3D бъбречни органоиди за превод от пейка до легло

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Навин Гупта и др

Резюме

Бъбреците са основни органи, които филтрират кръвта, премахвайки отпадъците от урината, като същевременно поддържат хомеостазата на течности и електролити. Настоящите конвенционални изследователски модели като статични клетъчни култури и животински модели са недостатъчни, за да разберат сложната човешка in vivo ситуация или им липсва транслационна стойност. Да ускорибъбрекизследвания, са необходими нови изследователски инструменти. Последните разработки позволиха насочената диференциация на индуцирани плурипотентни стволови клетки за генериране на бъбречни органоиди.Бъбрекорганоидите наподобяват човешкия бъбрек in vitro и могат да се прилагат в регенеративната медицина и като модели на развитие, токсичност и болести. Въпреки че настоящите проучвания показват големи обещания, остават предизвикателства, включително незрялост, ограничена възпроизводимост и липса на перфузируеми съдови и събирателни канални системи. Този преглед дава общ преглед на сегашното ни разбиране за нефрогенезата, което позволява генерирането на бъбречни органоиди. На следващо място, потенциалните приложения набъбрекорганоидите се обсъждат, последвани от бъдещи перспективи. Този преглед предлага напредъкът в изследването на бъбречните органоиди да бъде улеснен чрез нарастващите ни познания за нефрогенезата и комбинирането на обещаващи техники като модели на орган върху чип.

Ключови думи Органоид на бъбреците. Стволови клетки. Биоинженерство.Нефрон

Щракнете тук, за да получите повече информация за Cistanche за бъбреци

Въведение

Бъбреците са основни органи, които филтрират кръвта, за да генерират метаболитни отпадъци, предназначени за екскреция с урината. Бъбреците имат забележителна пластичност при приспособяване на състава на урината, съпоставяне на приема с екскрецията, за да поддържат хомеостазата на разтворените вещества и баланса на течностите. Тъй като бъбрекът на бозайника е нерегенеративен орган, загубата на функционални единици или нефрони се натрупва с течение на времето при всички индивиди [1]. Системни заболявания с високо разпространение, а именно хипертония и захарен диабет, остър, предизвикан от лекарства или хемодинамичнобъбрекнараняване(AKI) и първичните заболявания на бъбреците са често срещани причини за бърза загуба на бъбречна функция и включват основните причини за хронично бъбречно заболяване (CKD) [2]. ХБН е разделена на етапи въз основа набъбрек дисфункция, което причинява разстройства на разтворените вещества и дисбаланс на течности, отговорни за обширна заболеваемост и смъртност. В САЩ ХБН има докладвано разпространение от 14 процента [3], има годишни разходи за лечение от $120 милиарда [4], влияе отрицателно върху качеството на живот [5] и в напреднал стадий кулминира в краен стадий на бъбречно заболяване ( ESRD), което налага необходимостта от бъбречна заместителна терапия (RRT). Формите на RRT включват диализа и трансплантация, като първата представлява 7 процента от бюджета на Medicare [6], а втората е ограничена от доставката на подходящи органи [7]. ХБН и ESRD представляват голяма тежест за ресурсите и разходите на здравеопазването, както и за пациентите, страдащи от тези заболявания [8].

За справяне с тези тежести са проведени фундаментални и транслационни изследвания в областта набъбрек развитие, тестване за нефротоксичност, моделиране на заболяване и бъбречна регенеративна медицина. Традиционните изследователски инструменти се състоят от in vitro клетъчна култура, както от изолирани първични бъбречни клетки, така и от вирусно трансформирани обезсмъртени клетъчни линии, и in vivo животински модели. Въпреки че тези общи модели са били използвани за изследване на физиологията и патологията на бъбреците с известен успех, те имат присъщи ограничения, които могат да допринесат за лошия превод на лабораторните изследвания в клинична терапия [9]. In vitro моделите са до голяма степен ограничени до анализа на едноклетъчни типове, като се игнорират ефектите от междуклетъчните и екологични взаимодействия в рамките на сложна хетерогенна тъкан, като например бъбрека. Животинските модели, макар и интегриращи телесните системи, са ограничени от междувидовите различия, което води до неверни заключения, които идват с висока цена на време и разходи [10]. Новите методи за експериментиране с човешки клетки и тъкани са необходимост за преодоляване на ограниченията на традиционните изследователски техники [11].

Тъй като необходимостта е майката на иновациите, напредъкът в протоколите, използващи човешки плурипотентни стволови клетки (hPSCs), генерира сложна триизмерна, многоклетъчна и органоспецифична тъкан, наречена органоиди. Черен дроб, бял дроб, сърце, черва и бъбречни органоиди позволяват експериментиране в човешки тъкани in vitro [12]. На теория, тъканите, които съставляват цялата човешка сома, могат да бъдат възпроизведени в мащаб, по силата на hPSCs, определящи характеристиките на плурипотентност и самообновяване. Двата типа hPSCs са човешки ембрионални стволови клетки (ESCs) и човешки индуцирани плурипотентни стволови клетки (iPSCs). През 1998 г. Thomson et al. първи описва генерирането на ESC линии, получени от човешки бластоцисти. За да заобиколят споровете, свързани с ембрионалния произход на ESC, през 2006 г. Takahashi et al. описва революционен метод за индуциране на плурипотентност в терминално диференцирани соматични клетки. Наречени iPSCs, тези клетки се образуват чрез транскрипционното активиране на факторите Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) [13]. Освен че избягват етични проблеми, iPSC допълнително позволяват персонализирани медицински подходи. iPSC представляват неограничен запас от клетки, които са изогенни за тяхната родителска соматична клетка [13]. Специфични за пациента iPSC с естествено възникващи мутации могат да се използват за генериране на клинично значими модели на заболяване в човешка тъкан, особено при условия, за които не съществува животински модел. В модели на наследствени заболявания, коригираните с геном контроли могат да установят пряка връзка между генотипа и фенотипа [14]. Подходите на имунокомпетентната регенеративна медицина могат да използват обемна, органоспецифична тъкан, генерирана от iPSCs на пациента, отричайки необходимостта от имуносупресия и заобикаляйки недостига на трансплантируеми органи [15]. Използването на транслационната полезност на hPSCs, особено iPSCs, може да революционизира областите на разработване на лекарства и трансплантация на органи, което води до драматични резултати за човешкото здраве и болести.

Способността на hPSCs да възстановяват всички клетки на тялото представлява голямо предизвикателство, по-специално как да се контролира диференциацията към специфични видове клетки и тъкани, които представляват интерес. Органогенезата при бозайниците служи като архетип за насочена диференциация, ефективната последователна индукция на междинни клетъчни типове, които се появяват по време на развитието на органи [16]. Обратно, директното препрограмиране включва индуцирането на специфични за клетъчния тип транскрипционни фактори, заобикаляйки междинните типове клетки по време на превръщането на соматична клетка към определена целева популация. Докато се възползва от по-проста методология, директното препрограмиране често води до непълно преобразуване в целевата клетка поради профила на метилиране на ДНК и епигенетиката на родителската клетка [17]. Дори ако е настъпило директно препрограмиране с пълно преобразуване, резултатът вероятно ще бъде еднаква клетъчна популация [18]. По отношение на бъбрека повече от дузина различни типове клетки допринасят за структурата и функцията на нефрона in vivo. Възстановяването на нефрон би наложило директно препрограмиране до общ предшественик на всички допринасящи клетъчни типове, а именно нефронови прогениторни клетки, ендотелни прогениторни клетки и стромални прогениторни клетки [19]. Необходимият подход за развитие на тъкан, подобна на естествения бъбрек, е насочена диференциация, метод, основан на задълбочено познаване на развитието на бъбреците. В този преглед ние подчертаваме съществената роля, която биологията на развитието на бъбреците е изиграла в генерирането на бъбречни органоиди, получени от hPSC, коментираме накратко приложенията на бъбречната органоидна технология и обсъждаме бъдещи насоки, които се занимават с настоящите ограничения и предизвикателства пред клиничния превод.

Развитие на бъбреците

Развитието на бъбреците служи като златен стандарт за насочена диференциация, за да се произведе in vitro тъкан, най-биоподобна на своя in vivo аналог. Десетилетия проучвания на развитието в модели на бозайници разкриха, че пътищата Wnt, FGF, ретиноева киселина и TGF-/BMP управляват морфогенезата, тъканното моделиране и индуцирането на органни примордии [12]. Тези пътища са от решаващо значение за итеративното развитие на тъканите през 3-те зародишни слоя, включително бъбрека, получен от мезодермата. Мезодермата, притисната между ендодермалните и ектодермалните слоеве, е моделирана от гаструлацията на hPSCs (предни епибласти) през примитивната ивица, преходна структура, която определя предно-задната и медиално-латералната ос на развиващия се ембрион [12]. Предно-задната ос на мезодермата се определя от продължителността на инволюция през примитивната ивица с временно излагане на Wnt сигнализация, тъй като hPSCs, които еволюират през примитивната ивица, мигрират отпред, за да допринесат първоначално за предните структури, запълвайки се отзад след това [1]. Медиално-латералната ос на мезодермата се определя от рострокаудален BMP градиент в примитивната ивица, тъй като hPSCs, подложени на гаструлация през ростралната примитивна ивица (ниска BMP активност) стават параксиална мезодерма, през средната примитивна ивица (умерена BMP активност) стават междинна мезодерма (IM) и чрез каудална примитивна ивица (висока BMP активност) се превръща в мезодерма на латерална пластина [20, 21]. В примитивната ивица продължителността на Wnt сигнала и степента на BMP сигнала са основни детерминанти на моделирането в мезодермалния зародишен слой.

В развитието на бъбреците на бозайниците има 3 нефрични стадия, пронефрос, мезонефрос и метанефрос, които всички произлизат от мезодермата. Проучвания при мишки разкриват, че метанефросът, който продължава като бъбрек на възрастен, е получен от реципрочната индукция на две тъкани, получени от IM, метанефричния мезенхим (MM) и уретерната пъпка (UB) [22]. ММ е съставен от нефронни прогениторни клетки (NPC), осеяни със стромални клетки, докато UB се образува като остатък, изпъкнал от Волфовия канал, дегенеративна структура, която дренира примитивния мезонефрос към клоаката [23]. Концентрираните NPC на мезенхима на капачката на ММ претърпяват прогресивна морфогенеза от тела с форма на запетая до S-образни тела, които сегментно се диференцират в съседни епителни структури, включващи нефрона, а именно подоцити, проксимални тубули, бримка на Хенле, дистални тубули и свързващи тубули [ 24–27]. Свързващите тубули на отделните нефрони се събират в разклонена събирателна система, получена от UB, след реципрочна индукция между двете тъкани [28]. UB-получено Wnt сигнализиране катализира прехода от мезенхим към епител (MET) на NPCs към нефронов епител [29], докато MM-получени GDNF сигнали през Ret/GFRA1 комплекса управляват разклоняващата се морфогенеза [30] (Фиг. 1).

Фиг. 1 Развитието на човешкия бъбрек от примитивната жилка до зрял нефрон. [1] Примитивната ивица (PS) води до мезодермата и впоследствие до междинната мезодерма (IM), от която задната IM (PIM) и предната IM (aIM) могат да бъдат разграничени по време на ранна гаструлация. [2] Метанефричният мезенхим (MM), който включва нефронни прогениторни клетки (NPC) и стромални клетки, се образува от PIM, докато aIM образува Волфовия канал, от който се развива уретерната пъпка (UB). UB започва да се разклонява с NPC, стромални прогениторни клетки (SPC) и ендотелни прогениторни клетки (EPC). На този етап васкулатурата не прониква в популациите на NPC. [3] След това NPC развиват бъбречни везикули, които образуват тяло с форма на запетая, последвано от s-образно тяло. В крайна сметка тази структура се свързва с UB и се превръща в зрял нефрон. Кръвта се филтрира в гломерула (сив), който придвижва ултрафилтрата към събирателния тубул (жълт) през проксималния тубул (оранжев), бримка на Хенле (син) и дисталния тубул (зелен). Дадени са маркери, съответстващи на всяка структура.

Голям пробив в нашето разбиране за развитието на бъбреците се случи през 2014 г., когато Taguchi et al. неочаквано откриха, че предшествениците на T плюс MM се различават в развитието си от предшествениците Osr1 плюс UB [31], използвайки техники за проследяване на родословието, отбелязвайки, че предишна работа предполага общо потекло в Osr1 плюс IM без допълнително очертаване [22]. В гореспоменатото изследване беше използвана Osr1-GFP мишка, за да се определи, че Osr1 се експресира в различно време и на различни места в нефричната зона на IM. Чрез хистологичен анализ и сортиране/реагрегиране на OSR1-GFP плюс клетки на различни етапи на развитие, авторите успяха да демонстрират, че предният IM допринася за мезонефроса, мезонефралния канал (Wolffian duct) и уретерната пъпка (изпъкналост на Волфов канал), докато задният IM съдържа Six2 плюс Sall1 плюс NPC на MM, които се диференцират в епителните клетки на нефрона. Определянето, че MM произлиза от задния IM, а UB от предния IM, заедно с експресията на характерен маркер, предоставя пътна карта за специфичната индукция на специфичните за бъбреците родословия и е позволила насочени протоколи за диференциация за ефективно индуциране на нефрон, получен от MM епител без замърсяване с други IM производни. Важно е, че историческите изследвания приемат, че развитието на бъбреците на мишката отразява човешката нефрогенеза. Сравнявайки развитието на човешки и миши бъбрек, последните проучвания изясниха както конвергентни, така и дивергентни характеристики, включително образуване на лобове, организация на прогениторни ниши и експресия на предполагаеми маркери, определящи клетъчния тип [32]. В такива проучвания данните за човешки бъбрек са получени от постсмъртна ембрионална тъкан, което позволява прозрения, а не експерименти. Появата на бъбречни органоиди, получени от hPSC, позволява тествани хипотези в развитието на човешки бъбрек, сред транслационни приложения.

3D бъбречни органоиди

Последните разработки позволиха образуването на бъбречни органоиди от индуцирани от човека плурипотентни стволови клетки (hiPCS) чрез насочена диференциация [33], генерирайки нова транслационна платформа за разработване на лекарства и техники за регенеративна медицина. Органоидите са мини in vitro органи, които се самоорганизират от (стволови) клетки в 3D микросреди. Те показват голямо сходство с техните in vivo аналози по отношение на тъканна морфология, брой клетки, пролиферация и диференциация [34].

След очертаване на различния произход на MM и UB по време на развитието на бъбреците на бозайници и работа назад в поетапен подход за идентифициране на междинни етапи и тяхната характерна маркерна експресия, Taguchi et al. установи насочени протоколи за диференциация за ММ както в миши, така и в човешки PSC [31]. По-конкретно, ембриоидни тела, образувани от OCT3/4 плюс SOX2 плюс hPSCs, бяха подложени на разширено Wnt и BMP4 сигнализиране, за да индуцират T плюс CDX2 плюс зараждаща се мезодерма, която е предназначена да допринесе за клетките на задната зараждаща се мезодерма. Медиално-латералната ос на мезодермата беше насочена към WT1 плюс HOXD11 плюс OSR1 плюс заден IM чрез едновременно лечение с BMP4, активин и ретиноева киселина. След това бяха използвани ниски Wnt и FGF9 за подпомагане на развитието на OSR1 плюс SIX2 плюс SALL1 плюс WT1 плюс NPC, с отчетена ефективност на индукция от ~62 процента. Докато NPC са генерирани както от миши, така и от човешки PSC, кокултурата с миши ембрионален гръбначен мозък е необходима за по-нататъшното им диференциране в проксимални тубули, дистални тубули и клъстери на подоцити.

Използвайки както hESCs, така и hiPSCs в монослойна култура, Morizane et al. описва протокол за насочена диференциация, който индуцира SIX2 плюс SALL1 плюс WT1 плюс NPC с до 90 процента ефективност чрез дни на диференциация 8-9. Накратко, разширеното Wnt сигнализиране индуцира късна примитивна ивица, която беше подложена на активин, за да образува PIM, който се диференцира в NPC в отговор на FGF9. След това NPC се агрегират в триизмерна суспензионна култура чрез центрофугиране, подложени на преходен CHIR99021 (CHIR) импулс за симулиране на UB-получено Wnt сигнализиране за катализиране на MET в NPC и продължават да бъдат подложени на FGF9 за разширяване и поддържане на стеблото на NPC ниша [35]. След CHIR импулса, ММ преминава към PAX8 плюс LHX1 плюс перитубуларен агрегат, който допълнително се диференцира в LAM1 плюс бъбречен везикул до 14-ия ден на диференциация. При стохастична диференциация (т.е. без допълнителни фактори), бъбречните везикули се самомоделират в подобни на нефрон структури, състоящи се от съседни епители, които носят множество маркери за всеки от подоцитите (NPHS1 плюс PODXL плюс), проксималните тубули (LTL плюс), бримката на Хенле (CDH1 плюс UMOD плюс), дисталните тубули (CDH1 плюс UMOD−) и свързващите тубули ( CDH1 плюс AQP2 плюс ) [36].

Freedman и др. са използвали различен подход за създаване на опростен протокол за получаване на бъбречни органоиди. Тук авторите са използвали сандвич Matrigel метод, за да осигурят 3D микросреда за hPSC, за да образуват сфероиди, заобикалящи кухи, подобни на амниотични кухини [37]. Чрез насочена диференциация тези сфероиди се стимулират да се превърнат в бъбречни органоиди с двуетапен протокол. Образуваните сфероиди бяха третирани с CHIR в продължение на 1,5 дни, последвано от излагане на B27-допълнена среда. На 10-ия ден се образуват извити, полупрозрачни, тубулни органоиди след прехода от мезенхим към епител. Такато и др. са идентифицирали характеристики на развитието както на събирателния канал, така и на прогениторите на бъбречния мезенхим [38]. Тук авторите са използвали тази информация, за да индуцират метанефричен (срещу мезонефричен) мезенхим и уретичен епител чрез 4 дни експозиция на CHIR, последвана от 3 дни експозиция на FGF9. След това агрегатите се култивират в продължение на 20 дни, позволявайки да се образуват органоиди, които съответстват на бъбрек от първия триместър. Авторите твърдят наличието на събирателния канал чрез наличието на GATA3 и ECAD маркери. Въпреки това, по-късно това беше оценено като ненадеждно, тъй като дисталните и събирателните тубули, получени от ММ, също могат да експресират тези маркери [39, 40] (фиг. 2).

Фиг. 2 Насочени протоколи за диференциация за генериране на човешки индуцирани плурипотентни бъбречни органоиди, получени от стволови клетки. Визуализират се приликите и разликите между четирите протокола за генериране на човешки бъбречни органоиди. Всеки визуализиран протокол включва времевата скала в дни, етапа на развитие на органоидите и допълнителните фактори за стимулиране на насочената диференциация и съзряването на органоидите. Протоколите на Taguchi et al. и Takasato et al. доведе до органоиди върху мембраните Transwell. Morizane и др. позволява генерирането на бъбречни органоиди в 96-плаки с ямки и Freedman et al. в подход сандвич Matrigel

След като горните четири насочени протокола за диференциация бяха публикувани през 2015 г., множество групи следваха подобен подход за последователно преобразуване на hPSCs в късна примитивна ивица, PIM, MM, перитубуларен агрегат, бъбречни везикули и в крайна сметка бъбречни органоиди [41–44]. Wu и др. извършиха едноклетъчен транскриптомичен анализ като сравнителен анализ между протоколите Morizane и Takasato, както един срещу друг, така и срещу човешки фетален бъбрек (16 гестационна седмица) и бъбрек на възрастен човек (62-годишен мъж с нормалнобъбрекфункция). Когато се оценяват при статични условия на 26-ия ден на диференциация, и двата протокола генерират незряла тъкан, всяка експресираща ~ 20 процента от транскрипционните фактори на проксималните тубули и подоцити за възрастни [41]. Въпреки това, Tran et al. използваха едноклетъчна транскриптомия върху органоиди на бъбреците, разработени с помощта на протокола Morizane, за да подкрепят приложението на подоцити, получени от органоиди, за моделиране на заболяване и възстановяване на филтрационната функция. Подоцитите от органоидите споделят силно сходни, прогресивни транскрипционни профили с човешки фетални бъбреци и набрана васкулатура на гостоприемника при трансплантация, за да насърчат по-нататъшно съзряване [42]. Garreta и др. откриха, че транскрипционният профил на бъбречни органоиди е разширен до този на човешки фетални бъбреци от втория триместър до 16-ия ден на диференциация чрез използване на мек хидрогел за удължаване на продължителността на 3D микросреда, за да се улеснят взаимодействията клетка-клетка и клетка-матрикс [44] . Следвайки подобен протокол за диференциация, Low et al. извършено едноклетъчно РНК секвениране (RNAseq), което идентифицира подгрупа от нефронни прогениторни клетки като потенциален източник на бъбречната васкулатура, което се различава от проучвания при развитие на мишки, демонстриращи източника като FLK1 плюс ендотелни прогениторни клетки, които са различни от NPC на MM [45] и отчасти произлизат от FOXD1 стромални прогениторни клетки [46]. И все пак, други основни открития включват, че сигнализирането на Wnt управлява васкуларизацията и съотношението на проксималните спрямо дисталните сегменти на нефрона, функционалното съзряване на органоидите след имплантиране и моделирането на автозомно рецесивно поликистозно бъбречно заболяване (ARPKD), използвайки iPSCs, получени от пациента [43].

Транслационна полезност на бъбречните органоиди

Като цяло, настоящите изследователски модели за изследване на болести или съединения често са ограничени до клетъчни изследвания и животински модели. Клетъчните модели са лесни за използване и могат да се прилагат в голям брой. Въпреки това, те често включват едноклетъчни линии и не могат да обхванат сложността на човешките in vivo бъбреци, като 3D микросредата и присъстващите множество клетки. Следователно клетъчните модели не са в състояние да имитират in vivo 3D тъканната морфология и хетерогенната и сложна микросреда. За да се отчете сложната среда in vivo, животински модели като мишки са конвенционален изследователски модел. Тези модели обаче са слабо преносими към човешки условия [47, 48]. Също така, етичните опасения относно използването на животни за изследователски цели се увеличават [49, 50]

Следователно са необходими нови модели, които могат да имитират по-точно човешката in vivo ситуация [51].

Органоидите имат потенциала да преодолеят тези ограничения поради тяхната уникална способност да имитират in vivo ситуацията на хората. И тъй като органоидите се извличат от hiPSC, те могат да се използват и за персонализирана медицина. Например, някои (комбинации от) съединения могат да бъдат тествани с органоидите, получени от клетки на конкретно лице, за да се тества за токсичност или ефикасност. Освен това са възможни по-мащабни приложения. Например, органоидите могат да се използват като предклинични модели за определяне на характеристиките на определени съединения. Освен това, надеждни модели на човешки заболявания могат да се използват в клинични изпитвания за ускоряване на разработването на лечения за особено редки заболявания, за които пациентите са оскъдни.

Въпреки че са необходими повече подобрения, за да се създадат напълно функциониращи бъбреци in vitro, проучванията до момента показват голямо обещание. Някои проучвания вече показват приложения на бъбречните органоиди, каквито са днес. Тези постижения в органоидите на бъбреците позволяват (бъдещо) приложение за регенеративна медицина и като модели на развитие, токсичност и болести. Сред тези транслационни приложения, органоидите също се считат за потенциални методи за прилагане на регенеративна медицина за създаване на биоинженерни бъбреци за въвеждане на алтернативни терапии на диализата и бъбречната трансплантация (фиг. 3). Тъй като многобройни рецензии съобщават за публикувани транслационни приложения на бъбречни органоиди [1, 52–59], този преглед се фокусира върху бъдещото поколение бъбречна тъкан, получена от стволови клетки, която е хистологично биоподобна на естествения човешки бъбрек, за да улесни транслацията на изследване на бъбречни органоиди към повлияване на клиничните грижи.

Настоящи предизвикателства и бъдещи перспективи

Бъбреците са силно васкуларизиран орган, който колективно получава 20 процента от сърдечния дебит, като филтрира до 180 l кръв на ден [60]. Деветнадесет километра гломерулни капиляри с повърхностна площ ~ 6000 cm2 допринасят за гломерулната филтрационна бариера (GFB) [61]. Съставните части на GFB са фенестрирани гломерулни капиляри, отрицателно заредена гломерулна базална мембрана и подоцити, показващи нарязани диафрагми между процесите на краката [61]. Структурата на GFB поражда неговата функция, филтриране на кръвта въз основа на размера и заряда на разтворените вещества. Примитивната урина, образувана от гломерулна филтрация, навлиза в тубулите на нефрона, където се обработва чрез абсорбционни и секреторни механизми. От до 180 l филтрат, ~ 99 процента се абсорбират, като само 1–2 l са предназначени за екскреция с урината при нормални условия. Като се има предвид значителна обемна резорбция в перитубулните капиляри, не е изненадващо, че множество нефрони се оттичат към общи събирателни канали, които се събират в бъбречното легенче, за да образуват единични уретери. Цялостната структура, от обширната васкуларизация на проксималния нефрон до широко разпространената комуникация между тубулен епител и перитубуларно капилярно легло до арборизиран дренаж на дисталния нефрон, играе критична роля за бъбречната функция. Бъбреците поддържат относително необходимата функция дори когато капацитетът им намалее до 20 процента, като много от тези пациенти остават безсимптомни. Въпреки това, намаленията до под 15 процента често се превръщат в необходимост от RRT [62, 63]. NPC с регенеративни способности се губят при хората преди раждането и следователно нефроните не могат да се обновяват. Понастоящем няма налични терапии за възстановяване на загубената бъбречна функция, така че има голямо търсене на приложения за регенеративна медицина. Освен това се изисква GFB за моделиране на заболявания, които засягат филтрацията, функционалния тубулен транспорт, необходим за голямо разнообразие от тестове за токсичност и моделиране на заболявания, и комбинацията от получени от ММ нефрони с получени от UB събирателни канали, необходими за моделиране на повечето вродени аномалии на бъбрека и пикочните пътища (CAKUT) [64]. Развитието на организирана бъбречна васкулатура и разклонена събирателна система биха представлявали значителни транслационни скокове в технологията на бъбречните органоиди.

Васкуларизация на бъбречни органоиди

Васкуларизацията на бъбрека включва два различни процеса: васкулогенеза и ангиогенеза [65]. При васкулогенезата сглобяването на васкулатурата се случва de novo, докато ангиогенезата включва разклоняване или разширяване на вече съществуващи съдове. Взаимодействието между тези два процеса по време на нефрогенезата остава неизвестно, но васкулогенните бъбречни микросъдове могат да предшестват развитието на ангиогенната бъбречна артерия [65]. При мишки ММ няма васкулатура по време на инвазия на уретични пъпки, но развива богата капилярна мрежа до следващия ден с последващо образуване на васкуларизирани гломерули. Последният се реализира от ендотелни клетки, които нахлуват във васкуларната цепнатина, за да образуват гломерули в стадий на единична капилярна бримка [66–68]. Междувременно васкулогенният FLK1 плюс ендотелните прогениторни клетки, разпръснати в ММ, допринасят за богатата гломерулна капилярна мрежа [69]. Подобно на подходите за насочена диференциация за формиране на ММ ex vivo, васкуларизацията на бъбречна тъкан, получена от hPSC, трябва да следва нейния ембрионален произход, за да развие шаблонната, йерархична бъбречна съдова мрежа.

Установено е, че 3D бъбречни органоиди, разработени от първоначалните протоколи за ММ, получени от PIM, съдържат васкуларни клетки; обаче гломерулите остават до голяма степен аваскуларни и общото изобилие от кръвоносни съдове е слабо в сравнение с естествената бъбречна тъкан [70]. Важно е, че тези васкулогенни сглобки на кръвоносни съдове имитират ранното образуване на микросъдове в развитиетобъбректъкан, възникващи преди ангиогенна инвазия на бъбречната артерия [65]. В своята основна работа Taguchi et al. трансплантираха своя индуциран миши ММ в мишки, с ангиогенна васкулатура, получена от гостоприемника, водеща до увеличени гломерулни капиляри. WT1 плюс подоцитни клъстери, ко-локализирани с PECAM1 плюс съдове, за които е установено, че съдържат червени кръвни клетки на гостоприемника при изображения [31]. Подобна субкапсуларна трансплантация на бъбречни органоиди е повторена, демонстрирайки, че васкулатурата в гломерулите на органоидите трайно произлиза от гостоприемника и образуването на ранна гломерулна базална мембрана, състояща се от фенестрирани ендотелни клетки и процеси на подоцитно краче [71]. Малка степен на гломерулна филтрация се твърди при подкожна трансплантация на бъбречни органоиди въз основа на вътреклетъчно откриване в тубули на системно прилагани флуоресцентни декстрани, взети за означаване на поглъщане от гломерулния филтрат [72]; въпреки това не може да се изключи апикално поглъщане, което се осъществява от липсата на плътни връзки в цялата капсула на Bowman с проксималния тубул или базолатерално поемане чрез тубулни фагоцитни механизми [73]. Въз основа на тяхната работа, при която бъбречните органоиди, трансплантирани под бъбречната капсула, се васкуларизират от гостоприемника и демонстрират гломерулно и тубулно съзряване [71], наскоро van den Berg et al. разработиха елегантна in vivo система, използваща мултифотонно изображение с висока разделителна способност, за да демонстрира селективно по размер гломерулно пресяване [74]. Трябва да се отбележи, че васкуларизираните гломерули, образувани от междувидова химерна тъкан, не успяват да преодолеят ограниченията, свързани с продължаващата зависимост от животинските системи, включително разликите в развитието и физиологията между видовете, значителна загуба за персонализирани медицински подходи, ниска производителност и висока цена.

Васкуларизацията на бъбречните органоиди е постигната in vitro, с резултати, подобни на тези, докладвани при експерименти с трансплантация. Чрез съчетаване на бъбречни органоиди и бъбречни технологии на чип за рекапитулация на флуидната микросреда in vivo, Homan и Gupta et al. установяват, че флуидният стрес на срязване, приложен към вградени бъбречни органоиди върху чип, улеснява образуването на перфузируеми съдови мрежи, разработени от експанзията и диференциацията на ко-индуцирани ендотелни прогениторни клетки. Освен това, авторите демонстрират повишена полярност и съзряване на тубулни епителни клетки и подоцити, които проявяват процеси на краката, които се допират до гломерулни капиляри, за да образуват примитивен GBM [70, 75]. Въпреки че органоидите на бъбреците са били свръхконфузирани, за разлика от потока, ограничен до васкулатурата, прилагането на флуиден стрес на срязване върху цели органоиди симулира интерстициалния поток, генериран от изместване на течности в отделения по време на реабсорбция на ~ 99 процента от гломерулния филтрат. С други думи, ~ 99 процента от обема в тубулните лумени се предава през интерстициума и се реабсорбира от перитубулните капиляри in vivo. Докато перфузируемата васкулатура беше демонстрирана с помощта на флуоресцентни сонди, гломерулната филтрация не беше подкрепена от откриването на флуоресценция в тубулните лумени поради използването на перли с диаметър 500 nm, като се отбележи, че средният диаметър на фенестрациите в гломерулните капиляри е ~ 70 nm [ 76]. Трябва да се отбележи, че цялата васкулатура в системата е получена от органоидите на бъбреците без ангиогенна инвазия.

Методите за преодоляване на настоящите предизвикателства включват свързване на ангиогенни съдови мрежи in vitro с васкулогенни бъбречни органоиди, за да се позволи узряването на GBM с функционална гломерулна филтрация. Съществуват множество правдоподобни причини, поради които все още не е настъпила окончателна гломерулна филтрация при подходите на бъбречни органоиди върху чип, включително липса на надлъжно експериментиране, ограничено хидростатично налягане, предавано в гломерулните капиляри, незрялост на епитела на нефрона и потенциала за съществена циркулация фактори, улесняващи ембрионалното развитие на бъбреците. Директно перфузируеми ангиогенни съдови мрежи in vitro са описани по-рано, които са способни да поддържат дебела тъкан или да нахлуват в вградени клетъчни конструкции върху чипа [77, 78]. Такава васкулатура може да анастомозира с микросъдове, получени от органоиди, за да ограничи перфузията до съдовото отделение, което позволява предаването на значително хидростатично налягане към гломерулните капиляри. Други ограничения могат да бъдат адресирани чрез използване на надлъжни изследвания, перфузия с ембрионален серум и използване на оптимални органоиди за деня на диференциация (повлияващи зрелостта) в такива устройства. Ако ангиогенната съдова мрежа беше съставена от човешки клетки, тогава ограниченията, свързани с междувидовите различия, биха били заобиколени. По същия начин, използването на кръвоносни съдове, получени от hPSC, както е описано [79], би улеснило персонализираните медицински подходи както за разработване на лекарства, така и за стратегии за регенеративна медицина.

Образуване на уретерна пъпка

Производството на гломеруларен ултрафилтрат ex vivo би представлявало забележително откритие за улесняване на транслационните приложения на бъбречна тъкан, получена от стволови клетки, но все пак ще е необходима събирателна система за последващ дренаж. Дихотомно разклонена мрежа от събирателни канали конвергира продукцията на ~ 1 милион нефрони на отделен бъбрек към един уретер [60]. Събирателните канали не само транспортират филтрата, но също така участват в реабсорбцията на вода и електролитния баланс чрез различни транспортери и канали в различните видове тубулни епителни клетки. Събирателните канали са продукт на разклонена морфогенеза на уретерната пъпка, която се контролира от различни молекулярни сигнали, които могат да бъдат използвани in vitro за имитиране на този процес, включително FGF, GDNF/RET и Wnt сигнални пътища [68].

Проучванията за развитие на бъбреците, използващи микродисектирани мишки MM и UB, дават значителна представа за ранното формиране на това, което ще представлява бъбрекът на възрастен човек. Неиндуцираната ММ, отделена от епителните структури на UB, предотвратява съзряването на всяка тъкан. Въпреки това, съвместното култивиране на MM и UB ex vivo е в състояние да възстанови мишия бъбрек, което предполага, че тези прекурсорни популации на бъбреците притежават самостоятелна програма, достатъчна за стимулиране на органогенезата на бъбреците [80]. От гледна точка на развитието, оптималният метод за развитие на функционална бъбречна тъкан от hPSCs in vitro вероятно ще включва отделно индуциране на MM и UB с висока ефективност и кокултура на двете отделни популации.

Описаните по-рано протоколи за диференциация генерират предимно ММ, предназначени да станат нефронови структури. Насочената диференциация към събиране на канални прогениторни клетки на UB беше публикувана за първи път през 2013 г., преди Taguchi да очертае различния IM произход на MM и UB. Xia и др. преобразуват hPSCs в мезодермално ангажирана тъкан, използвайки FGF2 и BMP4 за 2 дни, след което индуцират UB прогениторни клетки, използвайки комбинация от активин, BMP2 и ретиноева киселина за 2 допълнителни дни в двуетапен протокол за диференциация [81, 82]. UB прогениторни клетки, получени от hPSC, се самосглобяват в междувидова химерна тъкан, когато се комбинират с ембрионална миша ММ. През 2017 г., чрез анализиране на профили на генна експресия по време на развитие на пъпка на уретера в миши ембриони, Taguchi et al. са създали протокол за включване както на MM, така и на UB тъкан в органоидите на бъбреците, използвайки миши ESCs (mESCs) [83]. Този протокол се основава на FACS-сортиране CXCR4 плюс KIT плюс предшественици на Wolffian duct. Съвместното култивиране на предшественици на Wolffian канал с mESC-получен MM изисква присъствието на стромални прогениторни клетки за образуване на повторно сглобени органоиди, които са претърпели органогенеза от по-висок порядък, за да образуват нефрони, свързани помежду си от разклонен уретерен епител. В крайна сметка констатациите не са възпроизведени в получени от hPSCs MM и UB поради преждевременно спиране на разклоняването на UB, което според авторите може да се дължи на липсата на стромален прогениторен пул [83]. Установяването на насочена диференциация към човешки бъбречни стромални прогенитори и увеличен достъп до първични човешки фетални бъбречни тъкани може да различи причината за докладваната непълна морфогенеза на разклоняване. И все пак, може да има ограничения в ефективността на индукция на необходимия клетъчен тип, а именно, пролифериращи клетки Ret плюс UB върха, които са отговорни за разклоняването и образуването на структурна връзка със свързващите тубули на дисталните нефрони [84].

Има недостиг на насочени протоколи за диференциация на hPSC към UB и неговите производни, като публикуваните протоколи демонстрират ограничения. Необходими са подобрени протоколи, за да се позволи добавянето на мрежа от събирателни канали, която да обхваща всички бъбречни органоиди, съдържащи нефрон. Аналогично на максимизирането на ефективността на индукция за NPC, базирано на SIX2 експресия, максимизирането на ефективността на индукция за UB клетки на върха на базата на Ret експресия е една такава стратегия. За тази цел е необходимо разбиране на развитието на бъбреците. По-специално, UB се формира като изпъкналост на Волфовия канал (известен още като мезонефричен канал), който се генерира от каудалната миграция на предните IM клетки надолу по урогениталния синус към клоаката, като се отбелязва, че тези клетки претърпяват MET по пътя. Заобикалящият произход на UB представлява предизвикателство за създаването на стабилен протокол за насочена диференциация. Въпреки това, Ret-експресиращите мезенхимни клетки, присъстващи в aIM, са в състояние да допринесат за UB [84], така че 3-етапният протокол може да преобразува hPSCs в ранна примитивна ивица (стъпка 1), след това в aIM (стъпка 2) , след това Ret плюс клетки с върха на UB (стъпка 3). По-специално, клетъчното хранилище на консорциума ReBuilding a Kidney (RBK) на NIH включва репортерска линия Ret

Заключение

Бъбрекът е забележителен орган, който освен всичко друго регулира водната и електролитната хомеостаза в тялото. Нарушаването на регулацията на тези процеси може да доведе до сериозни здравословни усложнения с голямо обществено и икономическо бреме. Чрез нашето разбиране за човешката нефрогенеза in vivo, ние хвърлихме светлина върху повторната капитулация на този процес in vitro. Текущият напредък позволи генерирането на извлечени от hiPSC бъбречни органоиди. Тези бъбречни органоиди наподобяват човешкия бъбрек и осигуряват допълнителни предимства в сравнение с конвенционалните изследователски модели. Прилагането на бъбречни органоиди включва регенеративна медицина и модели на развитие, токсичност и заболявания. Въпреки напредъка през последните години, бъбречните органоиди изискват подобрени протоколи и модификации към съзряване на тъкани, перфузируема васкулатура и интеграция на събирателна система. На следващо място, тези системи трябва да са подходящи, за да предоставят допълнителна стойност на конвенционалните модели за изследване на клетки и животни или дори да ги заменят. Подобряването на протоколите за генериране на органоиди чрез нашите нарастващи познания за развитието на бъбреците, съчетано с възприемането на технологията орган върху чип, може да улесни и ускори превода на 3D бъбречни органоиди към клинична употреба.

От: „3D бъбречни органоиди за превод от пейка до легло“ отНавин Гупта и др

---J Mol Med (2021) 99:477–487