Секвениране на целия геном за диагностициране на неврологични разстройства на повторна експанзия в Обединеното кралство: ретроспективна диагностична точност и проспективно проучване за клинично валидиране

За повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Резюме

Заден план

Нарушенията на повторната експанзия засягат около 1 на 3000 индивида и са клинично хетерогенни заболявания, причинени от експанзии на къси тандемни ДНК повторения. Генетичното изследване често е локус-специфично, което води до недостатъчна диагноза на хора, които имат атипични клинични прояви, особено при педиатрични пациенти без предишна положителна фамилна анамнеза. Секвенирането на целия геном все повече се използва като тест от първа линия за други редки генетични заболявания и ние имахме за цел да оценим неговата ефективност при диагностицирането на пациенти сневрологичниповтарящи се нарушения на експанзията.

Методи

Ние ретроспективно оценихме диагностичната точност на секвенирането на целия геном, за да открием най-често срещаните локуси на повторна експанзия, свързани сневрологичнирезултати (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT и TBP), като се използват проби, получени в рамките на Националната здравна служба в Англия от пациенти, за които се предполага, че иматневрологичниразстройства; предишни резултати от PCR тестове са използвани като референтен стандарт. Клиничната точност на секвенирането на целия геном за откриване на повторни експанзии беше проспективно изследвана при предварително генетично тествани и недиагностицирани пациенти, наети през 2013–2017 г. в проекта 100 000 Genomes в Обединеното кралство, за които се предполагаше, че имат генетичнаневрологичниразстройство (фамилни или ранни форми на атаксия, невропатия, спастична параплегия, деменция, заболяване на моторния неврон,паркинсоновдвижениенарушения, интелектуална недостатъчност или невромускулни нарушения). Ако е направено повикване за повторно разширяване, като се използва секвениране на целия геном, PCR се използва за потвърждаване на резултата.

Констатации

Диагностичната точност на секвенирането на целия геном за откриване на повторни експанзии беше оценена спрямо 793 PCR теста, извършени преди това в рамките на NHS от 404 пациенти. Секвенирането на целия геном правилно класифицира 215 от 221 разширени алела и 1316 от 1321 неразширени алела, показвайки 97,3 процента чувствителност (95 процента CI 94,2–99,0) и 99,6 процента специфичност (99,1–99 ·9) в 13-те свързани с болестта локуса в сравнение с резултатите от PCR теста. В проби от 11 631 пациенти в проекта 100 000 Genomes Project, секвенирането на целия геном идентифицира 81 повторни експанзии, които също бяха тествани чрез PCR: 68 бяха потвърдени като повторни експанзии в пълния патогенен диапазон, 11 не бяха -патогенни междинни разширения или пермутации, а две бяха неразширени повторения (16% процент на фалшиви открития).

Интерпретация

В нашето проучване секвенирането на целия геном за откриване на повторни разширения показа висока чувствителност и специфичност и доведе до идентифицирането наневрологичниповтарящи се нарушения на експанзията при недиагностицирани преди това пациенти. Тези констатации подкрепят прилагането на секвениране на целия геном в клиничните лаборатории за диагностика на пациенти, които иматневрологичнипредставяне, съответстващо на нарушение на повторната експанзия.

Финансиране

Съвет за медицински изследвания, Министерство на здравеопазването и социалните грижи, Национална здравна служба на Англия, Национален институт за здравни изследвания и Illumina.

Въведение

Въпреки скорошния напредък в нашето разбиране за генетичната основа на редкитеневрологичниразстройства, до 70 процента от пациентите с такива разстройства остават генетично недиагностицирани.1–3 Отчасти това се дължи на техническите предизвикателства на тестването за сложни и повтарящи се генетични варианти, включително повтарящи се експанзии; Смята се, че такива разширения засягат около 1 на 3000 души (приложение стр. 1) и са водещата причина за повече от 40 неврогенетични разстройства,4 включително болестта на Хънтингтън и синдрома на крехката X. Нарушенията на повторната експанзия са клинично и генетично хетерогенни и повторната експанзия може да бъде свързана с различни заболявания. Например, експанзиите в C9orf72 могат да се представят или като амиотрофична латерална склероза, или като фронтотемпорална деменция.5 Повтарящите се експанзии в различни локуси могат също да доведат до подобни фенотипни характеристики, което ги прави трудни за клинично разграничаване: повтарящи се експанзии в поне десет гена на спиноцеребеларна атаксия, често присъстващи при възрастни -начална атаксия,6 и тези в C9orf72 и AR могат да причинят заболяване на моторните неврони.7,8

Нарушенията на повторната експанзия се причиняват от увеличаване на броя на повтарящи се къси тандемни ДНК последователности и праговете на патогенност за всяко нарушение са специфични за локус. Размерът на разширението варира от по-малко от 30 повторения (напр. в CACNA1A) до няколко хиляди повтарящи се единици (напр. във FMR1, DMPK, C9orf72 и FXN, които могат да се разширят до 5 kb по размер). Повтарящите се експанзии проявяват молекулярна нестабилност, която може да доведе до промени в размера на повторенията (като цяло увеличаване на дължината) в поколенията и тъканите.4 При тези условия увеличаването на броя на повторенията често води до по-ранно начало и по-тежко заболяване в последователни поколения.4 Педиатричната поява на разстройства на повторна експанзия може да се представи като мултисистемни синдроми без специфични фенотипни признаци9 и следователно децата с тези нарушения е по-вероятно да бъдат недостатъчно диагностицирани, когато фамилната анамнеза за разстройство на повторна експанзия липсва, отколкото когато е налице.10– 12

Лабораторната оценка на повтарящите се експанзии обикновено се ограничава до целенасочената молекулярна оценка на индивидуален локус, ръководен от предполагаемата клинична диагноза, използвайки PCR-базирани или Southern blot методи, 13 което може да бъде скъпо и отнема много време. Освен това, поради разнообразните и припокриващи се фенотипни характеристики на тези разстройства, свързаните със заболяването локуси на повторна експанзия могат да останат нетествани.14

Секвенирането на целия геном се очертава като диагностичен инструмент от първа линия при пациенти с редки заболявания15, но доскоро се смяташе, че има ограничена способност за оценка на локуси, съдържащи повтарящи се експанзии.16 Напредъкът в биоинформатиката обаче направи възможно откриването на заболяването -предизвикване на повтарящи се експанзии от данни за секвениране от следващо поколение.17–22 Тук докладваме за диагностичната оценка на подход за секвениране на целия геном за откриване на повторни експанзии с помощта на ретроспективни PCR данни и неговото клинично валидиране при пациенти в проекта 100 000 генома, които има съмнение за неврологично разстройство, недиагностицирано с предишно генетично изследване.

Методи

Дизайн на изследването и участници

Тази оценка на секвенирането на целия геном за откриване на повторни разширения включва както диагностична точност, така и оценки на клинична точност. Диагностичната точност беше оценена с помощта на данни от пациенти, които преди това са били тествани чрез PCR за повтарящи се експанзии, за които е известно, че причиняват неврологично заболяване.4 Пациентите бяха идентифицирани от два източника: 100 000 Genomes Project и Геномната лаборатория, базирана в университетските болници в Кеймбридж ( Кеймбридж, Обединеното кралство). И за двата набора пациенти е извършено PCR тестване върху проби от пациенти от лаборатории в Националната здравна служба (NHS) като част от рутинна клинична оценка: за пробите в проекта 100 000 генома, PCR тестовете са направени преди набирането в проекта от Лаборатория по неврогенетика на болницата на University College London (Лондон, Обединеното кралство); проби с PCR-потвърдени повторни експанзии са получени от пациенти, тествани от Геномната лаборатория, базирана в Кеймбридж. Пациенти с PCR-положителни и PCR-отрицателни резултати от тестове за повторни нарушения на разширяването бяха идентифицирани за включване в нашето проучване чрез системи за лабораторни записи; всички пациенти са дали писмено информирано съгласие за използване на тяхната проба за осигуряване на качеството и за изследователски и обучителни цели, като част от оптимизирането и валидирането на клиничните услуги.

Секвенирането на целия геном на всяка проба беше извършено в една от двете лаборатории: Genomics England (Hinxton, UK) за пробите от проекта 100 000 Genomes Project (n=254) и Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; Сан Диего, Калифорния, САЩ) за проби, получени от Геномната лаборатория, базирана в Кеймбридж (n=150). Като цяло, този набор от данни беше използван за частта на изследването за диагностична точност и се състоеше от данни за PCR и секвениране на целия геном от 404 пациенти, обхващащи 13 локуса, които представляват най-честите нарушения на неврологичното повторение на експанзията: 11 локуса, свързани с атаксия и късно- начални невродегенеративни разстройства (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 и FXN), един локус, свързан с интелектуално увреждане (FMR1), и един локус, свързан с миотонична дистрофия (DMPK). За всеки локус бяха налични данни от PCR тест за поне един разширен алел (приложение стр. 24).

Клиничната точност беше оценена чрез изследване на съответствието на повторните експанзии, както е открито при секвениране на целия геном, със съмнение за клинична диагноза след PCR потвърждение при пациенти със съмнение за генетични неврологични заболявания (фамилни или ранни форми на атаксия, невропатия, спастична параплегия, деменция , заболяване на моторните неврони,паркинсоновдвигателни разстройства, интелектуални затруднения или нервно-мускулни разстройства), наети в проекта 100 000 генома през 2013–2017 г. Проектът 100 000 генома е програма в Обединеното кралство за оценка на стойността на секвенирането на целия геном при пациенти с незадоволени диагностични нужди при редки заболявания и рак. След етично одобрение за проекта 100 000 генома от Комитета по етика на научните изследвания в Източна Англия в Кеймбридж (референтен номер 14/EE/1112), включително за анализ на данни и връщане на диагностични открития на пациентите, тези пациенти бяха наети от здравни специалисти и изследователи от 13 центъра за геномна медицина в Англия и са били включени в проекта, ако те или техен настойник са предоставили писмено съгласие техните проби и данни да бъдат използвани в изследвания, включително това проучване. Пробандите и, ако е възможно, други членове на семейството бяха включени в съответствие с критериите за допустимост, определени за специфични състояния на редки заболявания (приложение, стр. 5–11). Пациентите бяха наети в проекта 100 000 генома след стандартно генетично изследване в NHS, както е посочено в критериите за допустимост. Стандартизирани изходни клинични данни бяха записани с помощта на онтологията за определяне на човешкия фенотип (HPO)23 срещу специфични за болестта модели на данни.24 Статусът на заболяването на членовете на семейството по отношение на клиничната индикация за тестване на пробанда също беше събран.

За да идентифицираме причинно повтарящи се експанзии при пациенти с генетично недиагностицирано заболяване, тествахме пациенти със съмнение за генетични заболявания, съответстващи на болест на повторна експанзия. Пациентите бяха избрани въз основа на съответствието на тяхното заболяване и термините на HPO с разстройства, свързани с повторна експанзия. Данните за секвениране на целия геном на пациентите бяха разпитани, за да се търсят разширения в определени набори от повторения, като се използват четири различни панела за разширение на повторенията според техните клинични характеристики (приложение стр. 5). Повтарящите се експанзии, избрани за включване в тези панели, са най-честите локуси на повторна експанзия, причиняващи неврологични заболявания. Пациенти с клинични характеристики, потенциално съвместими с повече от едно нарушение на повторната експанзия, бяха тествани на множество панели. Ако е направено повикване за повторно разширение, използвайки секвениране на целия геном, е извършено потвърждаващо тестване чрез PCR.

За всеки пациент с потвърдено повторно разширяване, местният клиницист е информиран за потенциалния диагностичен резултат и е оценен приносът на повторното разширяване към клиничните характеристики на пациента. За повторни разширения, които напълно или частично обясняват клиничните характеристики на пациента, се издава диагностичен доклад съгласно местните стандартни процедури.

Процедури

За историческите проби на NHS, използвани в частта за диагностична точност на нашето изследване, повторните разширения преди това са били тествани с помощта на PCR амплификация и анализ на фрагменти. Southern blotting се извършва за големи C9orf72 разширения. В частта за клиничната точност на нашето проучване, повторните разширения, открити чрез секвениране на целия геном при пациенти от проекта 100 000 Genomes Project, бяха тествани чрез PCR в проби, съхранявани в генетични лаборатории на NHS. Допълнителни подробности, включително последователности на праймери, са предоставени в приложението (стр. 2–3, 25–26).

ДНК беше подготвена за секвениране на целия геном с помощта на подготовка на библиотека TruSeq DNA PCR-Free и 150 bp или 125 bp секвениране в сдвоен край беше извършено на платформи HiSeq 2000 или HiSeq X в съоръжението за високопроизводителни геноми за Genomics England и в ICSL . Геномите бяха секвенирани до средна дълбочина от 35 × (31 × до 37 ×; приложение стр. 27). Генотипизирането с късо тандемно повторение беше извършено с помощта на софтуерния пакет ExpansionHunter версия 3.1.2.25,26 Накратко, ExpansionHunter пренарежда последователността на четене в предварително дефиниран набор от къси тандемни повторения, за да оцени размера на двата алела от индивид (приложение стр. 3).

Изходът на ExpansionHunter включва оценка на броя на повтарящите се елементи, общия размер и границата на достоверност за всеки оценен локус. Указанията на Асоциацията за медицинска патология и Колежа на американските патолози препоръчват визуална проверка на вариантните повиквания по време на рутинната оценка на варианти на секвениране с висока производителност.27

Въпреки това, късите тандемни повтарящи се варианти не могат да бъдат адекватно визуализирани от общи инструменти за визуализация като Integrative Genomics Viewer.28 За да се изследват данните за секвениране на целия геном, лежащи в основата на всяко повикване на генотип, беше използван инструмент за графична визуализация, който позволява директно визуализиране на хаплотипове и съответното натрупване на четене на генотипове ExpansionHunter (приложение стр. 3, 15). Визуална проверка на pileup графиката беше извършена на всички къси тандемни повторения за секвениране на целия геном, за да се потвърди, че прогнозата на ExpansionHunter за алели се съдържа изцяло във всяко четене (т.е. повторната последователност беше по-малка от дължината на четене на секвенцията); за потвърждаване на наличието на моноалелно или двуалелно разширение; за откриване на предполагаеми фалшиво-положителни повиквания; и за откриване на фалшиво-отрицателни алели в двуалелни повторни разширения, като FXN (приложение стр. 4, 16).

ExpansionHunter оценява размера на повторението от данни за секвениране на целия геном чрез анализиране на четения на секвениране, които изцяло или частично съдържат кратко тандемно повторение. Ако къс алел с тандемно повторение е по-къс от дължината на четене, ExpansionHunter прогнозира точния размер; ако къс алел за тандемно повторение е по-дълъг от дължината на четене, ExpansionHunter оценява размера на повторението в рамките на CI в зависимост от състава на локусната последователност, дълбочината на секвенирането и качеството на секвенирането.

Статистически анализ

Класифицирахме повторенията като разширени чрез секвениране на целия геном, ако размерът, предсказан от ExpansionHunter, е над границата на премутацията, или неразширени, ако прогнозираният размер е под границата (приложение, стр. 28).

Чувствителността и CI за откриване на експанзия на повторение при секвениране на целия геном бяха изчислени като съотношението на алелите с разширени повторения сред предварително потвърдените с PCR алели с разширени повторения. Специфичността се оценява като съотношението на неразширените алели сред предварително тествани неразширени повторения чрез PCR. Пълно описание на статистическите формули е дадено в приложението (стр. 1).

За да се сравнят размерите на повторенията чрез PCR с оценките на размера на повторенията чрез секвениране на целия геном, количествено определените с PCR алели бяха сравнени с размерите на повторенията, предсказани от ExpansionHunter за алели, по-къси от дължината на четене във всичките 13 къси тандемни повтарящи се локуса. Съответствието беше изчислено чрез процента на повторените размери, предсказани от ExpansionHunter, които бяха в съгласие с PCR-количествения размер, като се взе предвид PCR грешката от плюс или минус едно повторение. Статистическият анализ беше извършен с помощта на R статистически софтуер версия 3.6.3.

Роля на източника на финансиране

Дизайнът на проучването, включването на пациентите, събирането на данни и секвенирането бяха ръководени от служители на Genomics England и академични изследователи. Служителите на Illumina извършиха секвенирането на 150 проби от пациенти като планиран компонент от изследването за диагностична точност на секвенирането на целия геном и разработиха ExpansionHunter. Служители на Genomics England, академични изследователи и съавтори RTH, ED и MAE извършиха анализа и интерпретацията на повторни разширения при пациенти, наети в 100 000 Genomes Project. Източниците на финансиране не са имали никаква роля в тълкуването на данните или писането на доклада.

Резултати

Диагностичната точност на секвенирането на целия геном за откриване на повторни експанзии беше оценена спрямо 793 PCR теста, извършени преди това в рамките на NHS от 404 пациенти (64 пациенти бяха тествани за повече от едно повторение; фигура 1). От тези тестове 183 бяха класифицирани като имащи разширено повторение и 610 като такива без повторна експанзия чрез PCR, което дава общо 221 разширени и 1321 неразширени индивидуални алела в 13 локуса на заболяването (приложение стр. 24, 28). Секвенирането на целия геном правилно класифицира 215 от 221 разширени алела и 1316 от 1321 неразширени алела в сравнение с резултатите от PCR теста (приложение стр. 27, 29), показвайки първоначална чувствителност от 97,3 процента (95 процента CI 94,2–99 ·0) и специфичност от 99·6 процента (99·1–99·9; таблица 1). След визуалната корекция на всички повиквания въз основа на качеството на показанията, чувствителността се повишава до 99·1 процента (96·8–99·9) и специфичността до 100 процента (99·7–100; фигура 2A, таблица 1). Визуализацията на разширените алели даде възможност за откриване на фалшиво-положителни резултати и прекласифициране на всички фалшиво-отрицателни алели в FXN, от които само един алел беше правилно класифициран като разширен в проби с двуалелни разширения (приложение стр. 17, 18).

Дължината на повторението беше количествено определена чрез PCR в 509 PCR теста, разпитващи 945 алела в 13 локуса на повторение на експанзия. Корелациите между ExpansionHunter и PCR за размери на повторение, по-къси и по-големи от дължината на четене на последователността (т.е. 150 bp) са показани в приложението (приложение стр. 19). Наблюдава се високо съответствие за повторения, по-къси от дължината на четене, с 92,7 процента (836 от 902) съгласие между PCR и ExpansionHunter. Наблюдава се локусна променливост с високо съответствие между ExpansionHunter и PCR за ATXN2, ATXN7, CACNA1A и HTT и ниско съответствие за DMPK или TBP (приложение, стр. 30). Дължините на алелите, по-големи от прочетената дължина, бяха подценени от ExpansionHunter, което повлия на точността на извикване в DMPK, FMR1 и FXN (фигура 2B, приложение стр. 19, 31).

Въпреки че ExpansionHunter успя да идентифицира правилно големи разширени алели във FMR1, DMPK, C9orf72 и FXN (приложение стр. 29), прогнозираните оценки на размера бяха по-ниски от тези, получени чрез PCR, тъй като размерът на повторението се увеличи в рамките на патогенния диапазон, което повлия на способност за разграничаване между големи и малки разширения в DMPK, C9orf72 и FXN или между пълни разширения и пермутации във FMR1 (приложение стр. 31). Например, локуси с PCR-оценена дължина на повторение, по-голяма от 200 повторения във FMR1 и класифицирани като пълна мутация, имат среден размер на повторение, изчислен от ExpansionHunter от 92·6 (SD 17·8; приложение стр. 31).

За да тестваме способността за откриване на повторна експанзия чрез секвениране на целия геном за разрешаване на диагнозата на предварително тествани и генетично недиагностицирани пациенти, тествахме 11 631 пациенти със съмнение за генетично неврологично разстройство, наети в проекта 100 000 генома (фигура 1). Данните за секвениране на целия геном бяха оценени с помощта на четири различни панела за повторение на разширение според клиничните характеристики на пациента. Броят на пациентите, тествани с всеки от четирите панела, е показан в таблица 2.

Като цяло открихме и визуално потвърдихме повтарящи се експанзии в проби от 105 пациенти (таблица 2, приложение стр. 20, 33). От тях 81 проби бяха налични за потвърждаващо изследване чрез PCR и 68 бяха потвърдени като имащи повторна експанзия (0·6 процента добив): 45 (1,2 процента) от 3692 в панел А, осем ({ {18}}·3 процента) от 2743 в панел B, пет (0,6 процента) от 860 в панел C и десет (0,1 процента) от 6731 в панел D. Тринадесет от 81 извиквания за разширение не са били потвърдени като патогенни повторни експанзии (16 процента степен на фалшиво откриване). От тях два бяха неразширени алели в ATXN1 и ATXN2, четири бяха междинни размери на FMR1 (приложение стр. 21) и седем бяха FMR1 пермутации.

Клиничните подробности за 68-те пациенти с повторни експанзии, потвърдени от PCR, включително техните клинични прояви, идентифицираната повторна експанзия и приносът на повторната експанзия към клиничните характеристики на пациента са дадени в таблица 3; условията на HPO, размерът на повторението, изчислен от ExpansionHunter, и дали е издаден диагностичен доклад са изброени в приложението (стр. 33).

Наблюдавани са експанзии при пациенти с голямо разнообразие от припокриващи се клинични прояви, тествани с панел А (таблица 3, приложение стр. 22), включително повторна експанзия на ATXN2 при пациент с ранно начало на Паркинсонова болест, отговарящо на леводопа, и анамнеза за прогресивна церебеларна атаксия , и разширения на AR при четирима пациенти, клинично диагностицирани с болест на Charcot-Marie-Tooth, включително един с генетично потвърдена демиелинизираща невропатия (т.е. болест на Charcot-Marie-Tooth тип 1, пациент 42; приложение стр. 33). Наблюдава се широк диапазон от предишни клинични диагнози при пациенти с патогенни повторни експанзии.

Например, при седем пациенти с амиотрофична латерална склероза или друго моторно невронно заболяване, бяха идентифицирани разширения в AR (n=4) и C9orf72 (n=3). При пациенти със съмнение за наследствена атаксия ние идентифицирахме разширения в локуси, които не са били оценени като част от рутинна диагностична обработка в рамките на NHS по време на набирането, включително ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP и HTT ( таблица 3). Ние също така открихме повторни експанзии при пациенти с клинични характеристики, съответстващи на алтернативни разстройства на повторна експанзия, включително експанзия на C9orf72 при ранно начало и фамилна болест на Паркинсон (пациент 24, Таблица 3) и повторни експанзии в диапазона на намалено проникване при HTT (38 повторения) при две сестри с двигателно разстройство, деменция, депресия и говорни затруднения (пациенти 44 и 45), което подчертава диагностичното предизвикателство, представено от тези разстройства на повторна експанзия.

Установено е, че осем деца, тествани с панел B, имат големи повторни разширения на CAG (фигура 3), седем от които напълно обясняват клиничните характеристики на пациента. Шест пациенти не са имали информативна фамилна анамнеза и не им е било предложено повторно разширяване на теста като част от тяхната клинична оценка по време на набирането (пациенти 48–53; таблица 3, приложение стр. 33). Две от тези деца са имали големи разширения на HTT (90–100 CAG повторения). Трябва да се отбележи, че едно дете е наследило повторението от незасегнат родител без фамилна анамнеза за болестта на Хънтингтън. Семейните тестове продължават, но в разширеното семейство е идентифициран алел с намалена пенетрантност, което показва, че повторението се е разширило с над 60 повтарящи се единици в едно поколение (пациент 52). Към момента на писане никой в ​​семейството не е показвал никакви признаци на болестта на Хънтингтън и генетичните консултации и тестове продължават за родителите. Две деца на възраст под 5 години са имали големи повторни разширения в ATXN7 и са представени със сложно мултисистемно заболяване. За едно от тези деца (пациент 50), техният родител е показал проблеми с походката 2 години след записването в проекта 100 000 генома. По подобен начин беше установено, че момиче на 10 години с интелектуално увреждане има 99-повтарящо се разширение в ATXN2, въпреки факта, че и двамата родители са определени като незасегнати, а момиче на 18 години с деменция е установено, че носи { {19}}повтаряне на разширението в ATN1 (приложение стр. 33).

Бяха открити пет разширения в DMPK (панел C), включително при дете и майка с клинична диагноза мускулна дистрофия, при двама братя и сестри със съмнение за дистална миопатия и при юноша с вродена миопатия (пациенти 54–58). Разширения на FMR1 (панел D) бяха открити при девет момчета и едно момиче и диагнозата синдром на Fragile X напълно или частично обясни представените клинични характеристики (пациенти 59–68).

Дискусия

Диагнозата на разстройства с повторна експанзия е предизвикателство в здравеопазването поради хетерогенни и припокриващи се клинични характеристики и неспецифични клинични находки, които могат да се увеличат по тежест с възрастта и във всяко следващо поколение. Разстройствата на повторната експанзия са сред най-честите причини за наследствени неврологични заболявания.4 Независимо от това, пациентите може да не бъдат диагностицирани поради недостатъчно генетично изследване или поради това, че причинните генетични варианти все още не са открити. Подходите за тестване понастоящем са фрагментирани и пациентите може да имат тестван неправилен повторен локус на експанзия29 или да получат молекулярен тест за различен клас варианти поради припокриване на клиничните характеристики с други неврологични генетични заболявания.30

Секвенирането на целия геном е използвано в множество настройки като диагностичен тест от първа линия за редки неврологични заболявания, но преди това се е смятало, че има ниска способност за откриване на повторни експанзии.16 Разработени са няколко инструмента за идентифициране на повторни експанзии от целия геном секвениране в изследователската среда,31 но нито един от тези подходи не е приложен към данни за секвениране на целия геном, събрани от голям брой пациенти в една здравна услуга. Представяме доказателства, че алгоритъм, предназначен за откриване на повторни разширения от секвениране на целия геном, може надеждно да оцени най-честите причиняващи заболяване повтарящи се разширения и да разреши предишни генетично недиагностицирани случаи в голяма група пациенти с неврологични разстройства. Нашите резултати показват, че секвенирането на целия геном може да разграничи неразширените и разширените алели с висока чувствителност и специфичност в 13 повтарящи се локуса на разширение (които могат да бъдат допълнително подобрени чрез визуална проверка), може точно да изчисли размера на алелите, по-малки от дължината на четене и може да подценява размера на големите разширения във FMR1, DMPK, FXN и C9orf72.

Когато откриването на повторни разширения чрез секвениране на целия геном беше оценено спрямо положителни и отрицателни резултати, получени преди това в клинични диагностични геномни лаборатории, използващи методи на златен стандарт, ние открихме минимум 97,3 процента чувствителност и 99,6 процента специфичност. Освен това, ние показахме, че както специфичността, така и чувствителността могат да бъдат подобрени чрез ръчно куриране на прочетеното натрупване, което позволява откриване на фалшиво-положителни резултати и прекласифициране на фалшиво-отрицателни алели в проби с двуалелни разширения. От 6731 пациенти, тествани за FMR1 (панел D), 124 обаждания се очаква да бъдат разширени. Успяхме да изключим 97 чрез визуална проверка като вероятни фалшиви положителни резултати. Това показва, че 1 от 54 теста за секвениране на целия геном ще има FMR1 повикване, което ще трябва да бъде визуално инспектирано, за да се отхвърли потенциално фалшиво положително повикване. Продължава работата по подобряване на метода за генотипиране на ExpansionHunter, за да се намали броят на фалшиво положителни сигнали за FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 повторения) причиняват по-тежко заболяване и спиноцеребеларна атаксия тип 36 (NOP56), за която разширения, по-големи от 650 повторения, се считат за патогенни, а повторенията от 15–650 се считат за междинни и варианти с несигурно значение.

Идентифицирани са повече от 40 локуса на повторна експанзия; много от тези локуси са идентифицирани едва наскоро и сега се свързват с необясними преди това състояния, включително церебеларна атаксия с невропатия и синдром на вестибуларна арефлексия (RFC1) 32 и миоклонична епилепсия (SAMD12).33 Най-честите локуси на повторна експанзия, причиняващи неврологични заболявания, са били избрани за нашето изследване въз основа на наличието на положителни и отрицателни контролни проби.

Констатациите, представени тук, предполагат, че ExpansionHunter би трябвало да може да класифицира точно неразширените и разширените алели при всеки повторен локус на разширение, ако неразширените алели са по-малки от прочетената дължина (т.е. 150 bp). Въпреки че повечето повтарящи се локуси на разширение имат алели, които са по-малки от 150 bp, когато не са разширени, някои локуси, за които размерът на неразширения алел е близо до 150 bp (напр. NOTCH2NLC)34 може да бъде по-трудно да се генотипират с помощта на този подход. За локуси, където разширеното повторение е значително по-голямо от дължината на четене, секвенирането на целия геном може да открие патогенни разширения (напр. NOP56,35 RFC120,32). Нововъзникващите технологии за секвениране с дълго четене могат да предложат допълнителни подходи при генотипизиране на големи разширения.36

Оценката на повтарящите се експанзии с помощта на секвениране на целия геном при 11 631 недиагностицирани пациенти, наети в 100 000 Genomes Project, даде 68 пациенти с обяснителни констатации. Пациентите бяха наети в 100 000 Genomes Project след стандартно генетично изследване; следователно, пропорцията на повтарящи се експанзии, идентифицирани в тази кохорта, представлява повишаване на диагностичния добив от стандартното NHS тестване, което включва локус-специфично тестване за повторни експанзивни нарушения като FXN или DMPK. Трябва да се отбележи, че някои диагнози не са заподозрени въз основа на клиничните характеристики на пациента, включително шест педиатрични пациенти, които не са имали известна фамилна анамнеза за разстройство на повторна експанзия. Средните размери на повторение на разширението, предвидени чрез секвениране на целия геном при педиатрични пациенти, описани в това проучване, са значително по-големи от средните при възрастни, в съответствие с очакването, че по-големите разширения са свързани с по-ранно и по-тежко начало, дори при деца. Необходима е по-нататъшна работа, но това откритие предполага, че зависима от възрастта и повторен размер оценка на патогенността може да подкрепи педиатрична диагноза чрез намаляване на потенциалната опасност от идентифициране на рискови алели при възрастни, което води до нежелано предсказуемо тестване при деца.

Нашите открития позволяват установяването на клиничен диагностичен работен процес за секвениране на целия геном (приложение стр. 23). Ние предлагаме да се направи визуална проверка за всички обаждания, класифицирани като разширени, за откриване на фалшиви положителни резултати и за двуалелни разширения, за които е открит само един разширен алел (напр. FXN). Препоръчваме на лабораториите да използват ExpansionHunter, за да оценят наличието на разширение без придържане към оценката на размера и да извършат потвърждаващо PCR тестване като стандартен компонент от работния процес на тестване.

Редките наследствени заболявания включват широк спектър от клинични характеристики, което прави специфичното за локус геномно изследване неефективно, трудно и скъпо. Представяме доказателства, че секвенирането на целия геном от клиничен клас с потенциал за диагностициране на набор от редки неврологични заболявания, обикновено представящи се с единична база, индел или варианти на брой копия, сега може да бъде разширено до повторни разширения. Тъй като секвенирането на целия геном осигурява единичен тест, който може да идентифицира най-честите повторни експанзии, както и позволява едновременно тестване на точкови мутации и варианти на брой копия в гени, свързани с тези състояния, то предлага възможност за идентифициране на повечето пациенти с тези хетерогенни разстройства които не са били диагностицирани с помощта на локус-специфично изследване. В ерата на нововъзникващи терапии за тези разстройства ранното откриване може да стане решаващо.37 Тези резултати подкрепят прилагането на секвениране на целия геном за откриване на повтарящи се разширения в клинични диагностични лаборатории, подход, който вече е включен в NHS England National Genomic Справочник за тестове, 38 за изследване на недиагностицирани редки неврологични заболявания.

Препратки

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Диагностичен таван за секвениране на екзоми при церебеларна атаксия и свързани неврологични разстройства. Хум Мутат 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Наследствена спастична параплегия в Гърция: характеризиране на неизследвана по-рано популация с помощта на секвениране от следващо поколение. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Диагностичен добив на целеви генен панел за секвениране от следващо поколение за двигателни разстройства с начало в педиатрията: 3-годишно кохортно проучване. Предна Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Болести на повторната експанзия. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 фронтотемпорална деменция и/или амиотрофична латерална склероза. Сиатъл, Вашингтон: Университет на Вашингтон, 2015 г.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Спиноцеребеларна атаксия. Nat Rev Dis Primers 2019; 5: 24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Клинична неврогенетика: автозомно доминантна спиноцеребеларна атаксия. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Спинална и булбарна мускулна атрофия. В: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Сиатъл, Вашингтон: Университет на Вашингтон, 1999 г.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Летална форма на спиноцеребеларна атаксия тип 7 ​​с ранно начало в детска възраст. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Агрегация и убиквитиниране на атаксин-7 в инфантилен SCA7 със 180 CAG повторения. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Спиноцеребеларна атаксия тип 2, проявяваща се с когнитивна регресия в детството. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Мичъл Н, Латуш GA, Нелсън Б, Фигероа KP, Уокър RH, Отрезвяване AK. Спиноцеребеларна атаксия 3 с начало в детството: езикова дистония като ранна проява. Тремор Други хиперкинетични Mov 2019; публикувано онлайн на 13 септември.

13 Bird TD. Миотонична дистрофия тип 1. В: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Сиатъл, Вашингтон: Университет на Вашингтон, 2019 г.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Честота на повторни експанзии на SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS и C9orf72 при пациенти с SCA, отрицателни за най-често срещаните подтипове на SCA. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Пълногеномно секвениране на пациенти с редки заболявания в национална здравна система. Природа 2020; 583: 96–102.

16 Ашли EA. Към прецизната медицина. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY и др. Диагностична и клинична полезност на секвенирането на целия геном в кохорта от недиагностицирани китайски семейства с редки заболявания. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Профилиране на целия геномен пейзаж на тандемни повторни разширения. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Откриване на разширения на тандемни повторения в кохорти, секвенирани с данни за секвениране на кратко четене. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Базирана на биоинформатика идентификация на разширени повторения: нереферентно разширение на интронен пентамер в RFC1 причинява CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Варианти на броя на копията в клиничното секвениране на генома: внедряване и интерпретация за рядко и недиагностицирано заболяване. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Откриване в целия геном на тандемни ДНК повторения, които се разширяват при аутизъм. Природа 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Онтологията на човешкия фенотип: инструмент за анотиране и анализиране на човешки наследствени заболявания. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomics England. Модели на клинични данни за състояния на редки заболявания. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (достъп на 4 август 2021 г.).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Откриване на разширения с дълги повторения от данни за последователност на целия геном без PCR. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: базиран на графика на последователността инструмент за анализиране на вариациите в къси тандемни повтарящи се региони. Биоинформатика 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Стандарти и насоки за валидиране на тръбопроводи за биоинформатика за секвениране от следващо поколение: съвместна препоръка на Асоциацията за молекулярна патология и Колежа на американските патолози. J Mol Diagn 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Интегративен преглед на геномиката. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Фенотипна хомогенност на подобно на болестта на Хънтингтън представяне в семейство SCA17. Неврология 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Bird T. Болест на Хънтингтън, подобни на болестта на Хънтингтън и доброкачествена наследствена хорея: какво е новото? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Последните постижения в откриването на повтарящи се разширения със секвениране от следващо поколение за кратко четене. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Биалелното разширяване на интронно повторение в RFC1 е честа причина за атаксия с късно начало. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Разширения на интронични TTTCA и TTTTA повторения при доброкачествена фамилна миоклонична епилепсия при възрастни. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Некодиращи CGG повтарящи се експанзии при заболяване на невронно интрануклеарно включване, окулофарингодистална миопатия и припокриващо се заболяване. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. Бърза диагностика на спиноцеребеларна атаксия 36 в семейство от три поколения, използвайки данни за секвениране на целия геном на кратко. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Дълго прочетено секвениране, възникващо в медицинската генетика. Предна Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Нарушения на повторната експанзия: механизми и терапевтични средства. Neurotherapeutics 2019; 16: 924–27.

38 Национална здравна система. Национален указател за геномни тестове: критерии за тестване за редки и наследствени заболявания. октомври 2021 г.