Избелваща активност на съставките, изолирани от пулпата на Trichosanthes

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Rongchao Zhang, 1, 2 Xiuqin Hu, 1 Bo Zhang, 1 ZhenWang, 1 Chunxiang Hao, 1 Jie Xin, 1 и Qingmei Guo 2

Резюме: ИзбелванетоПазарът на козметика има светло бъдеще и чистите натурални избелващи продукти на традиционната китайска медицина винаги са били изследователска гореща точка. В това изследване, избелващата активна съставка на китайската медицина Trichosanthes пулпа е изолирана и пречистена за първи път и нейнатаизбелванемеханизмът беше изяснен. За изолирането и пречистването им бяха използвани хроматографски методи като силикагел, ODS и HPLC. B16 клетки бяха използвани за измерване на антиоксидантната активност,тирозиназаактивност и активност за отстраняване на меланин. Бяха изолирани общо 20 съединения, включително р-хидроксибензалдехид (1), салицилова киселина (2), ванилова киселина (3), изованилинова киселина (4), протокатехуат (5), транс-канелена киселина (6), {{9 }}кумарова киселина (7), транс-ферулова киселина (8), дрекслерол-В (9), циклохексанол 3-палмитат (10), 5-ацетоксиметил-2-фуралдехид (11), 5-хидроксиметилфурфурал (12), диосметин (13), апигенин (14), хризоберил (15), лутеолин (16), 4′-хидроксискутеларин (17), кверцетин (18), 3′,{{31} }дихидрокси-7-(-D-глюкопиранозилокси)-4′-метокси флавон (19) и ципрофлоксацин-7-O- -D-глюкозид (20). Сред тях съединения 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 имат добри антиоксидантни възстановяващи ефекти; съединения 3, 4, 5, 6 и 7 имат високо черно инхибиране; съединения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 имат очевидна инхибиторна активност на тирозиноксидазата. Резултатите от 1e поставиха основата за по-нататъшното развитие и използване на ресурсите от пулпа на Trichosanthes и също така предоставят основа за развитието на естествениизбелванекозметика.

Cistanche herbaеестествена избелваща съставка.

1. Въведение

Trichosanthes kirilowii Maxim. е многогодишна увивна трева от семейство Тиквови. Плодовете, семената, кората и корените му обикновено се използват като традиционни китайски лекарства. За дълго време пулпата на Trichosanthes често се изхвърля при производството и обработката на сперма Trichosanthis и Pericarpium Trichosanthis, което води до значителни отпадъци. Понастоящем докладите за пулпата на Trichosanthes са фокусирани главно върху сравнението на съдържанието на захар, аминокиселини, витамини и други хранителни вещества [1–4]. Няма доклад за химическия състав на пулпата на Trichosanthes. Ето защо е необходимо систематично да се изследват химическите съставки на целулозата.

В същото време, с бързото развитие на икономиката, козметиката не само е продукт с висока консумация на начин на живот, но и се превръща в най-популярната „необходимост“ за жените. Много книги за класическа китайска медицина или materialmedica са записали, че пулпата на Trichosanthes има функцията наизбелванеи ефекти за премахване на бръчките [5–7]. Предишни резултати от нашата изследователска група показват, че водният екстракт от пулпата на Trichosanthes е по-високтирозиназаинхибиторна активност и степента на инхибиране на тирозиназата е около 70 процента. 1ecommonизбелванеагенти витамин С (VC) и арбутин бяха използвани като контролни вещества [8]. Предварително е доказано, че екстрактът от пулпа на Trichosanthes има известен избелващ ефект чрез инхибиране на активността на тирозиназата. Ето защо е от голямо значение да се изследват химическите съставки и механизмът на избелване на пулпата на Trichosanthes.

TheизбелванеМеханизмът може да се обобщи като инхибиране на синтеза на меланин и ускоряване на преноса на меланин. Процесът на образуване на меланин в меланоцитите е както следва:тирозиназаокислява тирозин до полиморф BA (DOPA); след това се окислява до допахинон. След поредица от метаболитни реакции се произвежда меланин. Тирозиназата е единственият ограничаващ скоростта ензим в реакционния процес и нейната активност определя количеството синтезиран меланин. Когато активността на тирозиназата се засили, меланинсинтезата се увеличава; когато активността на тирозиназата се инхибира, синтезът на меланин се намалява [9]. 1e активният център на тирозиназата има двойно медно активно място и всеки меден йон се комбинира с 3 хистидинови остатъка с 1 или 2 валенции съответно. 1 следователно редукцията с антиоксидантни ефекти може да взаимодейства с медния атом на активното място на тирозиназата или да намали междинния продукт в процеса на синтеза на меланин, за да инхибира образуването на меланин [10, 11]. В допълнение, инхибирането на трансфера на зрели меланоцити към кератиноцитите също може да играе роля в избелването.

Технологията за клетъчно култивиране се използва за определяне на ефекта отизбелванеактивни съставки натирозиназаактивност и производство на меланин в меланоцитите in vitro. Клетъчна линия 1e на миши меланом (клетки B16) е получена от миши кожни меланомни клетки и нейната основна структура, особено по отношение на синтеза на меланин, е основно същата като тази на нормалните човешки меланомни клетки. Тъй като е много трудно да се култивират човешки първични кожни меланомни клетки, моделът на мишка може да се използва като тестова клетка за определяне наизбелванеактивни съставки. 1 следователно, B16 клетки бяха използвани за измерване на антиоксидантната активност, активността на тирозиназата и активността за отстраняване на меланин, а избелващите активни компоненти и свързаният с тях механизъм бяха определени предварително. Резултатите поставиха основата за по-нататъшното развитие и използване на ресурсите от пулпа на Trichosanthes и също така осигуряват основа за разработването на естествена избелваща козметика.

2. Експерименти

2.1. Материали.

Trichosanthes trichosanthis е събран от базата за засаждане на билкови лекарства Hebao в Pinyin, Jinan. Пробите 1e бяха идентифицирани от професор QingmeiGuo от Университета по традиционна китайска медицина Шандонг. След отстраняване на кората и семките се получава пулпеста част от плода. След сушене чрез замразяване пулпата се раздробява, смесва и накрая се поставя в ексикатор за по-нататъшна употреба.

прясна цистанчесехинакозидефекти

2.2. Клетъчна жизнеспособност.

B-16 клетки (миши меланомни клетки) бяха закупени от KeyGEN и поддържани в среда DMEM, допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS), при 37 градуса във влажна атмосфера с 5 процента CO2. 1en, B-16клетки се посяват в 96-плаки с ямки (10 × 104 клетки/ямка) за 24 часа инкубация.

2.3. Приготвяне на различни екстракти.

Суровината на пулпата на Trichosanthes kirilowii е 4,5 kg. 1е целулоза се накисва в 10 пъти количеството на 95 процента етанол 3 пъти. 1е екстрактите се смесват и се концентрират до около 3.0 L. Екстракт от етил ацетат се получава чрез диспергиране на етанолекстрата в 15 L вода, екстрахирането му с етил ацетат, докато екстрактът стане безцветен. 1е екстрактите се комбинират и концентрират при понижено налягане.

Екстрактът от етил ацетат се смесва със силикагел (100–200 меша) в съотношение 1:2 (екстракт: силикагел, v/ v). Разтворителят се изпарява и гелът се запазва. 1e стъклена хроматографска колона (8{{30}} mm × 1200 mm) беше напълнена с 200–300 меша силикагел и D101 макропореста смола и след това колоната се елуира с етил ацетат, петролев етер (10 процента, 25 процента, 50 процента, 75 процента и 100 процента) и метанол, етил ацетат (5 процента, 10 процента, 25 процента, 50 процента). , 75 процента и 100 процента), за да съберете всеки поток. Накрая всяка фракция беше събрана и конфигурирана до следните концентрации: 0,003125 mg/mL, 0,00625 mg/mL, 0,0125 mg/mL, 0,025 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,5 mg/ mL, 1.0 mg/mL и 2.0 mg/mL и след това се използва за обработка на култивираните клетки. В края на третирането към всяка ямка се добавят 20 μL разтвор на МТТ (5 mg/mL). 1e клетки се инкубират в продължение на 20 минути при 37 градуса. 1 супернатанта се изхвърля и към всяка ямка се добавят 100 μL DMSO. 1e абсорбцията беше измерена при 490 nm. 1e експериментът се повтаря 3 пъти. Степента на преживяемост 1e беше изчислена, както следва:

процент на преживяемост=(експериментална група празна група)/(контролна група - празна група) × 100 процента.

Оптималната концентрация (C1) на всяка фракция беше изчислена според функционалната връзка между степента на преживяемост и концентрацията на всяка фракция. C1 се разрежда 2, 4, 6 и 8 пъти, за да се получат съответно концентрациите C2, C3, C4 и C5. 1e различни екстракти от пулпа са показани в таблица 1.

Таблица 1: Полярни екстракти от пулпа на Trichosanthes и оптималната концентрация.

2.4. Експеримент за избелване

2.4.1. Антиоксидантен тест.

Използва се МТТ анализ за определяне на клетъчната жизнеспособност (MTT Kit, Kaiji Biology). 1en, B-16 клетки се посяват в 96-плаки с ямки (10 ×104 клетки/ямка) за 24 часа и се третират с различни екстракти или съединение за 24 часа. След обработката културалната среда се изхвърля и се промива два пъти с PBS. 1en се добавят 0,05 процента H2O2 и клетките се култивират в продължение на 4 часа. След това B-16 клетките се инкубират в 20 µL МТТ разтвор (5 mg/mL) при 37 градуса за 4 часа. 1en, супернатантата на културата се отстранява и остатъкът се разтваря в 100 uL DMSO. 1e абсорбцията се открива при 490 nm с помощта на четец на микроплаки (Tecan Trading AG). 1. Експериментите бяха проведени паралелно 3 пъти.

2.4.2. Инхибиране на производството на меланин.

Производството на меланин се определя чрез откриване на съдържанието на меланин в клетки чрез пиролиза на NaOH [12]. Клетките се посяват в 96-плаки за култивиране на ямки за 24 часа при клетъчна плътност от 10 ×104 клетки/ямка.1en, клетките се третират с различни екстракти или съединение за 24 часа. След това супернатантата на клетъчната култура (300 µL) се отстранява и остатъкът се разтваря в NaOH (1 mL, 1.0 mol/L) в продължение на 24 часа при стайна температура. Абсорбцията на 1e се измерва при 475 nm, като се използва четец на микроплаки (Tecan Trading AG). 1e експерименти бяха проведени паралелно с 3 повторения. 1e IC50 се определя от софтуера GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., Сан Диего, Калифорния) и арбутинът се използва като положителна контрола (IC50 =15.6 µL).

2.4.3. Определяне на тирозиназната активност.

Супернатантът на клетъчната култура се отстранява и остатъкът се разтваря в Tritonx-100 (90 µL) итирозиназа(10 µL, 1,0 mg/mL, Sigma, T3824 25ku). След смесване, сместа се инкубира при 37 градуса за 30 минути. Абсорбцията на 1e се измерва при 475 nm с помощта на четец на микроплаки (Tecan Trading AG). 1. Експериментите бяха проведени паралелно 3 пъти. 1e IC50 се определя от софтуера GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware, Inc., Сан Диего, Калифорния) и арбутинът се използва като положителна контрола (IC50 =15.6 µL).

2.5. Извличане и изолиране. Екстрактът от етил ацетат се разтваря в метанол и колоната се напълва с 200-300 меша силикагел, който се уравновесява с петролев етер. 1en, градиентно елуиране, състоящо се от петролев етер и етилацетат в съотношения 2:1, 1:1 и 1:2; етилацетат; етилацетат и метанол в съотношения 2:1, 1:1 и 1:2; и метанолът се използва заедно с TLC за получаване на съединения А (11.5 g), B (10.4 g), C (12.1 g), D (5.2 g) и Е (6.1 g).

А се разделя чрез полиамидна колонна хроматография, като се използват дихлорометан и метанол в съотношения 2:1, 1:1 и 1:2 като елуиращ разтворител. 1е елуатът се наблюдава чрез TLC. Петна със същия фактор на задържане (rf) бяха комбинирани и бяха получени А1 и А2. 1en, А1 се приготвя чрез TLC, като се използват дихлорометан и метанол в съотношение 1:1 като проявяващ агент и се пречиства няколко пъти с гел колона. Накрая се получават съединение 1 (17 mg) и съединение 2 (27 mg). А2 се пречиства чрез колонна хроматография със силикагел, като се използва дихлорометан и метанол като елуент в съотношения 1:1 и 1:2. Получават се съединение 3 (11 mg), съединение 4 (12 mg) и съединение 5 (23 mg). В се разделя чрез хроматография със средно налягане С18 с обърната фаза (RP-C18), като се използва метанол, вода в градиентно елуиране, както следва: 0 процента, 10 процента, 15 процента, 20 процента, 25 процента, 30 процента, 35 процента, 40 процента, 50 процента, 75 процента, 90 процента и 100 процента. Скоростта на потока 1e е 10 mL·min−1. 1e фракции на потока със същата rf бяха комбинирани и бяха получени B1 и B2. В1 се пречиства многократно чрез гел колона с метанол като елуиращ разтворител. Съединение (24 mg), 7 (21 mg) и 8 (18 mg) се получават след многократно елуиране. В2 се пречиства с гел колона и метанол и се получава съединение 9 (11 mg). С се разделя с RP-C18 и се елуира с метанол и вода със скорост на потока 10 mL·min-1. 1е фракции на потока с една и съща rf се комбинират и се получават С1, С2 и С3. С1 се получава от гел колона и се елуира с метанол и се получава съединение 10 (13 mg). С2 се отделя чрез колона със силикагел и се елуира с етилацетат и метанол, с градиентно елуиране в съотношения 2:1, 1:1 и 1:2. С2 се пречиства чрез препаративна течнофазова екстракция и съединения 11 (15 mg) и 12 (14 mg) се получават. С3 се отделя от полиамидна колона, елуира се с метанол и вода и се пречиства чрез HPLC. Получават се съединения 13 (34 mg), 14 (42 mg) и 15 (38 mg). D се разделя с RP-C18 и се елуира с метанол и вода. Скоростта на потока Ie е 10 mL·min-1. Съединения 16 (36 mg), 17 (19 mg) и 18 (37 mg) се получават чрез HPLC. Съединения 19 (29 mg) и 20 (34 mg) се получават чрез градиентно елуиране, като се използва етилацетат и метанол в съотношения 1:1 и 1:2, последвано от 100 процента метанол върху колона със силикагел.

herba epimedium sagittatum върху кожата

3. Резултати и дискусия

3.1. Определяне на активни екстракти (E1–E11).

1e оптималната концентрация (а именно C1) на всеки екстракт е изчислена и е показана в таблица 1. 1e антиоксидантен експеримент показва, че всички екстракти имат антиоксидантен възстановяващ ефект, но в сравнение с VC, антиоксидантният ефект на всяка група е слаб. 1e антиоксидантната активност на E1, E3, E4, E7 и E11 намалява при нарастване на концентрацията, както е показано на фигура 1. 1e тестът за инхибиране на меланина показва, че всички полярни компоненти в пулпата на Trichosanthes kirilowii инхибират синтеза на меланин. По-специално, степента на инхибиране на меланина е значително по-висока за E2, E3 и E4 от тази на положителната контрола арбутин, както е показано на фигура 2. 1e резултати оттирозиназаактивност показват, че всички полярни компоненти в пулпата на Trichosanthes kirilowii инхибират активността на тирозиназата и тенденцията на инхибиране е подобна на тази на инхибирането на меланин. 1e инхибирането на активността на тирозиназата е значително по-високо за E2, E3, E4 и E8 от това на положителната контрола. Като цяло екстрактите от петролев етер имат слаб инхибиторен ефект върху тирозиназата. Екстрактите от етилацетат имат силен инхибиторен ефект върху тирозиназата, особено полярните компоненти от етилацетата. 1e екстракти от n-бутанол също имат силен инхибиторен ефект върху тирозиназата, както е показано на фигура 3.

3.2. Изолиране и идентифициране на мономерни компоненти.

20 съединения бяха разделени със силикагел и ODS хроматограмни колони, както и препаративна HPLC. На базата на NMR и MS анализ на данни, техните структури бяха изяснени.1e 20 съединения са показани в Таблица 2, а специфичните аналитични данни за мономерите са показани в Приложение 1.

3.3. Валидационен анализ на ефективни съединения

3.3.1. Валидационен анализ на антиоксидантни съединения.

E1, E2, E3, E4 и E5 имат антиоксидантен ефект. 1e основните съединения, изолирани от горните компоненти, са дрехслерол-В (съединение 9), циклохексанол 3-палмитат (съединение 10), 5-ацетоксиметил-2-фуралдехид (съединение 11), 5-хидроксиметилфурфурал ( съединение 12), диосметин (съединение 13), апигенин (съединение 14), хризоберил (съединение 15), лутеолин (съединение 16), 4′-хидрокси-скутеларин (съединение 17), кверцетин (съединение 18), 3′,{{ 25}}основните съединения са гликозиди, което показва, че гликозидите имат добра антиоксидантна активност. Фенолни киселини, като 5-ацетоксиметил-2-фуралдехид (съединение 11), 5-хидроксиметилфурфурол (съединение 12), диосметин (съединение 13), апигенин (съединение 14), хризоберил (съединение 15) ,лутеолин (съединение 16), 4′-хидроксискутеларин (съединение 17), кверцетин (съединение 18) и 3′,5-дихидрокси-7-(-Dглюкопиранозилокси)-4′-метокси флавон, също имат добра антиоксидантна активност, поради фенолната хидроксилна група и ненаситените двойни връзки [26, 27]. 1e резултатите са показани на Фигура 4.

Фигура 4: Степен на оцеляване на клетките (проценти) от антиоксидантния експеримент на различни съединения от екстракти от Trichosanthes

3.3.2. Валидационен анализ на съединения, инхибиращи меланин.

E11, E12, E13, E16, E17 и E18 имат добър инхибиторен ефект върху синтеза на меланин. Основните съединения, изолирани от горните компоненти, са показани в таблица 2. Съгласно метода в раздел 2.4.2, беше определен ефектът на всяко съединение върху синтеза на меланин. Всяко съединение беше оценено при следните концентрации: 1000 ug/mL, 800 ug/mL, 400 ug/mL, 200 ug/mL и 100 ug/mL. Всяко измерване се извършва трикратно и се изчислява скоростта на инхибиране на синтеза на меланин.

Протокатехуат (съединение 5), 5-ацетоксиметил-2-фуралдехид (съединение 11), 5-хидроксиметилфурфурал (съединение 12), диосметин (съединение 13), р-хидроксибензалдехид (съединение 1), салицилова киселина (съединение 2), ванилова киселина (съединение 3), изованилна киселина (съединение 4), транс-канелена киселина (съединение 6), 4-кумарова киселина (съединение 7), апигенин (съединение 14), хризоберил (съединение 15) ), лутеолин (съединение 16), 4′-хидрокси скутеларин (съединение 17), кверцетин (съединение 18), 3′,5-дихидрокси-7-( -D-глюкопиранозилокси)-4′ -метокси флавон (съединение 19), офлоксацин-7-O- -D-глюкозид (съединение 20) могат да инхибират производството на меланин [28]. По-специално, ваниловата киселина (съединение 3), изованиловата киселина (съединение 4), протокатехуата (съединение 5), транс-канелената киселина (съединение 6) и 4-кумаровата киселина (съединение 7) имат силно инхибиране на меланина. 1e резултатите са показани на фигура 5.

3.3.3. Проверка и анализ на съединения, инхибиращи активността на тирозиназата.

E2, E3, E4, E7, E8 и E9 имат добри инхибиращи ефекти върхутирозиназадейност. 1e основните съединения, изолирани от горните компоненти, са показани в таблица 2. Съгласно метода, представен в раздел 2.4.3, арбутинът е използван като контрола и концентрацията на съединението е 1000 µg/mL, 800 µg/mL, 400 µg/mL , 200 µg/mL и 100 µg/mL. Всяко измерване се извършва 5 пъти и се изчислява степента на инхибиране на тирозиназата. 1e резултатите са показани на фигура 6.

Резултатите от 1e показват, че диосметин (съединение 13), апигенин (съединение 14), хризоберил (съединение 15), лутеолин (съединение 16), 4′-хидроксискутеларин (съединение 17), кверцетин (съединение 18), 3′,{{10} }дихидрокси-7-(-D-глюкопиранозилокси)-4′-метокси флавон (съединение 19), ципрофлоксацин-7-O- -D-глюкозид (съединение 20), р-хидроксибензалдехид (съединение 1), салицилова киселина (съединение 2), ванилова киселина (съединение 3), изованилинова киселина (съединение 4), протокатехуат (съединение 5), транс-канелена киселина (съединение 6), 4-кумарова киселина (съединение 7) ), и транс-феруловата киселина (съединение 8) имат очевиднитирозиназаинхибиторни дейности.

Растението Cistanche инхибира активността на тирозиназата.

Кликнете върху снимката и получете повече подробности.

Хидроксилни заместени съединения на бензеновия пръстен, като р-хидроксибензалдехид (съединение 1), салицилова киселина (съединение 2), ванилова киселина (съединение 3), изованилна киселина (съединение 4), протокатехуат (съединение 5), транс-канелена киселина ( съединение 6), 4-кумарова киселина (съединение 7), транс-ферулова киселина (съединение 8) и флавоноиди, показват високо инхибиране на тирозиназата и степента на инхибиране на пара-заместените съединения е значително по-висока от тази на орто-заместените съединения . Например, инхибиторната активност на р-хидроксибензалдехида е значително по-висока от тази на салициловата киселина, а инхибиторната активност на ваниловата киселина е значително по-висока от тази на изованиловата киселина. Освен това инхибиторната активност на р-хидроксибензалдехида е значително по-висока от тази на салициловата киселина, ваниловата киселина, изованиловата киселина и протокатехуата. Причината може да е, че нуклеофилните групи около активния център натирозиназа, като –SH, −NH2 и –OH, заемат пространството около активния център и по този начин предотвратяват тирозина да атакува активния център. И накрая, синтезът на меланин е инхибиран [28]. 1e инхибиторната активност на съединения, съдържащи о-дихидрокси, е по-силна от тази на пара хидрокси съединенията, а инхибиторната активност на протокатехуата е значително по-висока от тази на ваниловата киселина. 1e по-горе явления съществуват и във флавоноидите. 1eинхибиторната скорост на флавоноидите, съдържащи 7 и 4' хидроксилни групи, е значително по-висока, отколкото ако 7 и 4' хидроксилните групи са заменени. Например инхибиторната активност на хризоберил е значително по-висока от тази на диосметин, докато инхибиторната активност на диосметин е по-висока от тази на 3',5-дихидрокси-7-(-D-глюкопиранозилокси)-4 ′- метокси флавон и ципрофлоксацин-7-O- -D-глюкозид. Скоростта на инхибиране на флавоноиди, съдържащи 3-хидрокси, е значително по-висока от тази на съединения без 3-хидрокси или ако 3-хидрокси е заменена. Например, инхибиторната активност на кверцетина е значително по-висока от тази на 4'-хидроксискутеларина, но инхибиторната активност на 4'-хидроксискутеларина е по-висока от тази на кверцетин-3-о глюкозида. В допълнение, инхибиторната активност на koellin е по-висока от тази на апигенин, но по-ниска от тази на лутеолина. Предполага се, че заместителите на В-пръстена, особено хидроксилната група, могат да подобряттирозиназаинхибиторна активност, а ортодихидрокси групата на В-пръстена има по-голяма инхибиторна активност [29].