболяване прицистиноза. Това проучване може да обясни защо пациентите се развиват до краен стадий на бъбречна недостатъчност, въпреки че са подложени на терапия с цистеамин.
Изследването на молекулярните партньори на цистинозата разкрива директно взаимодействие с Gal-3, което може да бъде инхибирано от инхибитори на Gal-3 CRD. Скорошни проучвания показват, че Gal-3 може да взаимодейства с гликани, разположени в лизозомния лумен след лизозомно увреждане като натрупване на кристали.36 В нашето проучване взаимодействието между Gal-3 ицистинозине изследван в здрави клетки, експресиращицистинозини следователно не натрупване на цистеин или цистинови кристали. В допълнение, свръхекспресията както на Gal-3, така и на цистинозин в здрави клетки модифицира субклетъчната локализация на Gal-3, която след това се локализира в лизозомите, в сравнение със свръхекспресията само на Gal-3, която се намираше в цитоплазмата. Тези резултати силно предполагат, че взаимодействието между Gal-3 и цистинозин се осъществява независимо от лизозомното увреждане и че цистинозинът е активно отговорен за лизозомната локализация на Gal-3. По-рано беше показано, че Gal-3 се разгражда чрез лизозомно-зависима протеолиза в отсъствие на Abl и Arg, 2 тирозин кинази.31
Освен това показахме товацистинозаи Gal-3 се локализират съвместно в динамични везикуларни структури и заедно са мобилизирани по пространствено-времеви начин.Цистинозинпреди това се свързва с механизмите за трафик на лизозомния LAMP2A, единственият известен CMA рецептор, който е неправилно локализиран вцистиноза.28По-рано беше показано, че разграждането на Gal-3 се медиира от CMA.31Анализът с конфокална микроскопия потвърди колокализацията на Gal-3 при Hsc70-позитивни структури и в двете Ctns–/– и WT клетки, поддържащи съвместния транспорт на Gal-3 с Hsc70 за представяне в лизозомата и разграждане от CMA, тъй като Hsc70 подпомага транслокацията на субстратни протеини през мембраната в лизозомния лумен.29,30Възможна интерпретация на нашите резултати е, чецистинозинрегулира трафика и доставянето на Gal-3 до CMA-активните лизозоми за разграждане.
Този нов път нацистинозин-зависимата лизозомна локализация и разграждане на Gal-3 се поддържа in vivo, тъй като Ctns-дефицитни мишки проявяват свръхекспресия на Gal-3 в рамките набъбрек. Освен това, докато повишената иРНК на Gal-3 е ограничена в Ctns–/–бъбреци в сравнение с друг модел на ХБН, голямо количество протеин Gal-3 беше открито само в Ctns–/– бъбреци. Тези данни категорично подкрепят заключението, чецистинозинучаства в разграждането на Gal-3 протеин, който може да контролира свръхекспресията на Gal-3 иРНК при стресови състояния като ХБН.
Gal-3 има няколко биологични роли, включително роли при остри и хронични заболяваниявъзпалениечрез привличане на моноцити и макрофаги.37,38В Ctns–/– мишки, наблюдавахме тежки мононуклеарни инфилтрати главно вбъбреккакто е описано по-горе,11,39които се характеризират като моноцити/макрофаги. За разлика от тях, бъбреците от двойния нокаут Ctns–/–момиче-3–/–мишките показват много малко инфилтрати на моноцити/макрофаги, което силно предполага, че Gal-3 участва ввъзпалениев бъбреците на Ctns–/–мишки. В контекста на повтарящо се увреждане на тъканите Gal-3 може да предизвика преход към хроничновъзпалениеи фиброза.34В съответствие с тези констатации нашите данни демонстрират участието на Gal-3 в прогресирането на ХБН прицистиноза. Наистина двойният нокаут Ctns–/– момиче-3–/–мишките се представиха по-добребъбрекфункция и структура в сравнение с Ctns–/–мишки. По подобен начин мишките с дефицит на Gal-3 проявяват по-малко бъбречна фиброза вбъбрекв сравнение с WT мишки след едностранна уретерна обструкция,40 и Gal-3 нокаут мишки, подложени на исхемично-реперфузионно увреждане, имат по-добра бъбречна функция в сравнение с WT мишки, подложени на исхемично-реперфузионно увреждане.41
Въпреки че е установена корелация между нивата на Gal-3 в плазмата и развитието на ХБН,42 не е наблюдавана разлика в експресията на Gal-3 в серума на мишки и хора, засегнати отцистинозаи здрави контролни субекти. Чрез измерване на различни нива на цитокини в серума открихме значително увеличение на MCP-1 в Ctns–/–мишки, докато Ctns–/–момиче-3–/–мишките имат нива, сравними с тези на WT мишки. MCP-1 е цитокин, който може да бъде освободен в серума и образува градиент за привличане на моноцити и макрофаги към мястото на нараняване.35 Повишаването на MCP-1 в серума на Ctns–/–мишки в сравнение с Ctns–/–момиче-3–/–мишки е независим от натрупването на цистин, защотобъбрексъдържанието на цистин е сходно и при двата генотипа. Освен това, въпреки лечението с цистеамин, което позволява излизането на цистин от лизозомите, е установено, че MCP-1 е значително повишен в серумите на пациенти сцистинозав сравнение със здрави донори. Тези данни категорично предполагат, че липсата нацистинозин, а не натрупването на цистин, е отговорен за повишаването на MCP-1 в серума. В допълнение, ние показахме директно взаимодействие между Gal-3 и MCP-1, което наскоро беше предложено от Gordon-Alonso et al.43, но не беше проучено повече. Механизмът на Gal-3-медиирано MCP-1 активиране не е изследван тук. Хипотеза е наличието на сигнален пептид в човешкия MCP-1, който може да бъде разцепен, за да се подобри неговата секреция.44 Освен това плазминът може да разцепи С-края на MCP-1, което увеличава неговия хемоатрактант В допълнение, в съответствие с нашите данни, инхибирането на MCP-1 в миши модел на диабетна нефропатия предотвратява инфилтрацията на бъбречните макрофаги и подобрява бъбречната функция.46,47 Вцистиноза, нашите данни категорично предполагат, че липсата нацистинозинводи до увеличаване на Gal-3, което активира мобилизацията на MCP-1 кръвта, подобрявайки бъбречнатавъзпалениеи прогресията нахронично бъбречно заболяване.
Тези открития отварят нови перспективи за потенциални терапевтични цели, които биха могли да ограничат или забавят бъбречната дегенерация при пациенти сцистиноза. В действителност е установено, че нестероидни противовъзпалителни лекарства като аспирин и индометацин инхибират експресията на Gal-3 чрез инхибиране на неговата транскрипция.48 Индометацинът всъщност се използва за регулиране на полиурията и полидипсията прицистиноза,49 и скорошно проучване на 307 европейски пациенти с цистиноза показва подобрен бъбречен резултат при пациенти, лекувани с индометацин.50 В светлината на нашето проучване, употребата на индометацин или нестероидни противовъзпалителни лекарства зацистинозапациентите могат да бъдат преразгледани.
МЕТОДИ
Експерименти с животни
C57BL/6 Ctns–/–мишки са предоставени от д-р Antignac (Inserm U1163, Париж, Франция). C57BL/6 галектин-3 нула (Gal-3–/–) мишки са предоставени от д-р Fu-Tong Liu (Университет на Калифорния, Дейвис) и д-р Джеролд М. Олефски (Университет на Калифорния, Сан Диего). Стратегията за размножаване за генериране на WT, Ctns–/–, Гал-3–/–, Ctns–/– и Gal- 3–/–мишки е описано в Допълнителни методи.
Клетъчни линии
бъркотията е генерирана от новородени кожни биопсии на WT и Ctns–/–мишки. Клетъчни линии MEF, 293T и MDCK тип II (ATCC, Manassas, VA) се отглеждат в модифицирана среда на Eagle на Dulbecco, съдържаща 10 процента фетален телешки серум или фетален говежди серум, 100 единици/ml пеницилин, 0,1 mg/ml стрептомицин и 2 mM L-глутамин.
Коимунопреципитация и масспектрометричен анализ
За да се изследват взаимодействията протеин-протеин, MDCK клетките се трансдуцират с помощта на лентивирусен pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE векторен скелет за стабилна експресияцистинозин-GFP.51Ко-имунопреципитацията се извършва, както е описано в Допълнителни методи. Ко-имунопреципитираните протеини се разделят чрез електрофореза с натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) и се анализират чрез масспектрометрия, LTQ Orbitrap, както вече беше описано.19
293T клетки, експресиращи Gal-3–GFP и MCP-1–DsRed или Gal-3–GFP и CTNS-DsRed, бяха използвани за ко-имунопреципитация, както е описано в Допълнителни методи. Коимунопреципитираните протеини бяха разделени чрез SDS-PAGE и Gal-3-свързващият MCP-1 беше открит с помощта на анти-DsRed антитяло (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).
Субклетъчно фракциониране
Осем черния дроб бяха получени от C57BL/6 мишки и приготвени, както е описано по-горе.52 Условията на градиента бяха по същество същите като описаните в оригиналната публикация,52 с изключение на това, че Nycodenz беше използван вместо метризамид.
Лечение с Gal-3–инхибитор и протеиназа К
Лизати отцистинозин-GFP MDCK клетки и 293T, експресиращи Gal-3–GFP и CTNS-DsRed или Gal-3–GFP и MCP-1–DsRed се инкубират с или без 5 mM тиодигалактозид или 5 mM N -Ацетил-D-лактозамин, съответно, 2 инхибитора на Gal-3 CRD. След 30 минути инкубиране при 4 - С с постоянно разклащане, лизатите се инкубират с 50 ml анти-GFP микрозърна и се извършва имунопреципитация, както е споменато по-горе. Утаените протеини се разделят чрез SDS-PAGE върху 10% гел.
Лизати отцистинозин-GFP MDCK клетки и фракции, обогатени с лизозома от черен дроб на мишка, се инкубират с или без 2 процента Triton X-100 за 10 минути при 4 - C и след това се инкубират 30 минути със или без 2,5 mg/ml и 25 mg /ml протеиназа К, съответно. След инактивиране на ензима с 1 тМ фенилметилсулфонил флуорид в продължение на 5 минути при 4 - С, протеините се разделят чрез SDS-PAGE върху 10% гел.
Имунофлуоресцентен анализ
Фиксирани MDCK клетки се инкубират с анти-Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) и анти-Gal-3 антитяло (CedarlaneLaboratories, Бърлингтън, Онтарио, Канада) 2 часа при стайна температура, последвано от Alexa Fluor 555 вторично антитяло (Invitrogen, Carlsbad, CA) за 1 час при стайна температура. Конфокалните изображения са направени с помощта на микроскоп Zeiss LSM 700 (Carl ZeissMicroscopy, Йена, Германия).
293T клетки, временно експресиращи само Gal-3–GFP, Gal-3–GFP и DsRed или Gal-3–GFP ицистинозин-DsRed бяха култивирани върху покривно стъкло, преди да бъдат монтирани върху предметно стъкло. Клетките бяха изобразени с помощта на инструмент Keyence BZ-X700 (Keyence Corp., Осака, Япония).
Фиксиранбъбрексрезовете се инкубират за една нощ при 4 - C с анти-CD68 (BioLegend, Сан Диего, Калифорния) или анти-Gal-3 антитяло (BioLegend), последвано от Alexa Fluor 488 вторично антитяло (Invitrogen), 1 час при стайна температура. Изображенията са получени с помощта на инструмент Keyence BZ-X700. Количественото определяне на експресията на CD68 е описано в допълнителните методи.
MEFs, експресиращи Gal-3-GFP, бяха оцветени с помощта на анти-Hsc70 антитяло (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) и изобразени, както е описано по-горе.53
FL флуоресцентна микроскопия с пълно вътрешно отражение
WT и Ctns–/–MEF, експресиращ Gal-3–GFP, и CTNS-DsRed бяха посяти върху 4-камерна 35- mm боросиликатна дънна чиния (Cellvis, Mountain View, CA). След 2 дни в култура, MEFs бяха анализирани чрез FL флуоресцентна микроскопия с пълно вътрешно отражение, както е описано по-горе54и в Допълнителни методи. Изображенията бяха анализирани с помощта на софтуера ImageJ.
Gal-3 анализ на израза
293T клетки, експресиращи Gal-3–GFP, Gal-3–GFP и DsRed, или Gal-3–GFP и CTNS-DsRed и експлантиранибъбрецибяха лизирани в буфер за радиоимунопреципитационен анализ, съдържащ протеиназен инхибиторен коктейл. Протеините бяха разделени на 4 процента до 15 процента гел и разкрити с помощта на анти-Gal-3 (Abcam, Cambridge, UK) или анти-глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) антитяло .
Бъбрецибяха хомогенизирани в RLT буфер, съдържащ b-меркаптоетанол, използвайки Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Франция). Беше изолирана РНК и Gal-3–специфична капкова дигитална полимеразна верижна реакция беше извършена, както е описано в Допълнителни методи. Експресията на Gal-3 транскрипт се изразява като съотношение в сравнение с ендогенната контрола 18S. Използван е ензимно-свързан имуносорбентен анализ (Abcam) за откриване на нивото на Gal-3 в мишки и човешки серуми, съгласно инструкциите на производителя.
Бъбречна функция
Нивата на фосфат в серума и урината, серумен креатинин и урея бяха оценени с помощта на комплекта QuantiChrom Phosphate Assay Kit, Quanti Chrom Creatinine Kit и QuantiChrom Urea Assay Kit (BioassaySystems, Hayward, CA). Нивата на протеин в урината бяха измерени с помощта на Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL).
Хистология
По времето, когато мишките бяха убити,бъбрецибяха събрани, фиксирани във формалин и поставени в парафин. Секциите, оцветени с хематоксилин и еозин, бяха прегледани на сляпо от д-р Мари Клер Гублер, както е описано в Допълнителните методи.
Измерване на съдържанието на цистин
Измерването на тъканния цистин се извършва чрез масспектрометрия (LC-ESI-MS/MS), както е описано по-горе.39
Стандартна нефректомия и фиктивна операция
ХБН при мишки се индуцира от стандартната междинна 2-операция на нефректомия, както е описано по-горе.55,56Фиктивната група мишки претърпя същата процедура, но без да се режатбъбректъкан.
Ниво на цитокини в серума
За измерване на нивата на цитокини в миши серум, мишкавъзпалениекомплект цитометрични гранули (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния) се извършва съгласно инструкциите на производителя. Концентрацията на MCP-1 в човешки серум се определя с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ, насочен срещу MCP-1 (Abcam, Cambridge, UK) съгласно инструкциите на производителя.
Статистически анализ
Стойностите са изразени като средни - SEM. Значимостта на резултата беше оценена чрез несдвоен 2-опашен t-тест или несдвоен 2-опашен t-тест с корекцията на Welch. Бяха направени групови сравнения на 3 или повече условия с параметрични анализи на дисперсията, последвани от тест за множество сравнения на Tukey за сравнения по двойки. Хистологичните резултати бяха сравнени с помощта на теста на Mann-Whitney. Анализите бяха извършени с помощта на софтуера Prism 6 (GraphPad, Сан Диего, Калифорния). P-стойност по-малка от 0.05 се счита за значима.
Одобрение на изследването
Експериментите с мишки бяха проведени в съответствие с протоколите на InstitutionalAnimal Use Committee. Използването на човешка тъкан в това проучване е одобрено от Калифорнийския университет в Сан Диего, Програма за защита на човешките изследвания.
РАЗКРИВАНЕ
SC е член на научния съвет и член на настоятелството нацистинозаИзследователска фондация. SC е съосновател, акционер и член както на научния съвет, така и на борда на директорите на GenStem TherapeuticsInc. Условията на това споразумение са прегледани и одобрени от Калифорнийския университет в Сан Диего в съответствие с неговите политики за конфликт на интереси. Всички останали автори декларираха липса на конкурентни интереси.
предоставяне на Gal-3–/–мишки. Благодарим на Lou Devanneaux и NicholeFlerchinger за тяхната техническа помощ и на Elizabeth Souter за прегледа на ръкописа. Благодарим на Кристофър Алфонсо от BDBioscience за предоставянето на мишкатавъзпалениемасив от цитометрични перли и за неговата помощ при тълкуването на резултатите. Тази работа беше подкрепена от субсидии на Националния институт по здравеопазване RO1-DK090058 и R01-DK110162,цистинозаИзследователска фондация и Калифорнийския институт по регенеративна медицина (CIRM, CLIN-09230). TL се подкрепя от стипендия за висшисти от Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB и JZ се подкрепят от стипендия отцистинозаИзследователска фондация. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility беше финансиран от грант P30-NS047101 на Националния институт за неврологични заболявания и инсулт (NINDS).
ПРЕПРАТКИ
1. Меджитов Р. Произход и физиологични роли навъзпаление. Природата. 2008; 454: 428-435.
2. Донат MY. Насочваневъзпалениепри лечението на диабет тип 2. Диабет Обес Метаб. 2013; 15 (допълнение 3): 193–196.
3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Цитокини в синдрома на системния възпалителен отговор: преглед. HSR Proc интензивно лечение за сърдечно-съдова анестезия. 2010; 2: 161-175.
4. Pecoits-Filho R, Heimburger O, Barany P, et al. Асоциации между циркулиращите възпалителни маркери и остатъчната бъбречна функция при пациенти с ХБН. съм ДжБъбрекдис. 2003; 41: 1212-1218.
5. Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.цистиноза. N Engl J Med. 2002; 347: 111–121.
6.Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. Насочването нацистинозинкъм лизозомната мембрана изисква сигнал на базата на тирозин и нов сортиращ мотив. J Biol Chem. 2001; 276: 13314–13321.
7. Калацис V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.Цистинозин, протеинът дефектен вцистиноза, е H()-задвижван лизозомален цистин транспортер. EMBO J. 2001; 20: 5940–5949.
8. Cherqui S, Courtoy PJ. Бъбречният синдром на Фанкони вцистиноза: патогенни прозрения и терапевтични перспективи. Nat Rev Nephrol. 2017; 13: 115-131.
9. Нестерова G, Gahl W. Нефропатиченцистиноза: късни усложнения на мултисистемно заболяване. Педиатр Нефрол. 2008;23:863–878.
10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, et al. Липсва интрализозомно натрупване на цистин при мишкицистинозин, протеинът дефектен вцистиноза. Mol Cell Biol. 2002; 22: 7622-7632.
11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, et al. Бъбречният фенотип нацистинозамоделът на мишката зависи от генетичния произход. Трансплантация на Nephrol Dial. 2010; 25: 1059-1066.
12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, et al. Очните аномалии в aцистинозаживотински модел, имитиращ болестна патогенеза. Pediatr Res. 2007; 62: 156-162.
13. Ръководство Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. Миши модел предполага два механизма за промени в щитовидната жлеза при инфантилницистиноза: намален синтез на тиреоглобулин поради стрес на ендоплазмения ретикулум/отговор на разгънат протеин и нарушена лизозомна обработка. Ендокринология. 2015; 156: 2349–2362.
14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, et al. Терапията с цистеамин забавя прогресията на нефропатиятацистинозапри късни юноши и възрастни.БъбрекВътр. 2012; 81: 179–189.
15. Cherqui S. Cysteamine терапия: лечение зацистиноза, а не лек.БъбрекВътр. 2012; 81: 127-129.
16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Нефропатиченцистинозапри възрастни: естествена история и ефекти от пероралната терапия с цистеамин. Ann Intern Med. 2007; 147: 242-250.
17. Cherqui S, Courtoy PJ. Бъбречният синдром на Фанкони вцистиноза: патогенни прозрения и терапевтични перспективи. Nat Rev Nephrol. 2017; 13: 115-131.
18. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Нарушаването на медиираната от шаперон аутофагия води до селективни дефекти на лизозомното разграждане при болестта на лизозомното съхранениецистиноза. EMBO Mol Med. 2015; 7: 158-174.
19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.Цистинозине компонент на вакуоларния Н-АТР-аза-регулатор-раг комплекс, контролиращ мишената на бозайника на сигнализирането на рапамицин комплекс 1. J Am Soc Nephrol. 2016; 27: 1678–1688.
20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, et al. Активирането на транскрипционния фактор EB спасява лизозомни аномалии при цистинозабъбрекклетки.БъбрекВътр. 2016; 89: 862–873.
21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: история с отворен край. Biochim Biophys Acta. 2006; 1760: 616-635.
22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Галектин-3: една молекула за азбука от болести, от А до Я. Int J Mol Sci. 2018; 19 (2).
23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M, et al. Влиянието на инхибирането на галектин-3 върху предизвикани от алдостерон сърдечни и бъбречни увреждания. JACC Сърдечна недостатъчност. 2015; 3: 59-67.
24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR, et al. Фармакологичното инхибиране на галектин-3 предпазва от хипертонична нефропатия. Am J Physiol Renal Physiol. 2015; 308: F500–F509.
25. Kolatsi-Joannou M, Price KL, Winyard PJ, Long DA. Модифицираният цитрусов пектин намалява експресията на галектин-3 и тежестта на заболяването при експериментално остробъбрекнараняване. PloS One. 2011;6:e18683.
26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. Блокадата на галектин-3 намалява бъбречната фиброза в два нормотензивни експериментални модела на бъбречно увреждане. PloS One. 2016;11:e0166272.
27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C, et al. Въздействие нацистинозагликозилиране върху стабилността на протеина чрез диференциално динамично маркиране на стабилен изотоп чрез аминокиселини в клетъчна култура (SILAC). Mol клетъчна протеомика. 2017; 16: 457-468.
28. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Нарушаването на медиираната от шаперон аутофагия води до селективни дефекти на лизозомното разграждане при болестта на лизозомното съхранениецистиноза. EMBO Mol Med. 2015; 7: 158-174.
29. Majeski AE, Dice JF. Механизми на аутофагия, медиирана от шаперон. Int J Biochem Cell Biol. 2004; 36: 2435-2444.
30. Xie W, Zhang L, Jiao H, et al. шаперон-медиираната аутофагия предотвратява апоптозата чрез разграждане на BBC3/PUMA. Автофагия. 2015; 11: 1623–1635.
31. Li X, Ma Q, Wang J, et al. c-Abl и Arg тирозин киназите регулират лизозомното разграждане на онкопротеина галектин-3. Клетъчна смърт Разл. 2010; 17: 1277-1287.
32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A, et al. Преобладаването на M2-поляризирани макрофаги при рак на пикочния мехур засяга ангиогенезата, степента на тумора и инвазивността. Oncol Lett. 2016; 11: 3403-3408.
33.Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Много повече от M1 и M2 макрофаги, има и CD169() и TCR() макрофаги. Преден имунол. 2015; 6: 263.
34. Henderson NC, Sethi T. Регулирането навъзпалениеот galectin-3. Immunologic Rev. 2009; 230: 160–171.
35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Моноцитен хемоатрактантен протеин -1 (MCP-1): общ преглед. J Interferon Cytokine Res. 2009; 29: 313-326.
36.Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. Задействаното набиране на ESCRT машини насърчава ендолизозомния ремонт. Наука. 2018;360(6384).
37. MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, et al. Регулиране на алтернативно активиране на макрофаги от галектин-3. J Immunol. 2008; 180: 2650–2658.
38. Sano H, Hsu DK, Yu L, et al. Човешкият галектин-3 е нов хемоатрактант за моноцити и макрофаги. J Immunol. 2000; 165: 2156-2164.
