Механизъм на веригата, свързващ минало и бъдещо учене чрез промени във възприятието, част 2

Изясняване на контролната верига, която задвижва промяната във възприятието

След това, за да характеризираме механизмите на веригата, които медиират тази предизвикана от обучението промяна във възприятието, ние измерихме активността в два интерневрона от по-висок ред, мозъчен вентрален 1a (CV1a) и неврон, обръщащ модел (PRN). Тези клетки са неврони, подобни на команди, съответно във веригите за поглъщане и поглъщане и, когато са активни, са достатъчни, за да управляват съответните им двигателни програми (16, 31). Вътреклетъчните записи показват, че активността на CV1a е значително повишена на 4 часа след силно обучение спрямо наивни животни, докато активността на PRN е значително понижена (фиг. 3, A до E).

Промяната на възприятието е промяна в начина на мислене и корекция в манталитета. То включва осъзнаване на заобикалящата среда, осъзнаване на самоидентичността, разбиране на личния опит и преследване на цели и стремежи. Промените във възприятието могат да насърчат хората да възприемат по-положителен подход към живота и да се справят по-добре с предизвикателствата. И тази положителна нагласа и манталитет могат да подобрят паметта на хората.

Първо, промяната във възприятието позволява на хората да се съсредоточат повече върху положителните неща в живота си. Както се казва в "Търсене на оптимистични лица", в живота често има много положителни фактори, но често не успяваме да ги открием. И чрез промени във възприятието, можем да осъзнаем по-добре тези положителни фактори и да им отдадем достатъчно внимание и значение. Тези оптимистични фактори могат не само да натрупат нашето щастие, но и да ни насърчат да възприемаме по-добре информацията в живота, като по този начин подобряваме паметта.

Второ, промяната на възприятието може също да помогне на хората да разберат по-добре себе си, включително своите силни и слаби страни, ценности и т.н. Това задълбочаване на самосъзнанието позволява на хората да управляват по-добре своите емоции и стрес и да станат по-мотивирани да преследват своите цели и желания. Този вид амбиция и мотивация могат да стимулират мозъците на хората да бъдат по-креативни и мислещи и допълнително да подобрят паметта им.

И накрая, промените във възприятието също могат да накарат хората да обърнат повече внимание на собствения си опит и растеж. Независимо дали става въпрос за успех или неуспех, всяко преживяване е ценен актив. Чрез промени във възприятието можем по-добре да отразяваме и обобщаваме, не само по-добре да откриваме нашите точки на растеж и недостатъци, но и по-добре да усвояваме и помним преживявания и уроци.

Накратко, промяната във възприятието, макар и просто умствена настройка, може да има дълбоко положително въздействие върху нашия живот и обучение. С положително и слънчево отношение можем по-добре да се справяме с предизвикателствата, да преследваме растеж и по-добре да владеем информация и да запомняме съдържание. Нека инвестираме активно в трансформацията на възприятието и непрекъснато да подобряваме нашия растеж и качество. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си. Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори. Тези вещества са много важни за паметта и ученето. Освен това месото може също така да подобри притока на кръв и да насърчи доставката на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно хранителни вещества и енергия, като по този начин подобрява мозъчната жизненост и издръжливост.

Щракнете върху познайте начините за подобряване на мозъчната функция

Ние разсъждавахме, че тази водена от обучение антагонистична връзка на активността може да се обясни с общ мотив на веригата, а именно инхибиране между конкуриращи се вериги (32). В този сценарий, регулирането на активността в една мрежа би послужило за стимулиране на потискането в антагонистичната. В подкрепа на това, CV1a получава големи инхибиторни входове по време на фазата на удължаване както по време на спонтанни, така и на PRN-задвижвани цикли на егезия (фиг. 3F). Тези инхибиторни входове не са възникнали директно от PRN, което предполага, че невроните надолу по веригата са били наети.

Fig. 2. Previous learning alters the perception of future training by shifting the feeding network state. (A) Example frames showing mouth movements during ingestion or egestion. Frames are color-matched to (B) (red: ingestion, blue: egestion). White dots indicate the distal tip of the radula tracked during bite classification. Scale bar, 0.5 mm. (B) Heat plots of radula movements during the first 15 bites in response to the CS + US during weak training in animals receiving weak training only versus animals receiving vital training 4 hours earlier. Red-white-blue lookup table represents radula movements. Positive (blue) is egestion; negative (red) is ingestion. (C) Statistical summary of (B) shows a significant change in the mean difference in radula movements between conditions (two-tailed t-test, P < 0.01, t = 3.1). (D) The plot of the fraction of ingestion/egestion bites produced during weak training shows a significant difference between conditions(Fisher's exact test, P < 0.01). (E) The plot of fraction of animals performing no egestion bites versus >{{0}} ухапвания от егестия показват значителна разлика между условията (точният тест на Fisher, P <0,001). (F) B11 и N2v активност в in vitro препарат по време на цикли на поглъщане и поглъщане. B11 е предимно активен във фазата на прибиране по време на поглъщане и във фазата на удължаване по време на поглъщане.

N2v activity does not change during ingestion and egestion cycles. B11 is therefore a readout of ingestion versus egestion. Gray lines represent the retraction phase onset. (G) Heat plots of B11 activity during fictive feeding cycles. Lookup table colors are normalized B11 spike differences. Positive (blue) is egestion; negative (red) is ingestion. (H) Statistical summary of (G) shows a significant change in the 11 spike difference between conditions (Mann-Whitney test, P < 0.01, U = 70). (I) The plotof fraction of ingestion/egestion cycles shows a significant difference between conditions (Fisher's exact test, P < 0.001). (J) The plot of the fraction of preparations producing no egestion cycles versus >{{0}} цикли на засищане показват значителна разлика между условията (точният тест на Фишер, P <0,001). ч, часове.

След това, за да идентифицираме източника на тези входни данни, извършихме обширно търсене на тип неврон, който би изпълнил следните критерии: (i) Той трябва да инхибира CV1a, когато е активен, (ii) той трябва да бъде активен по време на фазата на удължаване на егезията цикли и (iii) трябва да се възбуди от PRN активност. Използвайки подход за флуоресцентно маркиране, за да разкрием неврони, излизащи от букалните ганглии, където се помещава по-голямата част от веригата за хранене (33), ние идентифицирахме един тип неврон кандидат, превключвател на шаблон 1 (PS1) (Фиг. 4A), който удовлетворява и трите критерия . Първо, изкуственото стимулиране на PS1 моносинаптично инхибира ипсилатералния CV1a (фиг. 4, B и C). Второ, този неврон е силно активен по време на фазата на удължаване както на PRN-задвижвани, така и на стимулирани от стимул цикли на егезия (Фиг. 4D и fFig.S9A), когато CV1a е инхибиран. Трето, активността на PRN възбужда PS1 моносинаптично, наблюдавано като 1:1 възбуждащи постсинаптични потенциали (EPSPs) (фиг. 4, E и F). За да се установи дали PS1 е единственият източник на инхибиране на CV1a по време на поведението на хранене с егестия, ние изкуствено манипулирахме неговата активност по време на цикли, управлявани от PRN. Когато се хиперполяризира, сега има значително увеличение на активността на CV1a (фиг. 4, G и H) без доказателства за фазовите инхибиторни синаптични входове, които обикновено получава. Освен това, хиперполяризацията на PS1 също е достатъчна, за да увеличи активността на CV1a по време на сензорно управлявани цикли на егезия (фиг. S9B). По този начин този основен тип инхибиторен неврон действа като превключвател по време на избор на действие, предотвратявайки разрушителното активиране на командните центрове за поглъщане по време на поглъщане.

Тъй като CV1a няма моносинаптична връзка с PRN, как той осигурява потискането на егестията, когато е активен? Успяхме да отговорим на този въпрос, като идентифицирахме втория компонент на контролната верига: тип букален интерневрон, PS2, който беше силно електрически свързан с PRN и достатъчен за задвижване на стабилни цикли на егезия (фиг. S9, C и D). Той получава силно улесняващо инхибиране от CV1a и по този начин води до потискане на поглъщането, когато се генерират цикли на поглъщане (фиг. S9, E и F). Освен това, изкуственото активиране на PS2 причинява полисинаптични инхибиторни входове на CV1a, възникващи чрез неговата моносинаптична възбуждаща връзка към PS1 (фиг. S9, G и H). Заедно тези резултати показват, че взаимното инхибиране се използва за предотвратяване на активирането на конкурентни вериги и че този мотив на веригата осигурява контролна точка, върху която може да действа пластичността (fFigS9I). След това проучихме възможната роля на потискането на веригата на егестия при отклоняване на възприемането на учебни събития.

Манипулирането на веригата за контрол на възприятието позволява ново обучение in vivo

Като се има предвид, че благоприятства изразяването на поведение на преяждане, ние разсъждавахме, че намаляването на активността на PRN → PS1 може да бъде достатъчно, за да промени възприятието на животното за слабо обучение и по този начин да подобри придобиването на памет. За да проучим това, разработихме фармакологична стратегия, която ни позволи да манипулираме изходния път на PRN. По-рано показахме, че този неврон е допаминергичен и че D2 рецепторният блокер, сулпирид, е много ефективен при инхибиране на неговото действие върху последващите мотоневрони (16). Тук потвърдихме, че връзката PRN → PS1 също е чувствителна към сулпирид (фиг. 5, A и B), което води до значително намаляване на амплитудата на PRN → PS1 EPSP. След това тествахме дали блокирането на тази връзка може да имитира увеличаването на активността на CV1a, наблюдавано 4 часа след силно обучение. Установихме, че сулпирид причинява силно повишаване на активността на цикъла на CV1a в сравнение с предварителната обработка (фиг. 5, C и D), в съответствие с предишната ни работа, показваща, че прилагането на сулпирид отклонява активността към събития на поглъщане (16). По този начин сулпиридът може силно да промени състоянието на мрежата, замествайки ефектите от силното обучение. Като такъв, този агент предоставя възможността да се тества in vivo дали този път е в основата на промененото възприемане на слабото обучение от животното. Животните бяха инжектирани или със сулпирид, или с нормален физиологичен разтвор и бяха подложени на слаб протокол за обучение с реакции на хранене, измерени както на Фиг. 2 (А и В). Ние открихме, че животните, инжектирани със сулпирид, извършват значително повече събития на поглъщане в отговор на слабото обучение, отколкото животните, инжектирани с физиологичен разтвор (фиг. 5, E до G), и значително повече от животните, инжектирани със сулпирид, изобщо не извършват реакции на поглъщане (фиг. 5Н). Освен това, има значително намаляване на вероятността за преход между състояния след инжектиране на сулпирид (фиг. S10, A до D). Следователно както интензивното обучение, така и инжектирането на сулпирид изместват състоянието на мрежата in vitro и стабилизират възприятието за слабо обучение in vivo.
След това тествахме дали промяната във възприятието, предизвикана от сулпирид, е достатъчна за придобиването на LTM след слабо обучение, както показахме в случай на силно обучение. Животните бяха инжектирани със сулпирид или физиологичен разтвор и след това бяха подложени на слабо обучение с LTM тестван 1 ден по-късно. В съответствие с ефектите от силното обучение, ние открихме, че животни, инжектирани със сулпирид преди слабо обучение, имат значително по-голям отговор на GNL в сравнение с наивни или инжектирани с физиологичен разтвор обучени животни (Фиг. 5I). Освен това, инжектирането на сулпирид в отсъствието на слабо обучение не повишава реакцията на хранене към GNL, когато се тества 1 ден по-късно (фиг. 5I). Следователно фармакологичното манипулиране на мрежовото състояние причинява промяна във възприемането на слабото обучение, което е достатъчно, за да може животното да придобие и напълно да консолидира памет.

След това проучихме дали идентифицираната предизвикана от обучението промяна в състоянието на мрежата след жизненоважно обучение е участвала в изразяването на оригиналната силна памет или дали това е паралелен процес, който служи на целта за подобряване на бъдещи учебни събития. За да тестваме това, ние инжектирахме животни със сулпирид или физиологичен разтвор и записахме отговора им на силното тренировъчно CS (AA), но при липса на предварително жизненоважно обучение. Ние предположихме, че ако предизвиканата от обучението промяна в състоянието на мрежата е включена в изразяването на оригиналната памет, тогава поведението на хранене в отговор на CS (AA), използвано за интензивно обучение, ще бъде увеличено чрез изкуствено предизвикване на същата промяна в мрежата състояние със сулпирид, но при липса на предварителна витална подготовка. Въпреки това, ние открихме, че инжектирането на сулпирид не предизвиква повишаване на отговора към AA в сравнение с наивни или инжектирани с физиологичен разтвор животни (фиг. 5J). Следователно, въпреки че жизненоважното обучение причинява промяна в състоянието на мрежата, тази предизвикана от обучението промяна не участва активно в изразяването на самата силна памет, което предполага, че са включени различни механизми. Заедно тези резултати показват, че силното учене причинява паралелни промени в невронната активност: една за изразяване на самата памет и една за промяна на възприятието за бъдещо апетитно учене.

Свързаните с паметта промени във възприятието се обобщават до алтернативна парадигма на обучение

Каква е ролята на идентифицирания тук механизъм? Способността да се свързват силни и слаби учебни събития, които са тясно свързани във времето, предполага, че Lymnaea може да използва тази способност, за да идентифицира "богати на учене" периоди, например, съвместими с пристигането на животното в изобилна среда. Ако е така, бихме очаквали, че обучението трябва да се генерализира, вместо да зависи от едни и същи САЩ както за силното, така и за слабото обучение. За да тестваме тази важна идея, ние проведохме експерименти, в които заместихме захарозата US, използвана в протокола за слабо обучение с L-серин (фиг. 6A), известен алтернативен апетитен стимул в Lymnaea (29). По този начин и CS, и US са различни в двете различни парадигми на обучение. Ние открихме, че докато сдвояването на GNL + L-серин само по себе си не дава условен отговор, се наблюдава стабилна експресия на 1-дневна памет към GNL, ако силното обучение го предшества (фиг. 6B). По този начин, изразяването на паметта не е ограничено до едно САЩ, а вместо това може да позволи формирането на различни асоциации, което предполага, че би било много подходящо за позволяване на генерализирано понижаване на прага за формиране на нови спомени.

ДИСКУСИЯ

Способността да научавате нови асоциации е от решаващо значение за оцеляването в непредсказуема среда. Като се има предвид, че придобиването и консолидирането на паметта са енергийно скъпи процеси (1, 2, 34), има ключови потенциални ползи от използването на стратегии, които помагат при вземането на решения за това какво и кога да се учи. Тук идентифицираме прост механизъм в Lymnaea, чрез който минали събития се използват за пристрастно възприятие. Трябва да се отбележи, че ние също така демонстрираме, че този механизъм може да ръководи бъдещото обучение - улеснявайки придобиването на памет за асоциации, които преди това биха били игнорирани - и изясняваме отговорните невронни вериги. Ние предлагаме това да служи за предупреждаване на животно за ефективно насочване на ресурсите към ново обучение, когато скорошният опит предполага, че може да има особено предимство при формирането на положителни асоциации.

Ключова характеристика на механизма, който изясняваме, е, че силното обучение инициира паралелни процеси в мозъка: един за изразяване на оригиналната памет и един за промяна на възприемането на бъдещи учебни събития и улесняване на придобиването на нова памет. Те изглеждат независими, тъй като промяната в състоянието на невронната мрежа, измерена след силно обучение, не е достатъчна за изразяване на оригиналната памет, както се вижда от липсата на фалшива памет, когато състоянието на мрежата се променя фармакологично. Подобни паралелни пътища са идентифицирани в експерименти с кондициониране при мишки. Например, в задача за обонятелна дискриминация, екстензивното обучение промени възбудимостта на пирамидалните неврони в пириформения кортекс, съвпадайки с повишената способност за научаване на нови задачи (учене на правила), но това не корелира с изразяването на оригиналната памет (35 , 36). Като такива, докато тези промени, предизвикани от обучението, не са част от „енграмата“, изразяваща паметта, те все пак служат на критични адаптивни функции при животните, позволявайки им да използват миналия си опит, за да ръководят бъдещото си поведение – процес, може би също толкова важен, колкото и припомнянето на самата памет.

Механизмът, който идентифицирахме, показва ключови характеристики на времето. Той позволява подобрени способности за учене от 30 минути до 4 часа след интензивна тренировка, което предполага, че придобиването на нова памет се улеснява в критичен времеви прозорец. Информирани от предишната ни работа, тази времева рамка се съгласува с появата на междинна памет за силно обучение и продължава до появата на LTM (17). Изразяването на тази памет през тази времева рамка зависи от протеиновия синтез, докато следата от паметта, записана в по-кратка, 10-минутна времева точка, не е (17). Това силно предполага, че промяната в състоянието на мрежата, идентифицирана в нашето настоящо проучване, също зависи от протеиновия синтез, обяснявайки липсата на ефект след 10 минути след силна тренировка. Освен това подобрената способност за учене не се поддържа в по-дълги времеви точки: формирането на слаба памет за учене отсъства от ~6 часа нататък, въпреки че първоначалната силна памет все още присъства и може да се изрази. Следователно, предизвиканата от обучението промяна в състоянието на мрежата е временно индуцирана и не надживява молекулярните механизми, за които е известно, че са необходими за консолидиране на оригиналната памет през първите 6 часа след силно обучение (37). Ние предполагаме, че постоянна промяна във възприятието, дължаща се на минало обучение, може да бъде пагубно за животното, което води до енергийно скъпи и потенциално неадаптивни спомени. Съществува и изискване за стриктна времева последователност от силно, последвано от слабо обучение. Това се различава от по-рано идентифициран процес, поведенческо маркиране (38, 39), което улеснява взаимодействието и подобряването на спомените въз основа на синаптични тагове и улавяне (40, 41). По време на поведенческото маркиране, етикет, задействан от слабо обучаващо събитие, се насочва и подобрява от силно обучаващо събитие, независимо от времевата последователност на двете обучаващи събития (42, 43).

Тази ключова характеристика на поведенческото маркиране води до промяна на паметта на събитието, а не на самото учебно събитие. За разлика от това, предизвиканата от обучението промяна във възприятието, която идентифицираме тук, насочва животното да реши кои бъдещи събития да научи, вместо кои наскоро придобити спомени трябва да бъдат допълнително консолидирани. Като такива, докато двата механизма имат някои паралели и служат за увеличаване на броя на консолидираните дългосрочни спомени, те функционират при различни обстоятелства и използват различни верижни механизми. Ние също така демонстрираме, че предизвиканата от ученето промяна във възприятието се обобщава към други форми на апетитно учене, тъй като втори тип слабо апетитно обучение може също да бъде подобрено от минало силно учене. Подобно генерализирано подобрение на способностите за учене е установено при мишки, където се смята, че зависещото от хипокампуса обонятелно-дискриминационно обучение превключва хипокампалната мрежа в „режим на учене“, подобрявайки други видове зависимо от хипокампуса образование, като например пространствено обучение (44 ). Времевият ход и неспецифичният характер на механизма, идентифициран в Lymnaea, биха могли да послужат за предупреждаване на животното за "богат на учене" период, позволяващ да се правят положителни асоциации към сигнали, които, ако се срещнат изолирано, вероятно биха били пренебрегнати.

Какъв механизъм улеснява слабата тренировка след силна тренировка? Отбелязваме, че наивните животни, изложени на слабото обучение "flip-flop", или преход, между поведението на поглъщане и поглъщане, което предполага, че животното има бистабилно възприемане на CS + US стимулите по време на обучението, което представлява период на неяснота ( 45). Трябва да се отбележи, че ние също откриваме, че силното обучение променя и стабилизира възприятието на животното за слабото обучение, за да благоприятства поведението при поглъщане. Предполагаме, че бистабилното възприятие по време на слабо обучение е възникващо свойство на относителната активност на веригите за поглъщане и поглъщане, тъй като същото превключване продължава in vitro при липса на каквато и да е външна стимулация. Като характеризираме връзката между двете вериги, ние показваме, че конкурентните взаимодействия се дължат на мотив на реципрочна верига на инхибиране (32, 46), което предполага, че изборът на действие вероятно е генериран от модел победителят взема всичко. Предаващото инхибиране от веригата за поглъщане предотвратява коактивирането на веригата за поглъщане (PRN + PS2 → PS1 → CV1a), докато веригата за поглъщане директно инхибира част от електрически свързаната верига за поглъщане (CV1a → PS2) (Фиг. 6C и Фиг. S9I).

Тъй като и двете вериги са инервирани от един и същ захранващ ядрото централен генератор на модел (16, 31), ние предлагаме, че експресията на цикъла е продиктувана от първата верига, за да достигне достатъчен праг на скоростта на пик, за да инхибира другата. След силно обучение има промяна в относителната активност на двете вериги и като такава експресията на циклите на поглъщане е доминираща (фиг. 6C). Подобен мотив на веригата се наблюдава по време на кондициониране на страх при мишки, където може да се генерира едно от двете несъвместими поведения: бягство или замръзване. Ученето измества баланса на два реципрочно инхибиращи класа неврони в централната амигдала, което отклонява изразяването към едното или другото поведение (47). В Lymnaea, обаче, предизвиканата от обучението промяна в дейността не се използва за изразяване на паметта, а по-скоро за улесняване на ново обучение (фиг. 6C). Ние показваме, че фармакологичното стабилизиране на веригата на поглъщане чрез блокиране на инхибирането на подаване от веригата на поглъщане е достатъчно, за да промени възприятието на животното за CS + US по време на слабо обучение in vivo. Освен това, ние показваме, че това може да замести придобиването на силна памет, измествайки състоянието на мрежата, за да позволи нови положителни асоциации, което предполага, че формирането на памет може да бъде улеснено чрез намаляване на неяснотата по време на учебно събитие. Предишни проучвания при хора показаха, че предишното обучение може да промени контрола на вниманието, който настройва чувствителността на възприятията (3-5), а също така е доказано, че вниманието играе роля в мултистабилността на възприятието (45, 48).

Въпреки че в това проучване е измерено само възприятието на животното, възможно е механизмът, идентифициран тук, също да включва промяна на вниманието, която може да модулира възприемането на слабото обучение. Фактът, че промяната в състоянието на мрежата е налице преди излагането на слабото обучение, може да предполага, че има механизъм за предварително внимание, който от своя страна настройва възприемането на бъдещи учебни събития. Въпреки това, ако е включено такова изместване на вниманието, то е в състояние само да модулира възприятието и по този начин да подобри образуването на нова памет от ~ 30 минути след силното обучение.

Защо стабилизирането на мрежата към събития на поглъщане улеснява слабото обучение? Едно просто обяснение е, че по време на поглъщане животното активно изтегля CS и US в устната кухина и след това в хранопровода, позволявайки на всеки да бъде погълнат. Това контрастира с егестията, при която съдържанието се изхвърля ефективно от устната кухина. По-ранна работа показа, че успешното in vitro кондициониране зависи от достигането на САЩ до хранопровода (17) и активирането на езофагеалните неврони (49), които подсилват CS чрез активиране на D1 рецептор в последователни неврони (50–52). Следователно, благоприятстването на циклите на поглъщане ще послужи за увеличаване на US достигането и активирането на тези неврони, като по този начин ще подсили CS + US.

Тук сме разкрили досега неотчетен механизъм, чрез който промените във възприятието могат да съчетаят предишно и ново обучение при определени условия и времеви рамки. Ние предлагаме, че това може да служи като общ механизъм за определяне на състоянието, позволяващ на животно да формира асоциации между нови комбинации от стимули, които, изолирани, биха били недостатъчни, за да предизвикат памет. Тъй като асоциациите между ученето и промените във възприятието са добре установени при по-висши животни, включително хора, ние предполагаме, че пътят на учене → възприятие → обучение може да бъде широко запазена характеристика, която заслужава допълнително внимание в проучванията на ученето. Като се има предвид, че образуването на LTM е свързано с увеличени енергийни разходи - особено ангажирането и набирането на молекулярни машини за консолидиране на паметта - механизъм, който насочва ученето, има потенциално важна стойност за оцеляването. В случай на животно, търсещо храна, като Lymnaea, работещо с ограничен енергиен бюджет (53), изучаването на различни асоциации е много полезно, предупреждавайки ги за потенциални източници на храна или възможни опасности в тяхната среда, но това трябва да се балансира спрямо енергийните разходи за консолидиране на тези спомени. По този начин този механизъм им позволява да настроят бъдещото си обучение към миналия успех в обучението, като ефективно намаляват прага, необходим за научаване на нови асоциации.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Поддръжка на животни

Животните бяха държани на групи в големи резервоари за задържане, съдържащи вода без Cu{0}} при 20 градуса при режим 12-час светлина/12-час тъмнина. Животните са хранени с маруля три пъти седмично и рибна храна на растителна основа (Tetra-Phyll; TETRA Werke, Melle, Германия) два пъти седмично. Животните се прехвърлят в по-малки резервоари за съхранение и се лишават от храна за 2 дни преди експериментите. За всички експерименти бяха използвани възрастни (3 до 4 месеца) охлюви (Lymnaea stagnalis). Lymnaea е нисш безгръбначен (мекотел) организъм, който не попада в обхвата на Закона за животните (научни процедури) от 1986 г. (Обединеното кралство). Следователно не е необходимо етично одобрение или насоки за тези експерименти.

Процедури за тренировка и тестване на един опит за апетит

Извършено е силно кондициониране на апетита за един опит чрез сдвояване на AA (0.004%) като CS със захароза ({{10}}.33% ) като САЩ, използвайки по-рано добре описан метод (23, 24). Слабото кондициониране на апетита при единичен опит беше извършено чрез сдвояване на GNL (0.004%) като CS със захароза (0,11%) или L-серин (0,11%) като САЩ. В експеримент за контрол на противотежестта беше извършено силно кондициониране чрез сдвояване на GNL като CS със захароза (0,33%) като US и слабо кондициониране беше извършено чрез сдвояване на AA като CS със захароза (0,11%) като US. Накратко, животните бяха поставени поотделно в петриеви панички, съдържащи 90 ml вода без Cu 2+- за 10 минути, за да се аклиматизират към новата среда, преди да започне процедурата по обучение. Пет милилитра CS се добавят към водата и 30 s по-късно се прилагат 5 ml US. Животните бяха оставени в разтвора, съдържащ CS и US за 2 минути, след това изплакнати с вода без Cu2+- и върнати в домашните си резервоари. За тестване на отговорите на CS 1 ден след кондиционирането, животни от обучени и нелекувани групи бяха прехвърлени от техните домашни резервоари в петриево блюдо, напълнено с 90 ml вода без Cu2+- и оставени да се аклиматизират за 10 минути.

След това пет милилитра вода се добавят към чинията и се преброява броят на реакциите на хранене (хапания) през следващите 2 минути. След това към съда се добавят 5 ml от CS и броят на отговорите на хранене се преброява в следващите 2 минути. След това отговорите на CS бяха оценени с помощта на "резултат за разлика" (∆ брой на ухапване). Това се получава чрез изваждане на броя на циклите на хранене, наблюдавани в продължение на 2 минути след прилагане на вода, от броя на циклите на хранене в рамките на 2 минути след прилагане на CS. По време на експерименти с двойно кондициониране, животните получават както силно, така и слабо апетитно кондициониране, разделени от интервали от време, както е описано в резултатите. За да проверим дали предварителната експозиция на САЩ, използвана по време на интензивно обучение (0.33% захароза), подобрява слабото обучение при обучение, ние извършихме интензивното обучение, както е описано по-горе, но при липса на представяне на CS (AA). След това животните получиха слабо обучение на GNL и захароза (0.11%) 4 часа по-късно и бяха тествани за техния отговор към GNL 1 ден по-късно.

Измерване на възприятието по време на слабо обучение

Ефектът от миналото обучение върху възприятието на животното за слабо обучение беше тествано чрез извършване на жизненоважно обучение, последвано от слабо обучение 4 часа по-късно, както по-горе. По време на слабата CS + US презентация реакциите на хранене на животните бяха заснети на видео (33 кадъра/s) отдолу. Посоката на движение на радулата и подлежащата одонтофорна структура се измерва по време на първите 15 отговора на хранене, както в (16). Накратко, позицията на дорзалната мандибула първо беше маркирана в рамката, предшестваща първата рамка, в която радулата се виждаше по време на всяка захапка с помощта на софтуера ImageJ. След това радулата се проследява за цялата захапка и се изчислява разстоянието от първоначалната позиция на дорзалната долна челюст. След това се измерва средната разлика, преместена между кадрите. Отрицателният резултат следователно представлява радулата и дорзалната долна челюст, които са разделени в началото на захапката и радулата се движи към дорзалната долна челюст по време на захапката, докато положителният резултат представлява долната челюст и радулата, които са близо една до друга в началото на захапката. и радулата се отдалечава с напредването на ухапването. Критериите за определяне дали даден отговор е поглъщане или поглъщане се основават на това дали разликата в движението е отрицателна (поглъщане) или положителна (поглъщане). За да се измери как предишното жизненоважно обучение променя стабилността на възприемането на CS + US, използвани при слабо обучение, бяха анализирани двойки последователни ухапвания. Стабилна двойка ухапвания беше класифицирана като две еднакви последователни ухапвания (поглъщане-поглъщане или egest-egest). Превключващата двойка ухапвания беше класифицирана като две различни последователни ухапвания (поглъщане egest или egest-поглъщане).

След това вероятностите за преход бяха изчислени чрез преброяване на броя на превключващите ухапвания, изразени като част от общия брой двойки ухапвания. За да проверим дали предварителната експозиция на САЩ, използвана по време на интензивна тренировка ({{0}}.33% захароза), променя възприятието за слаба тренировка, ние проведохме интензивната тренировка, както е описано по-горе, но при липса на представяне на CS (AA) и измерено поведение при поглъщане/поглъщане, както по-горе. За да се тества дали предишното слабо обучение е променило възприемането на по-късно слабо обучение, животните първо са получили AA в комбинация с 0.11% захароза, а след това техните реакции на поглъщане/поглъщане към GNL и 0.11% захароза са били измерено 4 часа по-късно. За да се тестват ефектите от силното обучение върху отзивчивостта на животното към CS или US, използвани по време на слабо обучение, животните са получили интензивното обучение, както по-горе. Четири часа по-късно, животните се поставят в петриево блюдо с 90 ml вода без Cu2+- и се оставят да се аклиматизират за 10 минути. След това те получиха 5 ml вода и реакциите им при хранене бяха преброени. Впоследствие те получиха 5 ml или GNL, или 0,11% захароза, и отговорите на хранене бяха преброени, така че ∆ числото на ухапване да може да бъде изчислено както по-горе.

Препарати и електрофизиологични методи

Следвайки процедурите, описани по-рано в (16), ние проведохме in vitro експерименти, използвайки изолиран препарат от ЦНС. Малка област от предния хранопровод се поддържаше прикрепена към ЦНС чрез дорзалните букални нерви. Препаратите се перфузират с нормален физиологичен разтвор, съдържащ 50 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 2 mM MgCl2, 3,5 mM CaCl2 и 10 mM Hepes буфер във вода. Моносинаптичните връзки бяха тествани чрез къпане на препарата във високо двувалентен (HiDi) физиологичен разтвор, което повишава прага на потенциала за действие, намалявайки полисинаптичните връзки. Физиологичният разтвор HiDi се състои от 35.0 mM NaCl, 2 mM KCl, 8.0 mM MgCl2, 14.0 mM CaCl2 и 10 mM Hepes буфер във вода. Вътреклетъчните записи бяха направени с помощта на остри електроди (10 до 40 megohms), напълнени с 3 М KAc и 0.5 mM KCl. Сигналите бяха събрани с помощта на усилватели NL 102 (Digitimer Ltd.) и Axoclamp 2B (Axon Instrument, Molecular Device), а данните бяха получени с помощта на интерфейс micro 1401 Mk II и анализирани с помощта на софтуер Spike2 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK).

Идентификация на неврони

Мотоневронът B11 с превключване на фазите се намира в букалните ганглии и е идентифициран въз основа на неговото местоположение, форма на шипа, синаптични входове от PRN и способност да превключва своя модел на активност по време на цикли на поглъщане и поглъщане (16). Подобният на команда за поглъщане интерневрон CV1a се намира в церебралните ганглии и е идентифициран чрез неговите електрически свойства, характерно местоположение и способността му да управлява фиктивни цикли на хранене, когато е изкуствено деполяризиран до огнени шипове (31). Интерневронът PRN, подобен на командата на егестия, е разположен в букалните ганглии и е идентифициран чрез неговото местоположение и моносинаптична възбудителна връзка с B11. Невронът N2v е централен генератор на интерневрон, разположен на вентралната повърхност на букалните ганглии. Може да се идентифицира по характерното си плато по време на фазата на ретракция на цикъла, а изкуственото активиране причинява широко разпространена активност на фазата на ретракция в много букални неврони (25). B9 е мотоневрон във фаза на ретракция, разположен в букалните ганглии. CGCs са големи серотонинергични интерневрони, разположени в мозъчните ганглии, които могат да бъдат идентифицирани по техния размер, местоположение и тонизираща активност (30). За да идентифицираме преди това нехарактеризирани кандидат-членове на егестационната мрежа, ние запълнихме церебробукалната връзка (CBC) с флуоресцентното багрило, 5(6)-карбоксифлуоресцеин (5-CF). Известно е, че проекционните интерневрони са влиятелни при задвижването на моделирана активност в Lymnaea (30, 31), а неврони, управляващи егезията, са идентифицирани в букалните ганглии (16). Запълването на CBC разкри популация от букални проекционни интернейрони, които бихме могли да идентифицираме повторно в други препарати и да тестваме електрофизиологично. Невроните, представляващи интерес, бяха набодени и записани с неврони, подобни на команда за поглъщане и поглъщане.

Анализ и класификация на ин витро цикли

Активността върху B11 се измерва по отношение на началото на фазата на ретракция, както се определя от N2v платото или голямото възбуждане във фазата на ретракция интерневрон В9. За да се анализира относителната активност на B11 ​​в цикъл, тя се измерва 4 s преди и 4 s след началото на фазата на ретракция. Броят на пиковете B11 след началото на фазата на ретракция беше изваден от броя на пиковете B11 преди началото на фазата на ретракция и след това разделен на общия брой пикове в периода 8-s, за да се получи нормализиран резултат за разлика. Използвайки този резултат, положителната стойност представлява повече активност, настъпваща преди началото на фазата на прибиране и следователно се класифицира като цикъл на поглъщане. Отрицателният резултат представлява по-голяма активност, настъпваща след началото на фазата на ретракция и следователно се класифицира като цикъл на поглъщане. За да се сравнят ефектите от силното обучение върху фиктивните цикли на хранене in vitro, първите 10 спонтанни цикъла бяха анализирани от 19 наивни и 19 обучени препарати. За да се измери как тренировката променя стабилността на експресията на цикъла, бяха анализирани двойки последователни цикли. Стабилна двойка цикли беше класифицирана като два еднакви последователни цикъла (поглъщане-поглъщане или egest-egest).

Двойка цикъл на превключване беше класифицирана като два различни последователни цикъла (поглъщане-egest или egest поглъщане). След това вероятностите за преход бяха изчислени чрез преброяване на броя на циклите на превключване, изразени като част от общия брой двойки цикли. За да проверим дали жизненоважното обучение променя отзивчивостта на препарата към сигнали за апетит, ние стимулирахме главния хемосензорен път, MLN (28), който може да задвижи жизненоважно фиктивно хранене (29). MLN се стимулира с помощта на стъклен засмукващ електрод с бифазни импулси от 4 V с 0.5-ms продължителност при 1 Hz за 120 s. Броят на ∆ фиктивния цикъл на хранене се изчислява чрез записване на активността в захранващите мотоневрони, като B9, преброяване на броя на циклите, настъпили в периода 120-s преди MLN стимулация, и изваждане на това от броя на циклите в отговор на MLN стимулация. CGC активността се измерва за 120 s преди и 120 s по време на MLN стимулацията. За да се предизвика сензорно задвижвано изхвърляне in vitro, към хранопровода беше приложен 1- тактилен стимул, който активира механосензорни неврони, които сигнализират отблъскващи сигнали към хранителната мрежа в отговор на преразтягане на червата поради негоден за консумация предмет, поставен в хранопровода (16). Тактилният стимул се прилага с помощта на механична сонда, контролирана от логически импулс транзистор-транзистор от микро 1401 Mk II (CED).

Пълнене на неврони с йонофоретично багрило

Following procedures previously described in (16), we filled target neurons with a fluorescent dye (5-CF) using a microelectrode. This was achieved iontophoretically using a pulse generator to apply regular interval negative square current pulses into the neuron for >30 мин. След това препаратите се оставят за една нощ при 4 градуса. Изображенията на невроните бяха направени с помощта на цифрова камера (Andor Ixon електронно умножаващо зарядно свързано устройство), монтирана на стереомикроскоп Leica.

Приложение на D2 рецепторен блокер in vitro и in vivo

Sulpiride е ефективен допаминов антагонист в Lymnaea, блокирайки ефектите на допаминергичните интерневрони върху последващите неврони, както и фокусното приложение на допамин (16, 54). За да се тества ефекта на сулпирид (±) (Sigma-Aldrich) върху връзката PRN → PS1, препаратите първо се къпят в HiDi физиологичен разтвор (виж по-горе). Базовите амплитуди на EPSP бяха записани преди 10-4 М сулпирид в HiDi физиологичен разтвор да се перфузира във ваната за 10 минути и след това амплитудите на EPSP бяха записани отново. За да се тестват ефектите на сулпирид върху генерирането на in vitro цикъл в наивни препарати, първите 10 генерирани спонтанни цикъла бяха записани и след това 10-4 М сулпирид в нормален физиологичен разтвор беше перфузиран върху препарата. Първите 10 спонтанни цикъла, генерирани след 10 минути перфузия, бяха анализирани. За да се тестват ефектите на сулпирид върху възприемането на слабо обучение и придобиване/извикване на паметта, животните се инжектират със 100 ul от 10-3 М сулпирид в нормален физиологичен разтвор. По-рано беше показано, че инжектираната концентрация на лекарството се разрежда ~10-кратно от телесните течности на животното (55). Контролните животни се инжектират само със 100 ul нормален физиологичен разтвор. Животните бяха оставени за 2 часа, преди да бъдат извършени поведенчески тестове.

Анализ на данни

Данните бяха анализирани с помощта на палеонтологична статистика (PAST версия 4.1) (56) и изразени като графики за дъждовни облаци (57). Във всички случаи отделните точки се начертават като точки, а защрихованата област (облак) показва общата форма на разпределението, простираща се от минимални до максимални стойности. Вътрешните графики показват медиана (черна линия) интерквартилен диапазон (първи и трети квартил) и средна стойност (сива линия). Всяко "n" представлява отделно животно/препарат. Нормалността е тествана с помощта на теста на Shapiro-Wilk. Статистическите сравнения на две групи бяха извършени с помощта на двустранна t-тест статистика (сдвоена или несдвоена, както е посочено в текста) или тест на Mann-Whitney или Wilcoxon signed-rank тест за непараметрични данни. Данните с повече от две групи първо бяха анализирани с помощта на еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) или теста на Kruskal-Wallis. Последващите сравнения бяха извършени с помощта на post hoc тестовете на Tukey или Dunn с последователна корекция на Bonferroni. Сравненията между процента ухапвания/цикли, класифицирани като поглъщане или поглъщане, и броя животни/препарати, извършващи нула или повече от нула цикли на поглъщане, бяха направени с помощта на точен тест на Фишер. Нивото на значимост беше зададено на P < 0.05.

ЛИТЕРАТУРА И БЕЛЕЖКИ

1. F. Mery, TJ Kawecki, Цената на дългосрочната памет при Drosophila. Science 308, 1148 (2005).

2. П.-Й. Plaçais, T. Preat, За да благоприятства оцеляването при недостиг на храна, мозъкът забранява скъпата памет. Наука 339, 440–442 (2013).

3. AC Nobre, MG Stokes, Premembering опит: Йерархия от времеви скали за проактивно внимание. Neuron 104, 132–146 (2019).

4. ML Rosen, CE Stern, SW Michalka, KJ Devaney, DC Somers, Принос на когнитивната контролна мрежа към визуалното внимание, ръководено от паметта. Церебр. Cortex 26, 2059–2073 (2016).

5. MG Stokes, K. Atherton, EZ Patai, AC Nobre, Дългосрочната памет подготвя невронната активност за възприемане. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 109, E360–E367 (2011).

6. YL Chew, Y. Tanizawa, Y. Cho, B. Zhao, AJ Yu, EL Ardiel, I. Rabinowitch, J. Bai, CH Rankin, H. Lu, I. Beets, WR Schafer, Аферентна невропептидна система предава механосензорни сигнали, предизвикващи сенсибилизация и възбуда в C. elegans. Neuron 99, 1233–1246.e6 (2018).

7. J. Felsenberg, PF Jacob, T. Walker, O. Barnstedt, AJ Edmondson-Stait, MW Pleijzier, N. Otto, P. Schlegel, N. Sharifi, E. Perisse, CS Smith, JS Lauritzen, M. Costa , G. Jefferis, DD Bock, S. Waddell, Интегрирането на паралелни противоположни спомени е в основата на изчезването на паметта. Клетка 175, 709–722.e15 (2018).

8. J. Huang, Z. Zhang, W. Feng, Y. Zhao, A. Aldanondo, MG de Brito Sanchez, M. Paoli, A. Rolland, Z. Li, H. Nie, Y. Lin, S. Zhang , M. Giurfa, S. Su, Желанието за храна се медиира от преходно активиране на допаминергичното сигнализиране в мозъка на медоносната пчела. Science 376, 508–512 (2022).

9. PF Jacob, S. Waddell, Spaced training формира допълнителни дългосрочни спомени за противоположна валентност при Drosophila. Neuron 106, 977–991.e4 (2020).

10. S. Sayin, J.-F. De Backer, KP Siju, ME Wosniack, LP Lewis, L.-M. Frisch, B. Gansen, P. Schlegel, A. Edmondson-Stait, N. Sharifi, CB Fisher, SA Calle-Schuler, JS Lauritzen, DD Bock, M. Costa, GSXE Jefferis, J. Gjorgjieva, IC Grunwald Kadow, A невронната верига арбитрира между постоянството и отдръпването при гладната Drosophila. Neuron 104, 544–558.e6 (2019).

11. B. Senapati, C.-H. Tsao, Y.-A. Хуан, Т.-Х. Chiu, C.-L. Wu, S. Waddell, S. Lin, Неврален механизъм за изразяване на специфично състояние на депривация на съответните спомени в Drosophila. Нац. Neurosci. 22, 2029–2039 (2019).

12. K. Steck, SJ Walker, PM Itskov, C. Baltazar, JM Moreira, C. Ribeiro, Вътрешното аминокиселинно състояние модулира невроните на вкуса на дрождите, за да поддържа протеиновата хомеостаза в Drosophila. eLife 7, e31625 (2018)

For more information:1950477648nn@gmail.com