13-седмично изследване за субхронична токсичност на 2-(l-ментокси)етанол при F344 плъхове

Въведение

2-(1-ментокси)етанол (CAS № 38618-23-4) е бистра и безцветна течност с характерна миризма и се използва широко като ароматизиращ агент. Съвместният експертен комитет на ФАО/СЗО по хранителните добавки (JECFA) оцени 2-(1-метокси)етанол като ароматизиращ агент, категоризиран като вещества, структурно свързани с ментола1. Въз основа на структурния клас на ароматичните агенти, 2-(1-метокси)етанолът беше причислен към клас I. В Съединените щати и Европа нивата на прием на 2-(1-метокси)етанол от хора се оценява съответно на 12 ug/човек/ден и 0.01 ug/човек/ден, като и двете са под прага за клас I от 1800 ug/човек/ден. Въз основа на тези оценки се счита, че 2-(1-ментокси)етанолът може да не представлява проблем за безопасността при рутинна употреба като ароматизиращ агент.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg телесно тегло [ТТ])1. Въпреки използването на 2-(1-ментокси)етанол като ароматизиращ агент, има ограничени данни относно токсичността при многократно прилагане на това съединение. Нашата лаборатория е изследвала токсичността на няколко хранителни добавки, включително представителни ароматизатори от всяка категория, в модели на гризачи2–7. За да изясним токсикологичния профил и да установим ниво без наблюдавани неблагоприятни ефекти (NOAEL), проведохме 13-седмично проучване за субхронична токсичност на 2-(1-ментокси)етанол, което беше перорално приложен на F344 плъхове чрез сонда.

Материали и методи

Тестван химикал

2-(1-ментокси)етанол (Партида № 5I0002, чистота 99,9%), произведен от Takasago Int. Corp. (Токио, Япония) е осигурено от Отдела за стандарти и оценка, Департамент за безопасност на храните, Министерство на здравеопазването, труда и социалните грижи, Япония, с подкрепата на Японската асоциация за вкусови и ароматни материали (Токио, Япония). Въпреки че изпитваното вещество е предоставено като смес от оптични изомери (CAS № 38618-23-4), то е потвърдено като l-енантиомер (CAS № 75443-64-0) ​​от производителя. Орална сонда с царевично масло (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония) като носител беше избрана като път на приложение поради неразтворимостта във вода и летливостта на 2-(1-ментокси)етанола. Разтвори на 2-(1-ментокси)етанол се приготвят ежедневно, непосредствено преди приложение. След съхранение в продължение на 2 часа при стайна температура, остатъчните съотношения на 2-(1-ментокси) етанол в 4, 40 и 400 mg/mL разтвор се потвърждават като 96,8%, 99,8% и 96,5% , съответно, чрез газова хроматография (Японската инспекционна асоциация на околната среда на храните и хранително-вкусовата промишленост, Токио, Япония).

Опитни животни

Общо 40 мъжки и 40 женски плъха без специфични патогени (F344/DuCrlCrlj, 5 седмици) бяха закупени от Charles River Laboratories Japan (Йокохама, Япония) и използвани след аклиматизация за една седмица. По време на изследването животните бяха настанени в поликарбонатни клетки с мека постелка, държани в стая с бариерна система за контрол на цикъла светлина/тъмнина (12 часа), вентилация (скорост на въздухообмен 18 пъти/час), температура ( 24 ± 1 градус) и относителна влажност (55 ± 5%). Клетките и постелята с стърготини бяха сменени два пъти седмично. Всяко животно имаше свободен достъп до чешмяна вода и основна диета (CRF-1; ориенталски дрожди, Токио, Япония). В началото на експеримента животните бяха разпределени на случаен принцип в четири групи от по 10 мъжки и женски плъха, всяка на базата на телесно тегло, измерено непосредствено преди започване на третиране с изпитвания химикал.

Уча дизайн

В предварително {{0}}дневно проучване, оценяващо 2-(1-ментокси) етанол, прилаган в дози от 0, 200, 400 и 800 mg/kg телесно тегло/ ден, абсолютните и относителните тегла на черния дроб са значително повишени във всички третирани групи от двата пола (данните не са показани). Въз основа на тези резултати избрахме дози 2-(1-ментокси) етанол от 0, 15, 60 и 250 mg/kg BW/ден за прилагане както на мъжки, така и на женски плъхове в настоящия {{ 13}}седмично изследване на токсичността.

Общото състояние и смъртността се оценяват ежедневно. Телесните тегла, както и количествата на приетата и остатъчна диета, се измерват веднъж седмично по време на експерименталния период. Всички плъхове са гладували цяла нощ при завършване на лечението и са взети кръвни проби за хематология и серумна биохимия от коремната аорта под дълбока инхалационна анестезия с използване на изофлуран. Дизайнът на изследването беше от Насоките за обозначаване на хранителни добавки и преразглеждане на стандартите за употреба на хранителни добавки на Япония (1996) и одобрен от Комитета за грижа и използване на животните към Националния институт по здравни науки, Япония.

Хематология и серумна биохимия

Следните хематологични параметри бяха анализирани с помощта на автоматични хематологични анализатори ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, САЩ): брой бели кръвни клетки (WBC), брой червени кръвни клетки (RBC), концентрация на хемоглобин (HGB), хематокрит (HCT), среден корпускуларен обем (MCV), среден корпускуларен хемоглобин (MCH), средна корпускуларна концентрация на хемоглобин (MCHC), брой на тромбоцитите (PLT) и диференциални левкоцитни клетки, включително неутрофили (Neut), лимфоцити (Lymph), моноцити (Mono), еозинофили (Eosino) и базофили (Baso). Серумният биохимичен анализ е извършен от Oriental Yeast за следните параметри: общ протеин (TP), албумин (Alb), съотношение албумин/глобулин (A/G), общ билирубин (Bil), глюкоза, общ холестерол (T-Chol), триглицериди (TG), уреен азот (BUN), креатинин (Cre), калций (Ca), неорганичен фосфор (IP), натрий (Na), калий (K), хлор (Cl), аспартат аминотрансфераза (AST), аланин аминотрансфераза (ALT), алкална фосфатаза (ALP) и -глутамил транспептидаза (-GTP).

Тегла на органи и хистопатологична оценка

Беше извършена пълна аутопсия за всички животни и мозъкът, тимусът, белите дробове, сърцето, далакът, черният дроб, надбъбречните жлези, бъбреците, тестисите и яйчниците бяха претеглени. Тези органи, както и тъкани от гръбначния мозък, тригеминалния нерв, хипофизната жлеза, носната кухина, слюнчените жлези, езика, хранопровода, трахеята, аортата, щитовидната жлеза, паращитовидната жлеза, панкреаса, стомаха, тънките и дебелите черва, субмандибуларните и мезентериалните лимфни възли, вагина, матка, пикочен мехур, простатна жлеза, семенни везикули, епидидимис, бедрена кост и гръдна кост с костен мозък, прешлени, скелетни мускули, седалищен нерв, кожа и млечна жлеза, бяха фиксирани в 10% неутрален буфериран формалин; след това се приготвят срезове, включени в парафин и се оцветяват с хематоксилин и еозин за хистопатологично изследване. Тестисите и очите с Хардерови жлези бяха фиксирани съответно във фиксатора на Bouin и разтвора на Davidson. Костните тъкани, включително носната кухина, прешлените, гръдната кост и бедрената кост, бяха декалцифицирани с помощта на смес от 10% мравчена киселина и 10% буфериран формалин за до 2 седмици. Извършена е хистопатологична оценка за всички тъкани, получени от животни в контролната група и групата, на която е приложена най-високата доза, освен ако не са наблюдавани лезии, свързани с лечението.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА ИМУНИТЕТА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Имунохистохимия за 2u-глобулин

При мъжки плъхове натрупването на 2u-глобулин в бъбрека се изследва чрез имунохистохимичен анализ на срезове, вградени в парафин. За извличане на антиген, срезовете, получени от 5 плъха във всяка група, се инкубират с протеиназа К (DAKO, Glostrup, Дания) за 1 минута при стайна температура. Всички срезове се потапят в 3% разтвор на H2O2/метанол за 10 минути при стайна температура за инактивиране на ендогенната пероксидазна активност. След блокиране на неспецифични реакции с 10% нормален заешки серум, срезовете се инкубират с първично антитяло за 2uglobulin (разредено 1:400; антитяло срещу плъх 2u-глобулин; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) за една нощ при 4 градуса 8. Визуализацията на свързването на антитялото се извършва с помощта на VectaStain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, СА, САЩ) и 3,3'-диаминобензидин. Всички срезове бяха насрещно оцветени с хематоксилин.

Статистически анализ

Разликите в стойностите на данните за телесното тегло по време на експерименталния период, както и за хематологията, серумната биохимия и теглата на органите бяха оценени за хомогенност с помощта на теста на Bartlett. Еднопосочен анализ на дисперсията и съответно тестът на Kruskal-Wallis бяха използвани за хомогенни и хетерогенни данни. При определяне на статистически значими разлики, тестът за множествено сравнение на Dunnett беше използван за сравняване на контролната и третираната групи. Сравненията на хистопатологичните случаи и степени бяха анализирани чрез използване на точния вероятностен тест на Fisher и съответно U теста на Mann-Whitney. P стойности на<0.05 were considered statistically significant.

Резултати

Параметри в живота, хематология и серумна биохимия

Не бяха отбелязани значими клинични признаци през целия експериментален период и всички животни оцеляха до планираната аутопсия. Освен това не са наблюдавани значими разлики в телесното тегло и дневния прием на храна при мъжки и женски плъхове (Фиг. 1А и Б).

Хематологичните и серумните биохимични данни са показани съответно в таблици 1 и 2. Хематологичните анализи разкриват значително намалени HGB, HCT, MCV и MCH и повишени PLT при мъжки плъхове, на които са прилагани 250 mg/kg BW/ден 2-(1-ментокси)етанол (Таблица 1). В серумната биохимия са отбелязани значителни увеличения на TP, T-Chol и Ca и понижения на Bil и ALP при мъже от групата на 250 mg/kg (Таблица 2). Значително увеличение на Cre и понижение на A/G са отбелязани при мъжките от групите 60 и 250 mg/kg. При жените е регистрирано значително увеличение на Ca и понижение на ALP в групите с 60 и 250 mg/kg, докато повишен T-Chol и намален A/G, Bil, TG, AST и ALT са открити в 250 mg /кг група. Въпреки че значително увеличение на TG и понижение на Cl са наблюдавани при мъжки екземпляри, на които е прилагана доза от 60 mg/kg, липсата на връзка с дозата предполага, че тези разлики не са свързани с експозицията на тестваното вещество.

Тежести на органи

Данните за теглото на органите са обобщени в Таблица 3. Абсолютното и относително тегло на черния дроб са значително увеличени и при двата пола в групата на 250 mg/kg (Таблица 3). Значително увеличение на относителното тегло на черния дроб се наблюдава при мъже от групата на 60 mg/kg. При мъжете абсолютното и относително тегло на бъбреците са значително повишени в групите с 60 и 250 mg/kg. В мъжката група с 250 mg/kg са отбелязани значителни увеличения на абсолютното и относително тегло на надбъбречните жлези и относително тегло на далака и тестисите.

Хистопатология и имунохистохимия

Данните за хистопатологични и имунохистохимични находки са обобщени съответно в таблици 4 и 5. Хистопатологичните находки разкриват, че честотата на натрупване на еозинофилни гранули (фиг. 2A-D), базофилни тубули и хиалинова отливка, както и фокално интерстициално възпаление в бъбреците, са значително увеличени в групите на лечение с изцяло мъже в сравнение с контролата група (Таблица 4). Въз основа на имунохистохимични анализи, мъжки плъхове, третирани с тестваното вещество, показват повишаване на имунореактивността на 2u-глобулин в епителните клетки на проксималните тубули, демонстрирайки ясна зависимост от дозата (Фиг. 2E–H) (Таблица 5).

При аутопсията един мъжки плъх в групата с 250 mg/kg показа силно уголемяване на десния бъбрек, дължащо се на хистологично характерен нефробластом. Въпреки че нефробластомът е необичаен при повечето щамове плъхове9, този случай се счита за случаен, тъй като няма други животни с подобни лезии. В допълнение, при проучвания за орална канцерогенност, честотата на спонтанен нефробластом при мъжки плъхове F344/DuCrlCrlj според съобщенията варира между 0–2,0%10. Въпреки че няколко лезии бяха спорадично открити в други органи, не бяха очевидни значими промени в зависимост от лечението в честотата на тези лезии.

Дискусия

Към днешна дата 24 ароматизатора, включително 2-(1-ментокси) етанол, са оценени от JECFA като вещества, структурно свързани с ментола, и всички са посочени като „без опасения за безопасността“ при текущите прогнозни нива на прием1, 11. 2-(1-Ментокси)етанолът се класифицира в подгрупа на алициклични алкохоли или етери и се счита, че е основно конюгиран с глюкуронова киселина, последвано от екскреция в урината1. Въпреки че пероралните стойности на LD50 на тези вещества при гризачи са относително високи, данните от проучванията за токсичност при многократни дози остават ограничени. 13-седмично проучване за токсичност при многократни дози разкри, че ментил пиролидон карбоксилат (CAS № 68127-22-0), съединение, структурно свързано с ментола, може да бъде свързано с повишено относително тегло на черния дроб и бъбреците при мъже и жени Wistar плъхове. Натрупване на 2u-глобулин в проксималните тубули на мъжки плъхове също се наблюдава при доза от 1,111 mg/kg BW/ден, а NOAEL беше определен като 109 mg/kg BW/ден1.

В настоящото 13-седмично проучване за субхронична токсичност на 2-(1-ментокси)етанол не са наблюдавани токсикологични промени в общото състояние, телесното тегло и приема на храна. След хематологична оценка наблюдавахме понижение на HGB (96,6% спрямо контролните средни стойности), HCT (96,3%), MCV (98,4%) и MCH (98,2%) и увеличение на PLT (111%) при мъжете 250 mg/kg група, които се считат за токсикологични влияния на лечението с 2-(1-ментокси)етанол. Както абсолютното (115% при двата пола), така и относителното (119% при мъжете и 111% при жените) тегло на черния дроб е значително увеличено и при двата пола в групите с 250 mg/kg. Въпреки че няма хистопатологични промени в черния дроб, повишени нива на серумния T-Chol (110% при мъже и 121% при жени) и TP (105% при мъже) и намаление на TG (60,1% при жени) в 250 mg/kg групи показват токсични промени, свързани с липидния метаболизъм и протеиновия синтез в черния дроб. Намален HGB и MCH и повишени PLT, T-Chol и TP при мъже и намален TG и повишено абсолютно и относително чернодробно тегло при двата пола също бяха открити със статистическа значимост в 28--дневното предварително проучване (данните не са показани ), което потвърждава, че тези променени хематологични и серумни биохимични параметри, както и теглото на черния дроб, не са случайни, а свързани с изпитваното вещество ефекти. За разлика от това, значителното увеличение на относителните тегла на черния дроб, открито при мъжката група с 60 mg/kg в настоящото проучване, не е придружено от увеличение на абсолютните тегла или промени в свързаните биохимични параметри, което предполага, че това увеличение е адаптивна промяна.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Счита се, че значително повишеното абсолютно (120%) и относително (118%) тегло на надбъбречните жлези в мъжката група с 250 mg/kg е свързано с изпитвания химикал. Освен това повишените абсолютни и относителни тегла на надбъбречните жлези и при двата пола показаха ясна зависимост от дозата в 28--дневното предварително проучване (данните не са показани), което показва връзка с третирането с тестов химикал. Въпреки че надбъбречната хипертрофия може да е резултат от стрес, няма открития, предполагащи стрес, като намалено наддаване на телесно тегло или атрофия на тимуса и други лимфоидни органи, както в настоящите, така и в предварителните проучвания. Тъй като може да няма хистопатологични промени в надбъбречната жлеза дори при нарушено производство на глюкокортикоиди в случаи на инхибиране на ензими, свързани със стероидогенезата12, не може да се изключи възможността повишеното тегло на надбъбречната жлеза да е токсично откритие. Обратно, повишените относителни тегла на далака и тестисите в мъжката група от 250 mg/kg, които не са наблюдавани в предварителното проучване, се считат за токсикологично незначими поради липсата на хистопатологични лезии или значително увеличени абсолютни тегла. По същия начин, серумната биохимия разкри понижение на A/G и увеличение на Ca и при двата пола, което се счита, че няма токсикологично значение, като се има предвид, че не са открити аномалии в свързани параметри. Освен това понижените нива на Bil и ALP при двата пола и намалените AST и ALT при жените са в контраст с очакваните токсични ефекти и се считат за незначителни.

Хронична нефропатия, характеризираща се с базофилни тубули, хиалинова отливка и фокално интерстициално възпаление, се наблюдава със статистическа значимост при мъже от всички третирани групи. В допълнение, повишено серумно Cre и абсолютно и относително тегло на бъбреците са открити в групите мъже 60 и 250 mg/kg; тези промени не са наблюдавани при групите за лечение на жени. В тези случаи степента на натрупване на еозинофилни гранули в проксималните тубулни епителни клетки се увеличава по очевидно дозозависим начин. Тези гранули са потвърдени като 2u-глобулин чрез имунохистохимия, което показва появата на 2u-глобулинова нефропатия. 2u-глобулините, свързани с определени химикали, като d-лимонен, се натрупват в лизозомите и се наблюдават в проксималните тубули като еозинофилни или хиалинови гранули9. Това натрупване може да увреди епителните клетки, което води до хронична прогресивна нефропатия и последващо образуване на тумор9. По този начин, въпреки че NOAEL за 2-(1-ментокси)етанол, свързан с 2u-глобулинова нефропатия в бъбреците на мъжки плъхове, не е идентифициран, според съобщенията този тип нефропатия е специфичен за мъжки плъхове и следователно не е от значение за хора оценка на риска13. Повишен риск от бъбречна недостатъчност, медииран чрез механизми, свързани с натрупването на 2u-глобулин, е много малко вероятно, тъй като този протеин отсъства при хората14. Поради това се счита за разумно да се изключат промените, свързани с хронична нефропатия, наблюдавани при мъже, от определянето на NOAEL.

В заключение, настоящото 13-седмично проучване за субхронична токсичност показа, че лечението с 250 mg/kg BW/ден 2-(1-ментокси) етанол причинява токсични промени в хематологията, серумната биохимия и теглото на органите при мъжки и женски плъхове F344. Въз основа на наблюдаваните резултати, NOAEL на 2-(1-ментокси)етаноле оценен като 60 mg/kg телесно тегло/ден за двата пола.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%