Двувалентна жива атенюирана ваксина срещу грипен вирус предпазва от клинични изолати на H1N2 и H3N2 при свинете, част 1

Резюме:

Вирусите на грип А (IAV) могат да причинят силно заразно респираторно заболяване за много видове бозайници. При свинете IAVs причиняват висока заболеваемост и ниска смъртност при податливи популации, което може да има значително финансово и производствено въздействие. Те могат също така да предоставят възможности за мутации и пренареждане на гени, произвеждайки грипни щамове с пандемичен потенциал.

Грипът А е силно заразно респираторно заболяване, което представлява сериозна заплаха за световното обществено здраве. Проучвания, свързани с имунитета, показват, че силната имунна система може да направи хората по-способни да се борят с вируса, когато са заразени с грипния вирус, като по този начин намаляват честотата и тежестта на заболяването.

Имунитетът е способността на нашата имунна система да се бори с болестта. Човешката имунна система се състои от две части: вроден имунитет и придобит имунитет. Вродената имунна система е това, с което се раждаме и има способността на цялото тяло да се защитава срещу болести. Придобитата имунна система е имунитетът, който постепенно имаме в живота си, включващ главно хуморален имунитет, съставен от имунни клетки и антитела, и клетъчен имунитет, съставен от Т клетки и имунни клетки.

Проучванията показват, че като поддържате здравословен начин на живот и диета, спортувате и получавате достатъчно витамини и други хранителни вещества, можете да подобрите имунната си система. Освен това ваксината може също така да повиши имунитета на организма срещу грипните вируси и да намали честотата на заболяването.

Вирусите на грип А са общи за хората и животните, така че често мутират. Особено през есента и зимата имунитетът на хората е нисък и вирусът на грип А може лесно да атакува, като се възползва от тази възможност. Но ако настояваме за развиване на здравословен начин на живот, укрепване на упражненията и активно ваксиниране, можем да подобрим имунитета си и да се справим по-добре с инвазията на грипния вирус А. Освен това, ако установите, че имате грипоподобни симптоми, трябва да потърсите медицинска помощ и да получите лечение навреме, за да може тялото ви бързо да се възстанови.

Накратко, има взаимно влияние между грипния вирус А и имунитета. Укрепването на имунитета, поддържането на здравословен начин на живот и хранене и особено приемането на ваксинация са ефективни мерки за превенция и борба с вируса на грип А. Нека бъдем позитивни и да преминем към по-здравословен начин на живот по отношение на превенцията на вируса на грип А! Вижда се, че трябва да подобрим имунитета. Cistanche може значително да подобри имунитета, тъй като пепелта от месо съдържа различни биологично активни съставки, като полизахариди, две гъби, Huang Li и др. Тези съставки могат да стимулират различни имунни системи. клетъчно-подобни клетки, повишаващи тяхната имунна активност.

Click cistanche tubulosa ползи

Поради това е много важно да се предотврати и контролира грипната инфекция при свинете и основният начин за това е чрез ваксинация. Подтиповете на IAV, които са най-разпространени при свинете по света, са H1N1, H1N2 и H3N2; Въпреки това, генетичното разнообразие на тези вируси може да варира значително според региона. Преди това разработихме двувалентна жива атенюирана ваксина, зависима от еластаза, използвайки два изолата на канадския вирус на свински грип A (swIAV), A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] и A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2) ) [SD69], който защитава срещу хомоложни щамове.

В това проучване ние демонстрираме, че тази ваксина разширява защитата при прасетата до по-актуални, преместени нехомоложни щамове H1N2 и H3N2, A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] и A/Swine/AB/SD0435/ 2019 (H3N2) [SD435].

Ваксината предизвиква силен имунен отговор в серума и белия дроб и намалява вирусната репликация, както и белодробната патология, свързана с тези щамове. Следователно тази двувалентна ваксина остава силен кандидат, който би бил от полза за пазара на ваксини срещу свински грип в Северна Америка.

Ключови думи:

грип; ваксина; свине.

1. Въведение

Вирусите на грип А (IAV) са значителен патоген за много видове, включително свинете. Инфекцията може да причини силно заразно респираторно заболяване при свинете [1]. Грипната инфекция при свинете води до леко заболяване с много ниска смъртност, но нивата на заболеваемост в стадото могат да достигнат 100 процента [2]. Това води до икономически загуби за фермерите поради намалено наддаване на тегло при заразени прасета, намалена производствена производителност и репродуктивен неуспех при свине майки [3,4].

Коинфекцията на грип с други респираторни патогени по свинете също може да доведе до развитие на комплекс от респираторни заболявания при свинете и в резултат на това повишена смъртност и икономически загуби [5].
Освен това прасетата са податливи на инфекция с птичи и човешки IAVs, както и свински IAV (swIAV) поради наличието както на птичи, така и на бозайникови галактозни връзки със сиалова киселина в дихателните им пътища [6]. Това прави възможно реасортирането да се случи при коинфектиране с множество щамове, което може да доведе до производството на нови щамове с пандемичен потенциал [4,7].

Тъй като хората имат подобно разпределение на връзките на сиалова киселина и галактоза в респираторния тракт, са възможни двупосочни събития между хора и свине. Първият известен случай на това е по време на грипната пандемия от 1918 г., когато IAV е въведен при свинете от хора [8]. Тази линия остава стабилна в популациите от свине до 90-те години на миналия век, когато човешки и птичи щамове H3N2 се реасортират с циркулиращата линия на H1N1, за да произведат двойни и тройни реасортантни щамове на подтипове H1N1, H1N2 и H3N2 [8,9].

Новоразработената касета с троен реасортантен ген (TRIG) доведе до период на бърза IAV диверсификация при северноамериканските свине [10]. Тази TRIG касета е много стабилна и улеснява заместването на различни комбинации от HA и NA [5]. От 2005 г. много щамове с тази вътрешна TRIG касета, съчетана с човешки HA и NA гени, се разпространяват в стадата свине в САЩ [9].

Следващото забележително разпространено събитие се случи през 2009 г., когато щам H1N1 от свински произход (H1N1pdm2009) се разпространи сред хората, което доведе до грипната пандемия през 2009 г. [11]. Предаването от човек на свине (обратна зооноза) на човешката пандемия H1N1 IAV (H1pdm) е регистрирано многократно при северноамерикански свине, което доведе до установяването на нова линия и нови реасортантни swIAVs [8,10,12].

Общо седем антигенно различни H1 клона и четири различни H3 вируси са регистрирани при северноамерикански свине [5]. Наскоро програма за наблюдение на swIAV в Азия идентифицира преобладаващ евразийски птицеподобен (EA) реасортиран генотип 4 (G4) вирус, с H1pdm и тройни реасортантни вътрешни гени.

Този G4 вирус е измерен при 10,4 процента от тестваните свиневъдни работници и представлява маркери за пандемичен потенциал, със способността да се предава на хора и различна антигенност от циркулиращите в момента човешки вируси [7]. Поради това е много важно да се предотврати и контролира грипната инфекция при свинете както от гледна точка на свиневъдството, така и от гледна точка на общественото здраве, а основният начин за това е чрез ваксинация [4].

В САЩ най-често срещаният тип ваксина е целият инактивиран вирус (WIV), но също така е одобрена РНК векторна ваксина, експресираща HA и NS1-скъсена жива атенюирана ваксина срещу грипен вирус (LAIV) [4] . Подтиповете на IAV, които са най-разпространени при свинете по целия свят, включително Северна Америка, са H1N1, H1N2 и H3N2 [13].

Генетичното разнообразие на тези вируси обаче може да варира значително според региона и има разлики в генетичната еволюция на swIAV в Канада и САЩ, особено при H1 подтип вируси [12]. Наблюдението в Канада между 2009 и 2016 г. показа, че генетичните клади на H1, които са доминиращи в САЩ, H1g (1A.3.3.3) и H1d-1 (1B.2.2), не са открити в Канада и H1 вирусите в Канада са силно различни от тези в САЩ [12].

Беше идентифициран нов клас H1 (H1a-3) в Канада, който започна в Манитоба и претърпя бърз растеж, преди да се разпространи в цялата страна и в САЩ. По отношение на H3 вируси, шест H3 линии са документирани в американски свине (IV-A до IV-F), а от тях три са открити в канадски свине (IV-B, IV-C и IV-E) [12 ].

Това подчертава значението на регионалното наблюдение и осведомеността за циркулиращите щамове за информиране на ефективни програми за ваксини и показва, че ваксините, създадени на базата на IAV, циркулиращи в американските свине, може да не защитят канадските свине [12].

Преди това беше създадена двувалентна ваксина с помощта на два канадски swIAV изолата, A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] и A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2), които са представители на H{{ 9}} антигенна група и нова H3 антигенна група от Западна Канада (свински клъстер IV-E), съответно [14]. Тази нова ваксина е жива атенюирана вирусна ваксина, направена с помощта на зависими от еластаза форми на SD191 и SD69, SD191−R342V и SD69-K345V. Проучванията показват, че той е защитен както срещу SD191, така и срещу SD69, както и срещу хетероложен H1N2 щам A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2), който също е изолиран от Западна Канада [14].

Оттогава циркулиращите swIAV щамове продължават да се променят. По-нови клинични изолати от свине в Западна Канада бяха събрани и изолирани от полеви проби в Западния колеж по ветеринарна медицина, Университет на Саскачеван, Саскатун, Словакия, Канада. A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] е член на H -3 антигенната група, но има пет аминокиселинни замествания от 54 ключови H1 антигенни места в сравнение със SD191 [10,15, 16].

A/Swine/AB/ SD0435/2019 (H3N2) [SD435] е член на IV-E клъстера, но се е променил, за да включи две аминокиселинни замествания от шестте ключови H3 антигенни места [17].

В това проучване ние оценихме дали двувалентният зависим от еластаза LAIV би издържал срещу нови клинични изолати и можем да съобщим, че защитава свинете, когато са заразени с циркулиращи в момента swIAV щамове SD467 (H1N2) и SD435 (H3N2).

2. Материали и методи

2.1. Клетки и вируси

Клетките от кучешки бъбрек на Madin-Darby (MDCK) (ATCC, #CRL-2936) се поддържат в минимална есенциална среда (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, St. Louis, MO, USA), съдържаща 10 процента фетален говежди серум (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Канада 16000-044) и бяха държани в овлажнен 5 процента CO2 инкубатор при 37 ◦C. A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] и A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV бяха изолирани от полеви проби в Западния колеж по ветеринарна медицина, Университет на Саскачеван, Саскатун , SK, Канада.

Вирусите на ваксината SD191−R342V и SD69- K345V бяха спасени, както беше описано по-горе [14]. Всички вируси се отглеждат в MDCK клетки в присъствието на 0.2 процента говежди серумен албумин (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) или с 1 µg/mL L-[(толуен{ {11}}сулфонамид)-2-фенил] етил хлорометил кетон (TPCK)-трипсин (WT вируси) или 0,5 µg/mL човешка неутрофилна еластаза (зависими от еластаза вируси) (Sigma-Aldrich, E8140).
2.2. Проектиране на опити с животни

Двадесет и четири четириседмични swIAV-отрицателни прасета бяха получени от Prairie Swine Center Inc. (Saskatoon, SK, Канада). Тези прасета бяха избрани на случаен принцип и разделени на четири групи със седем прасета на ваксинирана група и пет прасета на фалшиво ваксинирана група.

Груповото присвояване е описано на фигура 1A. Тези групи бяха настанени в отделни стаи на базата на ваксинационни групи (групи A плюс B и C плюс D, настанени заедно) и им беше позволено да се аклиматизират в продължение на седем дни преди заразяването.

На пет седмична възраст (ден 0), както и на осем седмична възраст (ден 21), прасетата в групи A и B бяха интратрахеално фалшиво ваксинирани с 4 mL MEM, докато групите C и D бяха ваксинирани с двувалентна ваксина, съдържаща 1 × 106 PFU от всеки SD191−R342V и SD69-K345V в 4 mL MEM. Десет дни по-късно (ден 31), прасетата бяха провокирани или с MEM (фалшиво), или с 1 × 106 PFU от SD435-WT (H3N2) или SD467-WT (H1N2).

Прасетата бяха наблюдавани в продължение на пет дни след заразяването, като ежедневно се измерваха ректалните температури и се вземаха назални тампони от двете ноздри на дни 1, 3 и 5. Серумът беше събран след първата (ден 20) и втората (ден 30) ваксинации за тест за серумна вирусна неутрализация (SVN) и ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA).

На 5-ия ден след предизвикването, всички прасета бяха хуманно евтаназирани и белите дробове бяха екстрахирани и оценени за наличие на swIAV-характерни груби лезии. Проби от белодробна тъкан също бяха събрани за изолиране на вируса (Фигура 1B).

2.3. Етична декларация

Всички процедури за животни бяха одобрени от Университетския комитет за грижа за животните (UACC) и Съвета по етика на изследванията върху животни (AREB) на Университета на Саскачеван. Този протокол беше одобрен на 12 ноември 2021 г. (Протокол за използване на животни #20190064). Всички процедури бяха извършени по стандартите, изисквани от Канадския съвет за грижа за животните (CCAC) към Организацията за ваксини и инфекциозни болести (VIDO), Университет на Саскачеван, Саскатун, Словакия, Канада.

2.4. Вземане на проби

Назални тампони от всяка ноздра се поставят в 1 mL MEM, съдържащ 1 × антибиотичен антимикотик (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Канада, 15240-062) и се замразяват при -80 ◦C, докато се извърши qRT-PCR. Всички прасета бяха хуманно евтаназирани чрез интравенозно приложение на етанол (240 mg/mL натриев пентобарбитал; 2 mL на 4,5 kg). При евтаназията белите дробове бяха отстранени изцяло, за да се определи както процентът на лилаво-червени, твърди лезии, така и пневмония.

Процентите са определени въз основа на теглата на белодробния лоб, както и на целия белодробен обем [18]. Бяха взети белодробни проби също от десния апикален, сърдечен и диафрагмен дял за вирусно титруване. Тези белодробни проби се смесват в равни обеми от 10 процента w/v MEM, съдържащ 1 × антибиотик-антимикотик за титруване.

Фигура 1. Групиране на прасета и дизайн на изпитване за оценка на защитната ефикасност на двувалентния LAIV срещу нови клинични изолати. Прасета (n=5 за MEM/MEM групи и n=7 за двувалентни/бивалентни групи) бяха интратрахеално ваксинирани с 4 mL MEM или двувалентна ваксина, съставена от 1 × 106 PFU от всеки SD191−R342V и SD69-K345V на дни 0 и 21. На ден 31, прасетата бяха заразени интратрахеално с MEM или 1 × 106 PFU от SD435 (H3N2) или SD467 (H1N2). (А)

График на имунизация, предизвикване и вземане на проби за това изпитване върху животни. Двадесет и четири четириседмични swIAV-отрицателни прасета бяха оставени да се аклиматизират в продължение на седем дни преди заразяването. На пет седмична възраст (ден 0), както и на осем седмична възраст (ден 21), прасетата в групи A и B бяха интратрахеално фалшиво ваксинирани с 4 mL MEM, докато групите C и D бяха ваксинирани с двувалентна ваксина, съдържаща 1 × 106 PFU от всеки SD191−R342V и SD69-K345V в 4 mL MEM.

Десет дни по-късно (ден 31), прасетата бяха провокирани или с MEM (мотив), или с 1 × 106 PFU от SD435-WT (H3N2) или SD467-WT (H1N2). Прасетата бяха наблюдавани в продължение на пет дни след предизвикване, като ректалните температури се измерваха ежедневно и се вземаха назални тампони от двете ноздри на дни 1, 3 и 5. Серумът беше събран след първата (ден 20) и втората (ден 30) ваксинации. На 5-ия ден след предизвикване (ден 36) всички прасета бяха хуманно евтаназирани и белите дробове бяха извлечени за оценка. (B) Създаден с BioRender.com.

2.5. Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)

За да се направят покриващи антигени, SD435 и SD467 се размножават в MDCK клетки и се пречистват с ултрацентрофугиране с градиент на захароза. Инактивирането на вирусите става чрез добавяне на 97 процента -пропиолактон към вируса в концентрация 1:1000 (v/v) (Thermo Fisher Scientific, AAB2319703). Тази смес се разклаща при 4 ◦C за една нощ, инкубира се при 37 ◦C в продължение на два часа, за да се улесни хидролизата на -пропиолактон, след което се съхранява при -80 ◦C до употреба.

За измерване на swIAV-специфичните нива на IgG, индуцирани от ваксинация и провокация, беше взет свински серум след първата (ден 20) и втората (ден 30) ваксинации и преди аутопсия (ден 36).

Пречистени -пропиолактон-инактивирани вируси SD435 (1 µg/mL) и SD467 (2 µg/mL), разредени в карбонат/бикарбонатен покриващ буфер (рН 9,6) се прилагат към Immulon-2 96-плаки с ямки при 1{{ 12}}0 µL/ямка (Thermo Labsystems, Ottawa, ON, Канада, 3655) и се инкубира една нощ при 4 ◦C. След инкубиране за една нощ, покритите плочи се промиват четири пъти с TBST (0.1 М Tris, 0,17 М NaCl и 0,05 процента Tween 20), към които се добавят четирикратни серийни разреждания на серума или BALF. плаката в два екземпляра, последвано от двучасова инкубация при стайна температура. Беше добавен серум при начално разреждане от 1:10 и BALF беше добавен неразреден.

Проби от предварително дефинирани положителни контролни серуми и съответните отрицателни контроли, серум и BALF от неваксинирани прасета в предишно проучване бяха пуснати на всяка плака [14]. Плаките се промиват четири пъти с TBST, след което козе анти-свински IgG (H плюс L) белязано с фосфатаза афинитетно пречистено антитяло (1:5000) (Sigma Aldrich, SAB3700435) или миши анти-свински IgA (Serotec, MCA658) ( 1:300), разреден в TBST, се добавя и се оставя да се инкубира при стайна температура за един час.

IgA ELISA бяха разработени чрез добавяне на биотинилирани кози анти-миши IgG (H плюс L) антитела (CALTAG, Burlingame, CA, САЩ, M30015) и разтвор на стрептавидин алкална фосфатаза (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) и двете за един час при стайна температура. След инкубацията, както IgG, така и IgA плаките се промиват четири пъти с TBST, към който р-нитрофенил фосфатен субстрат (PNPP) [10 mg/mL р-нитрофенил фосфат ди(трис) кристална сол (Sigma-Aldrich), 1 процент диетаноламин ( Sigma-Aldrich), 0,5 mg/mL MgCl2 и рН 9,8] (1 mg/mL) се добавя и се инкубира при стайна температура в продължение на два часа.

Реакцията беше спряна чрез добавяне на 0.3 М етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) и плаките бяха отчетени в спектрофотометър при 405 nm с референтна дължина от 490 nm. Титърът на пробата се определя като най-високото разреждане, при което OD на тази проба е по-висока от определената граница (средната OD на известна отрицателна проба плюс два пъти стандартното отклонение).

2.6. Тест за неутрализиране на вируса (VN).

MDCK клетки (3.5 × 104) се поставят в 96-плаки с ямки. Серумът и BALF се инактивират нагряване при 56 ◦C за 30 минути. Двукратни разреждания на серума и BALF бяха добавени към плаката в четири повторения и 60 µL от разреден серум или BALF бяха инкубирани с равен обем SD435 или SD456, съдържащ 100 TCID50 при 37 °C за 1 час.

След това 100 uL от сместа се добавят към MDCK клетките и цитопатогенният ефект (CPE) се документира на 48 часа и 72 часа след инфекцията (pi). Титърът на неутрализиращото антитяло е най-високото разреждане на всяка серумна проба, което напълно защитава клетките от CPE в поне 2 от 4 ямки.

2.7. Вирусно определяне

След събирането белодробните проби незабавно се поставят върху лед и се замразяват при -80 ◦C до обработка. За обработка всяка белодробна тъкан се претегля и се добавя 10 процента (w/v) концентрация на MEM, допълнена с 1 × антибиотик-антимикотик (Thermo Fisher Scientific, 15240-062). Белодробната тъкан се хомогенизира в TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Германия) при 30 Hz за 5 минути, последвано от центрофугиране при 5000 × g за 10 минути при 4 ◦C. Хомогенизираният супернатант се събира и съхранява при -80 ◦C до по-нататъшен анализ.

Назалните тампони се разбъркват за 15 секунди и се центрофугират при 1600 × g за 25 минути при 4 ◦C. Супернатантите се събират и съхраняват при -80 ◦C до по-нататъшен анализ. Вирусните титри бяха определени чрез TCID50 анализ за белите дробове и количествен RT-PCR за назални тампони.

2.8. Екстракция на РНК и количествена RT-PCR (qRT-PCR)
За да се определят нивата на вирусна РНК на SD467 и SD435 в назалните тампони след предизвикване, се извършва qRT-PCR. Беше направена стандартна крива, използвайки РНК, извлечена от SD435 и SD467 с известен титър. Накратко, RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Торонто, ON, Канада, 74136) беше използван за извличане на vRNA от 200 µL назална промивка.

РНК се превръща в сДНК с помощта на универсалния грипен праймер Uni12 и SuperScript III транскриптаза (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) [19]. qPCR се извършва в три екземпляра на StepOnePlusTM Real-Time PCR система (Applied Biosystems, Калифорния, САЩ) с Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5 µL cDNA и 1 µL от 10 µM прав и обратен праймери. PCR реакциите се провеждат при температура на отгряване от 58 ◦C за 40 цикъла. Всички последователности на qPCR праймери са налични при поискване.

2.9. Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуер GraphPad Prism 8. Използвани са непараметричните тестове на Mann-Whitney и Kruskal-Wallis. Значимите разлики са означени с * (p < 0.05), ** (p < 0.01), *** (p < 0,001) , или **** (р <0,0001). ns=не е значимо.

For more information:1950477648nn@gmail.com